Summary
As mitocôndrias contêm várias enzimas dependentes de flavina que podem produzir espécies reativas de oxigênio (ROS). Liberação de sites individuais nas mitocôndrias monitoramento ROS é um desafio devido às reações colaterais indesejados. Apresentamos um método fácil e barato para avaliação direta do nativas taxas para liberação ROS usando flavoenzymes purificado e microplacas fluorometry.
Abstract
Tem sido relatado que a mitocôndria pode conter até 12 fontes enzimáticas de espécies reativas de oxigênio (ROS). A maioria desses sites incluem complexos respiratórios flavin-dependente e desidrogenases que produzem uma mistura de superóxido (O2● -) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Pode ser um desafio devido à presença de sistemas de defesa antioxidante e reações colaterais que também formam O2●-/ h2O2quantificação exata do potencial produção de ROS de sites individuais em mitocôndrias isoladas. Uso de inibidores inespecíficos que podem interromper a bioenergética mitocondrial também pode comprometer as medições alterando ROS lançamento de outros sites de produção. Aqui, apresentamos um método fácil para a medição simultânea de dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADH) produção e lançamento de H2O2 por desidrogenases purificadas flavin-lig. Para este efeito, utilizámos purificada piruvato desidrogenase complexo (PDHC) e α-cetoglutarato desidrogenase complexo (KGDHC) de origem suína coração como exemplos. Este método permite uma medida exata de taxas lançamento2 de2O de H de nativos por sites individuais de produção, eliminando outras fontes potenciais de sistemas ROS e antioxidante. Além disso, este método permite uma comparação direta da relação entre a versão de2 H2O e atividade enzimática e o rastreio da eficácia e seletividade de inibidores para a produção de ROS. Em geral, esta abordagem pode permitir a avaliação aprofundada das taxas nativas de introdução ROS em enzimas individuais antes de conduzir experiências mais sofisticadas com mitocôndrias isoladas ou permeabilized fibra muscular.
Introduction
O objetivo final do metabolismo de nutrientes é tornar trifosfato de adenosina (ATP). Em células de mamíferos, isso ocorre nas mitocôndrias, organelas double-membraned que convertem a energia armazenada em carbono em ATP. A produção de ATP começa quando o carbono é queimado pela mitocôndria formando duas transportadoras de elétrons, NADH e dinucleótido de flavina e adenina (DANIII2)1. NADH e DANIII2 são então oxidados por complexos respiratórios multi subunidade I e II, respectivamente, e os elétrons libertados são levados até o terminal do elétron aceitador oxigênio molecular (O2) no complexo IV1. A termodinamicamente favorável "ladeira abaixo" transferência de elétrons para O2 no final da cadeia é acoplada à exportação de prótons para o intermembrane espaço pelos complexos I, III e IV. Isso cria um gradiente eletroquímico transmembrana de prótons (força motriz protónica), uma forma temporária de energia livre de Gibbs que é aproveitada pelo complexo V tornar ATP2. Reações de transferência de elétrons nas mitocôndrias não são perfeitamente acopladas a produção de ATP. Em vários pontos do ciclo de Krebs e a cadeia respiratória, elétrons prematuramente podem interagir com O2 para formar ROS3. ROS mais biologicamente relevante gerado por mitocôndrias são O2● - e H2O2. Embora O2● - é muitas vezes considerado o ROS proximal formado por mitocôndrias, agora é evidente que sites de produção formam uma mistura de O2● - e H2O2, que é associado com o livre química radical de flavin prótese grupos4,5. Em níveis elevados, ROS pode ser perigoso, danificando componentes biológicos necessários para a função celular, resultando em angústia oxidativo6. No entanto, em quantidades reduzidas, ROS mitocondriais cumprir funções de sinalização vitais. Por exemplo, lançamento de H2O2 de mitocôndrias tem sido implicado no controle da ativação de células T, sinalização de stress (por exemplo, indução de vias de sinalização Nrf2), a indução da proliferação celular e diferenciação, sinalização da insulina e liberação e alimentação comportamento7. Progresso considerável tem sido feito na compreensão da função de sinalização de ROS. No entanto, importantes questões ainda permanecem em relação à qual enzimas nas mitocôndrias servem como as fontes mais importantes e como a produção é controlada.
