Os ratos representam um modelo inestimável na vivo para estudar a infecção e doenças causadas por microorganismos gastrointestinais. Aqui, descrevemos os métodos utilizados para estudar a colonização bacteriana e alterações histopatológicas em modelos do rato do Helicobacter pylori-doenças relacionadas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Modelos de mouse da infecção por Helicobacter e patologias gástricas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Helicobacter pylori é um patógeno gástrico que está presente em metade da população mundial e é uma importante causa de morbidade e mortalidade em seres humanos. Vários modelos de rato da infecção gástrica por Helicobacter foram desenvolvidos para estudar os mecanismos moleculares e celulares, segundo o qual a bactéria H. pylori coloniza o estômago de hospedeiros humanos e causar doença. Aqui, descrevemos os protocolos: 1) preparar suspensões bacterianas para a infecção na vivo de ratos através de gavagem intragástrico; 2) determinar os níveis de colonização bacteriana nos tecidos gástricos de rato, por reação em cadeia da polimerase (PCR) e a contagem viável; e 3) avaliar as alterações patológicas, pela histologia. Para estabelecer Helicobacter infecção em ratos, os animais (SPF) isentos de agentes patogénicos específicos primeiro são inoculados com suspensões (contendo ≥ 105 unidades formadoras de colônia, CFUs) de cepas de rato-colonização de qualquer Helicobacter pylori ou outros gástrica spp. Helicobacter de animais, tais como felis Helicobacter. A pós-infecção pontos de tempo apropriado, estômagos são extirpados e dissecados essas em dois fragmentos de tecido igual, cada um compreendendo as regiões de antro e corpo. Dentre estes fragmentos é usado para contagem viável ou extração de DNA, enquanto o outro é submetido a processamento histológico. Colonização bacteriana e alterações histopatológicas no estômago poderão ser avaliadas rotineiramente em seções do tecido gástrico manchadas de Warthin-Starry, Giemsa ou hematoxilina e eosina (H & E) manchas, conforme apropriado. Análises imunológicas adicionais também podem ser efectuadas por imuno-histoquímica ou imunofluorescência em secções de tecido gástrico de rato. Os protocolos descritos abaixo são projetados especificamente para permitir a avaliação em ratos de patologias gástricas, parecidos com os de humanos relacionados com H. pylori doenças, incluindo inflamação, atrofia da glândula e formação de folículos linfoides. A preparação do inóculo e protocolos de gavage intragástrico também podem ser adaptados para estudar a patogênese de outros patógenos humanos entéricos que colonizam a ratos, tais como Salmonella Typhimurium ou Citrobacter rodentium.
Introdução
Helicobacter pylori é um patógeno gástrico em forma de espiral, Gram-negativo, humano presente em todas as populações em todo o mundo, com taxas de infecção nos países em desenvolvimento, estima-se que na ordem de 80%1. Embora a maioria dos H. pylori-indivíduos infectados são assintomáticos, alguns desenvolvem doenças mais graves, variando de ulceração péptica a câncer gástrico2. H. pylori-cancros associados amplamente são caracterizadas por alterações malignas nas células epiteliais (GECs) ou pela formação de tecidos linfoides extra nodais no estômago, resultando em adenocarcinoma gástrico ou mucosa associada linfoide linfoma do tecido (MALT), respectivamente. H. pylori é altamente adaptado para sobreviver no nicho ecológico duro do estômago devido à presença de vários fatores de virulência e mecanismos para facilitar a sua aderência, o crescimento e o metabolismo nesse nicho. Em particular, cepas virulentas de H. pylori possuem a 40KB cag ilha de patogenicidade (cagPascoal) que codifica aproximadamente 30 genes necessários para a produção de um tipo 4 secreção system (T4SS)3,4 . CAG Pascoal-positivo cepas de H. pylori são associadas com a indução de níveis mais elevados de inflamação crônica no acolhimento, que tem sido implicado como um precursor essencial do adenocarcinoma gástrico5.
Na vivo modelos animais, particularmente os ratos, tem sido altamente informativos, permitindo que os pesquisadores a investigar as contribuições relativas de anfitrião, bacterianas e condições ambientais na infecção pelo H. pylori e doença resultado6. Estudos têm demonstrado anteriormente que prolongou o H. pylori infecção de ratos sobre os resultados do fundo genético de C57BL/6 no desenvolvimento da gastrite crônica e glândula atrofia, as duas principais características do H. pylori infecção7. Além disso, a infecção com as espécies bacterianas relacionadas canino/felino, a H. felis, foi mostrada para induzir a formação de malte em camundongos com patologia semelhante e progressão da doença, visto na humana malte linfoma8,9. O mais comumente usado o H. pylori isolada em estudos de colonização do rato é o "Sydney tensão 1" (SS1) tensão10, que é o cagPascoal+ , mas tem um T4SS não-funcional (T4SS−)11. Outras cepas amplamente utilizadas incluem H. pylori B128 7.13 (cagPascoal+/T4SS+)12 e X47-2AL (cagPascoal–/T4SS−)13. Para H. felis infecções, a estirpe CS1 ("gato espiral 1", cagPascoal–/T4SS−) é usado geralmente14.
Neste documento, nós fornecemos um protocolo descrevendo a preparação de inóculos de Helicobacter infecção na vivo , o procedimento para gavage intragástrico de ratos, bem como métodos para o processamento dos tecidos para o estudo das alterações histopatológicas no estômago. Em particular, este artigo focalizará os métodos histológicos usado para visualizar a colonização bacteriana e avaliar as mudanças histopatológicas, incluindo formação de malte, na mucosa gástrica de ratos infectados. Alguns dos métodos descritos aqui podem ser adaptados para o estudo de outros patógenos de intestino como S. Typhimurium ou c. rodentium.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. crescimento e preparação de inóculos bacterianos
- Descongelar a existências de glicerol de H. pylori ou H. felis15 de-80 ° C e a subcultura em placas de ágar sangue (HBA) cavalo compreendendo: Agar sangue Base n º 2 (ver Tabela de materiais); uma modificada "Suplemento de Skirrow seletivo antibióticos" (consistindo de vancomicina, 10 μg/mL; polimixina B, 25 ng/mL trimetoprim, 5 µ g/mL; anfotericina B, 2,5 μg/mL); e 5 – 10% (v/v) cavalo sangue15,16. As bactérias crescem bem em condições de microaerobic em 2.5 ou 3.5 L anaeróbicos frascos contendo os pacotes de gás apropriado (consulte a Tabela de materiais), a 37 ° C.
Nota: Cepas de H. pylori crescidas sob estas condições devem ser repicagem depois de 1-1,5 dias de incubação, Considerando que para H. felis, pelo menos 2 dias de incubação é geralmente necessária. Meios adequados de armazenamento e cultura têm sido descritos em detalhe anteriormente15. -
Prepare inóculos bacterianos para infecção de rato de culturas do início a meados de fase logarítmica. Colheita de bactérias suavemente de placas de ágar inundando cada prato com 1 a 2 mL de caldo de infusão (BHI) cérebro coração. Aspire suspensões de placas com pipetas Pasteur.
- Em alternativa, prepare inóculos de bactérias Helicobacter tem sido propagada em caldo BHI para 16 – 18 h15. Neste caso, recolher as bactérias por centrifugação de baixa velocidade a 2.200 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
- Avalie a viabilidade e motilidade das bactérias examinando molhado monte preparações sob microscopia de contraste de fase (objetivo de X 100). Prepare montagens molhadas por resuspending um loopful de bactérias em gotas 10 – 20 μL de BHI caldo em uma lâmina de vidro de microscópio. No caso de H. felis, que é uma bactéria muito maior do que o H. pylori, use um haemocytometer para contar com precisão o número de bactérias viáveis. Confirme a pureza da cultura através da realização de uma coloração de Gram.
Nota: Utilize apenas inóculos de H. pylori , se a maioria das bactérias têm uma forma bacilar ou espiral (a morfologia pode variar dependendo da estirpe). H. felis inóculos principalmente devem conter bactérias helicoidais em forma de. Não use inóculos se a maioria das bactérias têm uma morfologia cocoides, estas formas não são viáveis e não estabelecerá uma infecção em camundongos. -
Estimar o número de bactérias no inóculo pela contagem sob microscopia de contraste de fase o número aproximado de bactérias por campo (objetivo de X 100) e usando o seguinte guia: 1 bactéria por campo = aproximadamente 106 (de unidades formadoras de colônia CFU) de Helicobacter/mL; 10 bactérias por campo = aproximadamente 107 UFC/mL; 100 bactérias por campo = aproximadamente 108 UFC/mL, etc.