Lançamento ROS por um site de produção depende de vários fatores: 1) a concentração da doação de elétrons do site, 2) o estado redox do site doar elétrons, 3) acesso ao oxigênio e 4) a concentração e tipo de substrato de oxidação3, 8 , 9. nas mitocôndrias, outros fatores como a concentração de NADH e membrana potencial força também influenciam a produção de ROS8,10. Por exemplo, a taxa de O2●-/ h2O2 produção purificada PDHC ou KGDHC aumenta com NADH crescente disponibilidade de5,11. Nesse cenário, os elétrons estão fluindo para trás do NADH ao centro FAD na subunidade3 E PDHC ou KGDHC, o site para O2●-/ h2O2 produção12. Da mesma forma, a prestação de NAD+ tem o efeito contrário, diminuindo a liberação ROS de KGDHC12. Assim, controlando a entrada e a saída de elétrons a partir de sites de produção de ROS pode alterar quanto2●/h2O2 é formado. Por exemplo, bloqueando a subunidade2 E PDHC ou KGDHC com CPI-613, um ácido lipoico analógico, o que resulta em uma quase 90% diminuição2●/h2O2 produção13. Resultados semelhantes podem ser obtidos com o químico S-glutathionylation catalisadores, diamido e dissulfiram, que quase abolir O2●-/ h2O2 produção pelo PDHC ou KGDHC através da conjugação de glutationa para o E 2 subunidade14. O trade-off para bloquear o fluxo de elétrons através da subunidade2 E PDHC e KGDHC é uma diminuição na produção de NADH, que diminui a formação de ROS por cadeia de transporte de elétrons (por exemplo, complexo III). Isto também pode diminuir a produção de ATP pela cadeia de transporte de elétrons. Em geral, bloqueando a entrada do elétron aos locais de produção de ROS pode ser um meio altamente eficaz de controlar O2●-/ h2O2 produção.
As mitocôndrias podem conter até 12 potencial O2●-/ h2O2 fontes6. A maioria destes sites são flavin-contendo enzimas que geram uma mistura de O2● - e H2O2. Utilização de substrato diferente e combinações do inibidor permitiram a identificação dos quais complexos respiratórios e desidrogenases mitocondriais servem como O de alta capacidade2●-/ h2O2 formando sites em diferentes tecidos3. PDHC e KGDHC foram mostrados para servir como alta capacidade2●/h2O2 sites emitindo no músculo e fígado mitocôndrias13,15. No entanto, algumas dificuldades permanecem no que se refere a análise do2●/h2O2 formando potenciais de sites individuais em mitocôndrias e o impacto que combinações de inibidor e substrato diferente em a atividade das enzimas. Isto é devido à presença de reações colaterais indesejáveis (por exemplo, formação de2●/h2O2 por sites que não sejam a enzima de interesse), contaminando nutrientes endógenos (por exemplo,graxos ácidos) ou organelas (por exemplo,, peroxissomos que também formam O2●-/ h2O2) e uso de inibidores que a falta de seletividade, e/ou uso de compostos que não inibir totalmente a produção de ROS. Certos inibidores podem também alterar a bioenergética mitocondrial e a direção do fluxo de elétrons, e isto altera a liberação ROS de outros sites de produção e confunde os resultados. Preços absolutos para O2●/h2O2 liberação de sites individuais nas mitocôndrias também são difíceis de quantificar devido à alta concentração de O2● - e H2O2 eliminando as enzimas no espaço matriz e intermembrane. Portanto, a eliminação de reações concorrentes que possam interferir com O2●-/ h2O2 lançamento medições pode ser útil quando identificando O de alta capacidade2●-/ h2O2 formando sites.
Aqui, apresentamos um método simples que permite a análise simultânea de O2●-/ h2O2 produção e formação de NADH por purificada desidrogenases dependentes de flavin. Usando enzimas purificadas, indesejados ROS formando reações colaterais e ROS enzimas degradantes podem ser eliminadas permitindo uma medida mais precisa do nativo O2●-/ h2O2 taxas de produção para flavoenzymes individual. Esse método pode ser usado para comparar diretamente os2●/h2O2 formando a capacidade de diferentes desidrogenases purificadas ou aos potenciais inibidores específicos do site de tela para O2●-/ h2O versão 2 . Finalmente, medir2●/h2O2 e a produção de NADH simultaneamente pode permitir uma avaliação em tempo real da relação entre a atividade enzimática e a capacidade de liberação ROS.
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Protocol
1. produtos químicos e enzimas purificadas
- Adquirir os seguintes materiais: PDHC e KGDHC de origem porcina coração (ou outra flavoenzyme mitocondrial purificada); H2O2 (solução a 30%), piruvato, α-cetoglutarato, NAD+, NADH, CoASH, pirofosfato de tiamina (TPP), sacarose manitol, HEPES, EGTA, Ácido valérico de 3-metil-2-oxo (KMV), superóxido dismutase (SOD), peroxidase de rábano (HRP), 10-acetil-3,7-dihydroxyphenoxazine reagente (AUR) e CPI-613.
2. planejamento do ensaio e preparação dos reagentes
- Configure o ensaio de acordo com a tabela 1 em uma placa de 96 poços.
Nota: O volume total para cada reação é 200 µ l. concentrações de estoque são ajustadas de tal que 20 µ l de reagente é adicionado a cada poço. Isso garante a rápida adição de cofactores e substratos para cada reação bem antes de começar o ensaio. - Prepare a solução tampão de reação com manitol 220mm, sacarose de 70 mM, 1 mM EGTA e 20 mM HEPES (pH 7,4 com HCl).
Nota: Isto pode mudar dependendo das propriedades físicas de diferentes enzimas purificadas. - Examine o KGDHC ou o PDHC purificada por contaminação usando a enzima atividade ensaios14,16,17 ou por immunoblot ou Coomassie mancha5.
- Prepare todos os reagentes no buffer de reação conforme as concentrações de solução de trabalho na tabela 1.
- Armazenar todos os reagentes como alíquotas de 1ml a-20 ° C. Loja de piruvato e α-cetoglutarato a-80 ° C, em alíquotas de 100 µ l para prevenir a degradação espontânea devido à auto-oxidação e congelamento-descongelamento repetidos.
- Preparar o reagente AUR estoque mestre em 1 mL de DMSO e então diluir a 100 µM em tampão de reação. Armazenar protegido da luz.
Nota: Aqui, a solução de trabalho de 100 µM é feito fresco a cada 2 a 3 semanas e protegido da luz.
3. configurar o modelo de ensaio
- Configure o procedimento de ensaio em um leitor de microplacas monocromática com capacidades de medição dual.
- Defina o processo de leitura, selecionando "Protocolo". Clique em "Procedimento".
- Defina "Temperatura" a 25 ° C (figura 1A).
- Clique em "Iniciar cinético" para definir as condições de leitura (figura 1A). Defina a hora e o número de intervalos de leitura/experiências.
- Clique em "ler" (figura 1B).
Nota: As amostras são lidos da posição superior com um ganho de 50. Tempo: 5 min, ler em intervalos de 30-s. Canal 1: Fluorescência Resorufin - excitação/emissão = 565 nm nm:600, largura do comprimento de onda de 13.5 nm. Canal 2: NADH autofluorescência - excitação/emissão = 376 nm nm:450, largura do comprimento de onda de 20 nm. - Em "Leitura", selecione poços para monitor (por exemplo, A1-A4 e B1-B4).
- Selecione "END cinética".
4. padrão curvas
- Descongelar os reagentes e armazenar no gelo até ser necessário.
-
Curva padrão de NADH (Figura 2A)
- Prepare as soluções de trabalho para NADH na faixa de concentração de 0,5-10 mM de tampão de reação.
- Adicione 20 alíquotas µ l de cada NADH trabalhando a concentração da solução de poços que contém 180 µ l tampão de reação. A concentração final de NADH em cada bem é 0,05-1 mM.
- Clique em "Ler" e defina a excitação/emissão = 376 nm nm:450, largura do comprimento de onda de 20 nm.
Nota: Este é um ponto de extremidade somente leitura - parâmetros cinéticos não são necessários.
-
Curva padrão AUR (Figura 2B)
- Preparar as ações de trabalho de peróxido de hidrogênio no amortecedor da reação; intervalo de concentrações estoque de 4.000-200 nM.
- Adicione 120 µ l de buffer de reação a cada poço.
- Adicionar 20 µ l de HRP (trabalhando a concentração das ações = 30 U/mL, concentração final no poço = 3 U/mL), 20 µ l de SOD (trabalhando a concentração das ações = 250 U/mL, concentração final no poço = 25 U/mL) e 20 µ l de AUR (trabalhando a concentração das ações = 100 µM concentração final no poço = 10 µM) para cada bem com tampão de reação.