- Ao usar um haemocytometer, calcule UFC/mL, usando a seguinte fórmula:
UFC/mL = (número médio de bactérias em um campo de 4 x 4) x (fator de diluição) x (104).
- Ao usar um haemocytometer, calcule UFC/mL, usando a seguinte fórmula:
-
Ajuste a densidade da célula bacteriana do inóculo para aproximadamente 107– 108 UFC/mL por diluição em caldo BHI, se necessário.
- Para garantir máxima viabilidade bacteriana, use inóculos para gavage intragástrico logo que possível após o preparo.
- Sempre confirme a densidade de células de H. pylori e viabilidade realizando contagem viável dos inóculos imediatamente após o procedimento de gavagem (veja abaixo). Isto não é sempre possível para H. felis, como geralmente não formar colônias isoladas em meios de cultura. Os números de s de Helicobacterviável em inóculos não podem ser determinados pela medição da densidade óptica (600) sozinha como esse método não discrimina entre viável (ou seja, bacilar/espiral/helicoidal) e não-viáveis ( ou seja, cocoides) bactérias.
- Usar valores de densidade óptica como um meio de estimar os números de viável de H. pylori bactérias em inóculos, mas neste caso, é primeiro necessário para gerar uma curva de crescimento. Para isso, os valores das culturas de H. pylori 600 são monitorados ao longo do tempo e correlacionados diretamente contra o número de bactérias viáveis, determinados pela contagem de placa.
Nota: É um método conveniente para a realização de tais determinações de curva de crescimento bactérias da cultura em meio líquido (seção 1.2), usando frascos de cultura de tecidos de fundo plano padrão colocados numa incubadora 10% CO2 . Os números de CFUs, determinados a partir de alíquotas das culturas obtidas a cada 4-6 h durante 2-3 dias, então são comparados com o correspondente A600 valores17. Importante, curvas de crescimento devem ser geradas para cada estirpe de H. pylori , como estas podem crescer em ritmos diferentes e, além disso, nem todas as cepas crescem bem em 10% CO2.
2. intragástrico Gavage de ratos com Helicobacter
Nota: Este método de gavage intragástrico pode ser aplicado a outras espécies de bactérias que colonizam o intestino , por exemplo, S. Typhimuriumc. rodentium, Listeria monocytogenes.
- Uso 6 – 8 semanas de idade, específico com isentos de agentes patogénicos (SPF) e Helicobacter-livre de ratos machos ou fêmeas. Use animais com um fundo genético C57BL/6 para experimentos de infecção com H. pylori ou H. felis. No presente estudo, nós usamos o selvagem-tipo (WT) e modificado geneticamente camundongos C57BL/6 falta um receptor imune inato chave (denominado nocaute ou animais KO).
Nota: Mouses em outros planos de fundo genéticos também podem ser usados para infecções de Helicobacter , no entanto, os níveis de colonização e severidade da doença podem ser afetados pelo tipo de anfitrião fundo18,19. - Aspire o inóculo bacteriano (passo 1.5) para seringas descartáveis de 1ml e substituir as agulhas fornecidas com 23 agulhas de calibre, em que se encontram os cateteres de polietileno descartáveis aposta (comprimento, 6 a 8 cm; diâmetro interno, 0,58 mm). Apertem os cateteres para as agulhas pela aplicação de pequenas tiras de plástico filme (ver Tabela de materiais). Como alternativa, substitua o conjunto agulha/cateter usando plástico estéril, tubos de alimentação (20 gauge x 38 mm).
- Impedir fisicamente ratos com um aperto firme na nuca do pescoço e cauda.
Nota: Este procedimento pode ser realizado sem anestesia, ou alternativamente, com o uso de um anestésico inalado, tais como Metoxiflurano ou isoflurano15. - Introduza o cateter no centro da mandíbula aberta e guia em uma direção caudal para o esôfago. Esticar o pescoço do rato para permitir a facilidade de acesso ao estômago através do esôfago (e longe da traqueia) até a maioria ou todos do cateter não é mais visível e sentir uma resistência, correspondente à base do estômago. Entrega uma alíquota específica, geralmente 100 μL por inoculação (Figura 1).