- Adicione 20 µ l de cada H2O2 solução estoque a cada bem contendo reagentes buffer e ensaio de trabalho. O volume final da reação é de 200 µ l e a concentração final de H2O2 em cada poço é 20-400 nM.
- Incubar as placas por 1 min no leitor a 25 ° C.
- Clique em "Ler" e defina a excitação/emissão = 565 nm/600 nm, largura do comprimento de onda de 13.5 nm. Note que este é um ponto de extremidade somente leitura - parâmetros cinéticos não são necessários.
5. medir O●- / h2 O2 versão2e a produção de NADH por KGDHC e PDHC
- Ver tabela 1 para a ordem de adição dos reagentes diferentes, a concentração de cada solução de trabalho e o volume adicionado a cada poço.
- Adicione 40 µ l de tampão de reação a cada poço. Para os ensaios usando KMV ou CPI-613, adicione 20 µ l de buffer para cada poço.
- Adicionar 20 µ l do PDHC ou KGDHC (estoque de trabalho de 1 U/mL, concentração final por alvéolo = 0.1 U/mL) a cada poço.
- Incube o PDHC e KGDHC a 25 ° C por 2 min.
- Adicionar 20 µ l de KMV (estoque de trabalho = 100 mM, concentração final = 10 mM) ou 20 µ l de CPI-613 (trabalhando a concentração das ações = 1,5 mM, concentração final = 150 µM) (tabela 2).
Nota: Este passo pode ser excluído se inibidores não estão sendo usados para os ensaios. - Incubar durante 1 min a 25 ° C.
Nota: Este passo pode ser excluído se inibidores não estão sendo usados para os ensaios. - Adicionar 20 µ l de HRP (trabalhando a concentração das ações = 30 unidades/mL, concentração final no poço = 3 unidades/mL) e 20 µ l de SOD (trabalhando a concentração das ações = 250 unidades/mL, concentração final no poço = 25 unidades/mL) a cada poço.
- Adicionar 20 µ l de coenzima A (trabalhando a concentração das ações = 1 mM, concentração final = 0,1 mM), 20 µ l de TPP (trabalhando a concentração das ações = 3mm, concentração final = 0,3 mM) e 20 µ l de NAD+ (trabalhando a concentração das ações = 10mm, concentração final = 1 mM) para cada w Ell.
- Remover o reagente AUR do revestimento protetor de papel alumínio e adicionar 20 µ l de cada poço.
- Adicionar 20 µ l de piruvato (trabalhando a concentração das ações, que varia de 1-100 mM, a concentração final para os ensaios = 0,1-10 mM) para poços contendo PDHC e α-cetoglutarato (trabalhando a concentração das ações, que varia de 1-100 mM, a concentração final para os ensaios = 0,1-10 mM) para poços contendo KGDHC.
- Clique em "Ler" para iniciar a medição cinética.
6. análise de dados
- Mantenha pressionado o botão "CTRL" no teclado e clique em poços para gerar um gráfico que contém todas as medições cinéticas correspondente para o canal 1 (Figura 3A).
- Clique em "dados" no ícone de exibição no canto superior direito para valores brutos para unidades de fluorescência relativo (RFU) medidas nos pontos de tempo diferentes (Figura 3B).
- Exporte os valores para análise (tabela 3).
- Clique em "Graph" menu drop-down no canto superior direito (Figura 3B) para acessar valores RFU associados com o canal 2 de fluorescência.
- Repita as etapas de 6.1 a 6.3 para canal 2.
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Representative Results
Figura 3A fornece um traço representativo para a RFU recolhida durante a medição simultânea de H2O2 e a produção de NADH por KGDHC purificado. Os dados brutos da RFU para cada intervalo de tempo são representados na Figura 3B. Os dados brutos da RFU são então exportados para análise. Por extrapolando curvas padrão apresentadas na Figura 2, pode ser determinada a quantidade absoluta de NADH e H2O2 formado a cada intervalo de medição ao longo do período de 5 min. Um exemplo deste cálculo é fornecido na tabela 3. Uma vez que a quantidade de NADH e H2O2 formado por KGDHC ou PDHC nos diferentes intervalos tiver sido determinado, valores são copiados e inseridos em um software de gráficos e estatística para posterior análise. Usando a análise do tipo de gráfico XY, a quantidade de NADH (µmol) e H2O2 (pmol) formada por KGDHC ou PDHC pode ser plotada como uma função do tempo (Figura 4A). Usando esses valores, também pode ser calculada a taxa de NADH e H2O2 formação durante a oxidação do substrato. Como mostrado na Figura 4B, KGDHC e PDHC exibem características diferentes em termos de NADH e H2O2 formando capacidade.
Uma vez estabeleceu que KGDHC e PDHC são enzimaticamente ativo e NADH e H2O2 formação pode ser rastreada simultaneamente, ROS liberar Propriedades e actividades enzimáticas podem ser medidas. Nós escolhemos comparar KGDHC e PDHC já que eles são altamente homólogos em estrutura básica e têm sido documentados para ser sites de alta capacidade para a produção de ROS5. Figura 5 e Figura 6 demonstram a dependência de NADH e H2O2 produção na concentração de substrato. PDHC facilmente está saturado por pequenas quantidades de substrato com a taxa de NADH e H2O2 produção atingindo seu máximo em 0.1-0.5 piruvato mM. KGDHC, por outro lado, exibe aumentos incrementais em NADH e H2O2 produção com o aumento de α-cetoglutarato (Figura 5). Isto demonstra que, KGDHC e PDHC, embora altamente homólogos em estrutura básica, possuem propriedades cinéticas diferentes em termos de quanto substrato é necessária para induzir liberação máxima de ROS. Figura 5 também demonstra que o lançamento de H2O2 de KGDHC se correlaciona fortemente com disponibilidade de produção e substrato de NADH. PDHC do outro não tem as mesmas características cinéticas. KGDHC e PDHC também diferem em termos de NADH e O2●-/ h2O2 formando capacidade quando a concentração de NAD+ é variada (Figura 6).
Aproveitando a medição simultânea de NADH e H2O2, potenciais inibidores específicos do site para a produção de ROS podem ser rastreados. Isto pode ajudar a determinar a quantidade de inibidor que é necessária para induzir a máxima inibição da liberação de2 H2O. Além disso, medindo a produção de NADH ao mesmo tempo, o site para a ação do inibidor, bem como a fonte de ROS pode ser identificado. Estudos anteriores mostraram que o analógico de α-cetoglutarato, KMV, é altamente eficaz na inibição da liberação ROS de KGDHC (inibição de ≥ 90%)13,15. Também mostramos que CPI-613, um ácido lipoico analógico que bloqueia dihidrolipoil de subunidade2 da PDHC e KGDHC, E também pode inibir a liberação ROS de qualquer complexo por ~ 90%13,14. Local de ação para KMV e CPI-613 são mostrados na Figura 7. CPI-613 é um enxofre contendo a molécula e, portanto, aconselha-se que agentes redutores de thiol-ricos (ditiotreitol; DTT) ou proteínas (albumina) são omitidas do procedimento13. A Figura 7 demonstra que tanto KMV e CPI-613 estavam ambos altamente eficaz em limitar tanto NADH e H2O2 por KGDHC. Da mesma forma, a CPI-613 completamente abolido H2O2 libertado PDHC (Figura 7). Coletivamente, estes resultados demonstram que KMV e CPI-613 são inibidores altamente eficazes para lançamento de H2O2 e, portanto, podem ser aplicado para experimentos com mitocôndrias isoladas. Uma tela tão seria altamente benéfica para outras potenciais enzimas formadoras de ROS, uma vez que permite uma avaliação direta da eficácia e seletividade de diferentes inibidores na purificada contendo flavin desidrogenases. A medição simultânea de NADH também tem o benefício adicional de permitir a identificação preliminar da fonte potencial de ROS dentro uma enzima complexa. Figura 7 fornece uma descrição do mecanismo catalítico para KGDHC, que é altamente homólogo para PDHC. A observação que KMV e CPI-613, que bloqueiam a E1 e subunidade de2 E de KGDHC, quase completamente abolida tanto H2O2 e a produção de NADH, confirma que a subunidade de3 E, provavelmente, a moda, é a fonte ROS 18. CPI-613 exerceu um efeito semelhante em PDHC confirmando que o site de princípio para a liberação de2 H2O é a subunidade de3 E18. Uma abordagem semelhante pode ser usada para outras desidrogenases. Isso exigiria a identificação de inibidores que bloqueiam o fluxo de elétrons através de diferentes partes de um complexo enzimático.