Nota: Os ratos devem ser gavaged com ≥ 105 CFU para garantir patologia ideal de colonização e doença. - Ratos de casa em uma facilidade animal SPF para a duração do experimento.
Nota: Patologia severa e adenocarcinoma em camundongos WT C57BL/6 só é observada em aproximadamente pós-infecção20 24 meses. No entanto, este efeito pode ser acelerado em alguns animais geneticamente modificados, ou em camundongos com outras origens genéticas. - Após a conclusão do procedimento de gavage, realizar uma modificação da técnica milhas e Misra para determinar os números de viável de H. pylori bactérias administradas a ratos. Para isso, o inóculo é serialmente diluído (a partir de 10− 1 a 10,5) em BHI usando o método descrito em detalhe anteriormente15.
Nota: A fim de garantir o isolamento das colônias simples, placas HBA devem ser aquecidas e seco em uma incubadora de segurança biológica gabinete ou 37 ° C durante 10 a 15 min antes de usar.
3. colheita de tecidos de ratos pós-experiência
- Eutanásia em ratos, por inalação de dióxido de carbono ou deslocamento cervical, de acordo com o Comité deontológico competente a experimentação animal.
- Abrir a cavidade abdominal e excisar o estômago com uma tesoura curva, bem.
Nota: Sera também pode ser coletado por punção cardíaca para auxiliar na investigação de respostas sistêmicas à infecção Helicobacter . Além disso, a coleção de baços e linfonodos paragastric são úteis no estudo de respostas imunes adaptáveis. - Cortar o estômago ao longo da curvatura maior e remover alimentos residual de gentil lavagem em tampão de fosfato estéril salino (PBS) em um tubos de 50 mL.
- Lavar o estômago novamente em PBS estéril e depois gravar o peso molhado usando pratos de Petri plástico tarada 6 cm.
- Achatar o estômago e dissecar essas em dois fragmentos de tecido igual, cada contendo: o antro, corpo e regiões não-glandular forestomach (Figura 2). Remover a região não-glandular e pesar uma metade de cada um no estômago antes de adicionar a ou 1 mL de BHI estéril (para contagem viável) ou snap congelamento em nitrogênio líquido (para extração de DNA/RNA).
Nota: Tubos contendo tecido em BHI devem ser armazenados em gelo até que estejam prontos para serem processados. Encaixe os tecidos congelados do estômago também podem ser usados para extrair o RNA ou proteínas para qPCR (PCR quantitativo) ou análises de mancha ocidentais, respectivamente. - Adicione o outro estômago metade para um tubo de 15 mL contendo formol a 10%. Mergulhe tecidos em formol a 10% por 10 s e depois achate ao lado superior dos tubos. Permitir que os tecidos corrigir antes de re-imersão em solução de formalina 10% por um período mínimo de 24 h.
Nota: Os tecidos podem permanecer em formol a 10% por muitas semanas antes da sua transformação para a histologia. Armazenamento prolongado do tecido pode, no entanto, afetar sua arquitetura e/ou a antigenicidade, resultando em resultados abaixo do ideal em análises a jusante.
4. a confirmação da colonização bacteriana na pós-infecção estômago
-
Contagem viável de H. pylori no estômago
- Suplemento estéril placas HBA com antibióticos adicionais (200 μg/mL bacitracina e ácido de naladixic de 10 μg/mL) antes de executar a colônia contagens de rato infectado estômagos16.
- Homogeneizar as seções do estômago também manualmente, usando micropestles de polipropileno autoclavável, ou usando um instrumento de dissociação mecânica (ver Tabela de materiais).
- Prepare diluições em série duplicadas (10− 1 a 10− 2) do homogenates gástrico resultante em BHI estéril.
Nota: As diluições devem ser decididas com base nas cargas bacterianas típicas obtidas para um determinado H. pylori estirpes utilizadas para infecção, bem como a duração da infecção. Amostras não diluídas podem também ser usadas. - Divida pré-secada as placas HBA (ver nota acima) em três ou quatro segmentos. Usando uma adaptação da técnica milhas e Misra, adicionar 10 – 100 mL de cada diluição para um segmento da placa de ágar e espalhar usando laços de plástico estéril15.