Figura 1 : Capturas de tela representativa para a configuração do ensaio. (A) representação de procedimento instituído para a medição de cinética de alterações na fluorescência do NADH e resorufin. (B) configurar os parâmetros de fluorescência para o ensaio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Representante curvas padrão para fluorescência NADH e resorufin. As curvas são utilizadas para estimar a taxa de NADH e O2●-/ h2O2 produção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Traços representativos para os dados brutos da RFU coletados durante o ensaio. (A) curvas para cada poço que foi lido durante o ensaio. Curvas de vista placa são geradas segurando a tecla CTRL e clicando em cada poço que está sendo lido. (B) para exportação de dados, dados são clicados sob vista para gerar uma tabela contendo os valores RFU representativos. Então clica no botão de exportação de planilha para exportar os resultados brutos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Direto de comparação do H2 O 2 e formação de NADH de taxas de KGDHC e PDHC. (A) medição simultânea de H2O2 e o NADH formando potenciais de KGDHC e PDHC. (B) Cálculo da taxa de H2O2 e formação de NADH pelo KGDHC e PDHC. Comparação direta da produção de NADH e ROS por ambas as enzimas contendo flavin demonstra que KGDHC produz mais H2O2 que está relacionada à sua maior capacidade enzimática. n = 4, média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Medição simultânea de H 2 O 2 e NADH formando taxas por KGDHC e PDHC oxidantes concentrações de substrato diferente. Alterações na fluorescência foram medidas conforme descrito anteriormente, exceto que a concentração de substrato final foi variou de 0 mM a 10 mM. Esta abordagem foi utilizada para verificar a dependência da versão de H2O2 nas propriedades cinéticas de KGDHC e PDHC. n = 4, média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : KGDHC e PDHC também exibem diferentes H2 O 2 e NADH formando Propriedades quando NAD + níveis são alterados. Alterações na fluorescência foram medidas conforme descrito anteriormente, exceto a concentração final de NAD+ foi variou de 0 mM a 1 mM. Esta abordagem foi utilizada para verificar a dependência da versão de H2O2 nas propriedades cinéticas de KGDHC e PDHC. n = 4, média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Triagem de diferentes inibidores específicos do site para NADH e H2 O 2 produção. (A) diagrama representando o ciclo catalítico para KGDHC e os locais de ação para KMV e CPI-613. Observe que o PDHC tem um ciclo catalítico homólogo, exceto que KMV não compete para o sítio de ligação do piruvato. E1: piruvato ou α-cetoglutarato desidrogenase, E2: dihidrolipoil aciltransferase, E3: dihidrolipoil desidrogenase. (B) efeito da KMV e CPI-613 na NADH e H2O2 produção por KGDHC e PDHC. As amostras foram pré-incubada em KMV (10 mM) ou CPI-613 (150 µM) e então analisada por NADH e H2O2 produção. n = 4, média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Concentração das ações de trabalho | Volume adicionado ao bem | Concentração final no poço |
| KGDHC ou PDHC | 1 unidade/mL | 20 Μ l | 0,1 unidades/mL |
| Superóxido dismutase | unidades de 250 mL | 20 Μ l | 25 unidades/mL |
| Peroxidase de rábano | 30 unidades/mL | 20 Μ l | 3 unidades/mL |
| Pirofosfato de tiamina | 3 mM | 20 Μ l | 0,3 mM |
| Coenzima A | 1 mM | 20 Μ l | 0,1 mM |
| NAD+ | 10 mM | 20 Μ l | 1 mM |
| 10-acetil-3,7-dihydroxyphenoxazine | 100 ΜM | 20 Μ l | 10 ΜM |
| Substrato | 1-100mm | 20 Μ l | 0.1-10 mM |
Tabela 1: Exemplo de um protocolo básico definido para a medição de O 2 ●– /H 2 O 2 e produção de NADH por purificada PDH ou KGDH. Desde que 20 µ l de cada reagente é adicionado a cada poço e a final volume/reação é 200 µ l, a concentração final de cada reagente é 10-fold menos do que a concentração de ações (por exemplo, a concentração final de NAD+ a mistura de reação é de 1 mM ). Observe que os reagentes devem ser adicionados ao poço na ordem apresentada na tabela.
| Inibidor da | Alvo |
| Ácido valérico de 3-metil-2-oxo | Subunidade E1 KGDHC |
| CPI-613 | Subunidade E2 oxo ácido desidrogenases |
Tabela 2: lista de inibidores e suas metas. Sites de ação também são representados na Figura 8.
| Autofluorescência de NADH | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tempo | T ° 376.450 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:04 | 24,4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0:00:34 | 24,4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0:01:04 | 24,4 | 52° | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0:01:34 | 24,4 | 146 | 142 | 129. | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0:02:04 | 24,4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0:02:34 | 24,4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0:03:04 | 24,4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0:03:34 | 24,4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0:04:04 | 24,4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 52° | 119 | 131 |
| 0:04:34 | 24,4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 52° | 132 |
| 0:05:04 | 24,4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| Resorufin de fluorescência | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tempo | T ° 565.600 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:00 | 24,4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0:00:30 | 24,4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 52° | 112 |
| 0:01:00 | 24,4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 51° | 122 | 120 |
| 0:01:30 | 24,4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0:02:00 | 24,4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0:02:30 | 24,4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129. | 147 | 130 |
| 0:03:00 | 24,4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0:03:30 | 24,4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0:04:00 | 24,4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0:04:30 | 24,4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0:05:00 | 24,4 | 251. | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
Tabela 3: modo de exibição de planilha dos resultados recolhidos do conjunto de experimentos. Valores RFU brutos gerados no experimento são exportados para uma planilha para análise adicional. Usando curvas padrão geradas antes da experimentação, pode ser calculada a taxa de produção de2 NADH e H2O na planilha.
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Discussion
Este protocolo é vantajoso desde, 1) elimina quaisquer reacções concorrentes que caso contrário podem interferir com o H2O2 detecção (por exemplo, sistemas antioxidantes ou outras fontes de ROS), 2) fornece uma avaliação directa da taxa nativa de ROS de lançamento por uma desidrogenase mitocondrial contendo flavin, 3) permite a comparação do nativo ROS liberar a taxas de dois ou mais purificado desidrogenases flavin-baseado, 4) pode permitir a uma comparação direta da taxa de atividade de lançamento e enzima ROS e 5) permite a seleção de inibidores competitivos seletivos para lançamento ROS. Nosso grupo e outros usaram este método em publicações anteriores para examinar o Regulamento de ROS por alostéricos e redox sinalização mecanismos antes da realização de experimentos com mitocôndrias ou músculo permeabilized14,16, 17,19,20.
Modificações e solução de problemas:
Este procedimento usa equipamento básico disponível em quase todas as instituições. A abordagem também é baixo custo e utiliza produtos químicos comuns disponíveis através de vários fornecedores. A composição do tampão pode variar de acordo com propriedades de enzima - embora, nós encontramos que um buffer de reação básica consiste em sacarose, HEPES, manitol e EGTA funciona bem na maioria das aplicações. Valores brutos para resorufin fluorescência são tipicamente ao redor 50-500 RFU para uma ROS liberando a enzima diluída a 0,1 U/mL. Valores mais altos da RFU podem indicar que o reagente AUR tem sido auto-oxidado devido à exposição à luz ou congelamento-descongelamento repetidos. Portanto, soluções de trabalho AUR devem ser substituídas rotineiramente a cada 2 a 3 semanas (dependendo da frequência de uso). Impurezas da preparação enzimática ou desnaturação podem levar a menor do que o normais leituras ROS e NADH. Pureza da enzima deve ser monitorada rotineiramente por electroforese em gel. Propriedades cinéticas (Km e Vmax para substrato e NAD+) também devem ser avaliados imediatamente após a compra ou a purificação de uma enzima e então rotineiramente monitorados depois disso. A maioria dos reagentes utilizados no ensaio é estável e pode ser sujeitos a vários ciclos de congelamento e descongelamento. Piruvato e α-cetoglutarato devem ser armazenados em alíquotas de 100 µ l a-80 ° C para evitar a auto-oxidação. Evite o uso de agentes redutores como TDT desde forma2●/h2O2 diretamente pela formação radical em PDHC e KGDHC (e potencialmente outros flavoenzymes)17. Os ensaios podem ser conduzidos a 37 ° C; no entanto, nosso grupo descobriu que estas experiências a 25 ° C é ideal para o fornecimento de dados mais consistentes.