- Permitir que as placas secar e depois colocá-los em posição invertida (lado da tampa para baixo) em frascos de gás anaerobe. Para manter a umidade em frascos, incluem uma placa de Petri contendo água.
- Incube frascos a 37 ° C até colônias formam (geralmente 4-7 dias).
- Enumere ou nos segmentos contendo entre 10 e 100 colônias isoladas.
Nota: Colônias de H. pylori e o crescimento de H. felis em placas podem ser distinguidas dos outros membros da microbiota gástrica murino usando testes padrão da urease, catalase e oxidase. H. pylori e H. felis são positivos para todos os três testes. - Calcular o bacteriano carrega como (CFU/g de tecido), usando a seguinte fórmula:
[(Número médio de colônias contadas) × (fator de diluição) x (volume de chapeado)] / estômago (peso).
-
Detecção da infecção por H. felis em tecidos gástrico pela reação em cadeia da polimerase (PCR)
- Extrai DNA de estômagos de rato usando protocolos padrão de isolamento de DNA, ou um kit disponível comercialmente.
- Determinar a concentração de DNA das amostras usando uma técnica de quantificação fluorométrica (ver Tabela de materiais).
- Configure as reações de PCR como alvo um fragmento de pares 325-base (bp) da urease B H. felis gene (ureB)21. Cada reação deve conter: 100 ng de DNA genômico; 1 mM de avanço (5'-AAA ATC CAC GAA GAC ro GG-3') e reversa (5'-CTT TTA TCC AAG ro ro CAC ACC-3') as primeiras demão; 200 mM dNTPs; 0,5 unidades de Taq polimerase e as quantidades adequadas de buffer e água livre de nuclease.
Nota: Este par do oligonucleotide foi concebido para reconhecer e ligar com sequências homólogas nos genes de ureB tanto a H. pylori e a H. felis mas quando sujeito às condições abaixo, não os presentes na ureB PCR genes de entero-hepática Helicobacter spp. - Executar a amplificação por PCR usando o seguinte perfil térmico: aquecimento a 94 ° C por 5 min, seguido por 35 ciclos de 94 ° C por 30 s, 61 ° C por 30 s e 72 ° C por 1 min, antes segurando a 20 ° C.
- Execute produtos do PCR em um gel de agarose 2% por 30 min a 100 V.
5. histológicas análises de Helicobacter -infectados seções de estômago do rato
- Processamento dos tecidos do estômago
- Remova os tecidos do estômago do formol e coloque em pratos de Petri limpa.
- Corte os tecidos do estômago com um bisturi em vários tamanhos iguais tiras longitudinais (cada 2-3 milímetros grosso) e coloque rotulados encastre cassetes contendo o estofamento da espuma.
- Reparar os tecidos do estômago colocando fitas incorporação em um frasco enchido com 80% de etanol.
Nota: Estômagos podem ser processados imediatamente ou armazenados por até 1 a 2 dias antes de prosseguir para a próxima etapa. - Estômagos de processo em um processador de tecido automatizado, programado com as seguintes configurações:
Desidratação: 70% de etanol - 1 ciclo, 20 min; etanol a 90% - 1 ciclo, 20 min; 100% de etanol - 2 ciclos, 20 min cada + 1 ciclo, 40 min + 1 ciclo, 1 h.
Compensação: xileno – 2 ciclos, 30 min cada + 1 ciclo, 45 min.
Impregnação: cera de parafina a 60 ° C - 1 ciclo, 45 min + 1 ciclo, ciclo de 1 h + 1 h 1,25. - Retire da máquina, as amostras processadas e armazenar à temperatura ambiente para a incorporação de parafina.
- Parafina a incorporação dos tecidos gástricos transformados
- Coloque os moldes base de aço inoxidável no palco da unidade de incorporação para aquecer as bases dos moldes.
Nota: Incorporando a máquina deve ser fixado em 60 ° C, para a incorporação de parafina eficiente. - Lugar de encerar cassettes contendo as amostras em uma área cera morna quente banho/placa da unidade de incorporação, até cera dissolve-se totalmente.