Limitações da técnica:
Um obstáculo importante associado com esta técnica é acesso das enzimas mitocondriais flavin-contendo purificada. Aqui, usamos comercialmente disponível KGDHC e PDHC para demonstrar que esta técnica pode ser usada para comparar diretamente a atividade ROS de capacidade e enzima de lançamento de desidrogenases mitocondriais contendo flavin. No entanto, maioria dos ROS produzindo enzimas contendo flavin não estão disponíveis comercialmente e deve ser purificados em laboratório. Isto pode ser um desafio considerando algumas destas enzimas são membrana acoplado ou absorver a membrana mitocondrial interna. Novos protocolos para a purificação de sucesso de membrana-limite flavin-contendo enzimas que produzem ROS estão agora disponíveis. Isto inclui métodos de purificação para o complexo I, complexo II e sn-glicerol-3-fosfato desidrogenase21,22,23. Portanto, mesmo que a maioria dos geradores de ROS listados pode não ser comercialmente disponível, os protocolos existem para isolamento e purificação. A relevância fisiológica dos resultados coletados usando enzimas purificadas flavin-baseado também é uma limitação. Portanto, resultados coletados com enzimas purificadas devem ser seguidos com ensaios usando mitocôndrias isoladas ou tecido permeabilized. Cinco estudos separados usado essa abordagem para investigar mecanismos de regulação da liberação ROS por KGDHC e PDHC14,16,17,19,20. Preliminar de resultados para o papel de switches redox no controle da liberação ROS inicialmente foram testados usando purificado KGDHC e PDHC, e então mecanismos de regulamentação mais foram analisados no fígado e mitocôndrias cardíacas e fibra muscular14, 16,17,20.
Importância no que diz respeito a métodos existentes:
ROS de medição liberação de sites individuais de produção na mitocôndria pode ser desafiador devido à presença de concorrentes reações colaterais que também produzem O2●/h2O2 e antioxidante sistemas que caso contrário pode levar a a subestimação das taxas nativas. O potencial de membrana pode também alterar taxas de liberação ROS de vários sites e o uso de inibidores pode alterar o fluxo de elétrons, confundindo O2●-/ h2O2 formação medições. O método apresentado aqui permite a avaliação direta da capacidade de lançamento de ROS de enzimas individuais enquanto simultaneamente avaliar a relação entre taxas nativas de O2●/h2O2 e enzima de actividade. Este método de baixo custo pode servir como uma ferramenta para comparar as taxas de liberação ROS nativas para individuais flavin-contendo enzimas mitocondriais antes da realização de experiências mais sofisticadas com mitocôndrias, as células ou tecidos. Além disso, o método aqui apresentado pode ser utilizado para pré-selecionar a eficácia e seletividade de inibidores para a liberação ROS antes da realização de ensaios com mitocôndrias isoladas.
Aplicações futuras:
O método apresentado neste documento tem sido utilizado em cinco estudos independentes, vistos investigar o controle sobre a liberação ROS do PDHC e KGDHC14,16,17,19,20. Nestes estudos, os inibidores foram projectados ROS e libertam taxas de NADH produzindo foram avaliadas usando enzimas purificadas. Resultados coletados com as enzimas purificadas foram verificados usando mitocôndrias isoladas e permeabilizado fibras musculares14,16,17,20. Portanto, esse método pode ser aplicado a um número de estudos futuros vista estudar nativo ROS taxas de liberação de mitocôndrias, as células e fibras musculares.
Passos críticos no protocolo:
Pureza da enzima e suas propriedades cinéticas devem ser monitoradas rotineiramente. O AUR trabalhando reagente de estoque também deve ser substituído com frequência. Isto irá garantir resultados coletados são consistentes. A ordem de adição dos reagentes é vital para a execução de uma experiência bem sucedida (tabela 1). Inibidores de deverá ser titulados para determinar a concentração necessária para obter a máxima inibição da liberação ROS. Neste estudo, optamos por 10mm KMV e 150 µM CPI-613, desde que previamente havia determinado que essas concentrações induzem a máxima inibição da liberação ROS por KGDHC e PDHC13.
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Disclosures
Não há nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelas ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC). Produção de vídeo foi realizada em colaboração com o centro de inovação no ensino e aprendizagem (DIOC) na Memorial University of Newfoundland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
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