Nota: É recomendável que a amostra ser incorporado logo após a cera se dissolve. Isso garante que não ocorra o endurecimento dos tecidos. - Encha até metade dos moldes de aço inoxidável com cera de parafina. Usando pinça quente, retire as tiras de tecido do estômago do cassettes e suavemente empurrar que o estômago tiras através da parafina para a base dos moldes. Oriente cuidadosamente as tiras de tecido em um ângulo direito à base dos moldes para que suas extremidades fatiadas estão virada para cima.
Nota: As seguintes etapas devem ser executadas mais rapidamente possível para evitar o endurecimento e a separação entre as camadas de parafina dentro de blocos incorporados. A orientação adequada dos tecidos do estômago é essencial para análises a jusante. - Coloque os moldes na placa fria da unidade de incorporação para corrigir os espécimes no lugar e reorientar os tecidos se necessário.
Nota: Se os tecidos se tornam desalojados e a parafina começa a endurecer, coloque moldes volta na chapa quente para derreter a cera e re-incorporar tecidos em moldes. - Coloque metade das fitas encastre rotuladas (que eram usadas para o processamento do tecido) sobre o cimo dos moldes e preencher suavemente com cera quente. Não permita que parafina a transbordar.
- Delicadamente, coloque os moldes para um prato frio e deixe arrefecer.
- Uma vez que a parafina tem totalmente definido, separe os blocos incorporados de moldes. Limpe o excesso da cera de parafina nas bordas de fita usando uma placa quente (definido acima de 80 ° C) ou um raspador. Blocos podem ser armazenados à temperatura ambiente até o corte é realizado.
- Coloque os moldes base de aço inoxidável no palco da unidade de incorporação para aquecer as bases dos moldes.
- Corte de tecidos
- Blocos de parafina do tecido no gelo de relaxar e aquecer num banho de água cheio de água ultrapura para 40-45 ° C.
- Fixar a lâmina no suporte do micrótomo e definir o ângulo de incidência entre 1 – 5° para evitar o contato entre o bloco face e faca faceta, antes de inserir blocos de parafina.
Nota: Certifique-se de blocos são claros de parafina em excesso, adquirida a partir da incorporação, pois isso pode impedir o ajuste do bloco. - Oriente a lâmina para um corte reto do outro lado do bloco. Delicadamente, corte 2 – 3 secções finas para garantir o correto posicionamento do bloco.
- Corte blocos por uma espessura de cerca de 10 a 30 mm. Esta etapa assegura que uma superfície máxima de cada tira de tecido será cortada.
- Corte 10 µm seções e descartar qualquer que contêm buracos causados por aparar.
- Cuidadosamente pegar seções usando uma pinça e eles flutuam em banho-maria para achatamento. Use uma pinça para separar cada seção.
- Recolha seções do banho de água e coloque em lâminas de vidro carregada (veja a Tabela de materiais).
- Armazenar slides na posição vertical em um porta-lâminas e coloque em uma incubadora a 37 ° C. Seções de secas durante a noite.
- Armazenar as seções em temperatura ambiente por tempo indeterminado para análises subsequentes.
- Hematoxilina e eosina (H & E) coloração dos tecidos do estômago
- Dewax slides usando 3 lavagens de xileno por 5 min cada, seguido de 3 lavagens em etanol 100%, por 3 min cada. Certifique-se de soluções novas são utilizadas em cada estágio.
- Enxágue slides na água da torneira para 30 a 60 s.
- Remova o excesso de água batendo suavemente a parte inferior dos slides em uma toalha de papel. Mancha com hematoxilina filtrada por 3 min. Assegure-se que as seções são suficientemente cobertos com a solução.
- Enxágue slides sob água corrente até que água saia clara.
- Mergulhe os slides na água da torneira de Scott para 8 – 10 s. Não exponha os slides para a solução mais do que 10 s como isto irá resultar em manchas mais escuras e intensas. Coloração de seções pode ser visto sob um microscópio. Coloração eficiente nesta fase resultará em uma cor 'azul bebé'.
Nota: Prepare a água da torneira de Scott, dissolver 2 g de hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3) e 20 g de sulfato de magnésio (MgSO4) em 1 litro de água destilada. - Enxágue slides na água da torneira para 30 a 60 s.
- Remover o excesso de água, conforme descrito na etapa 3 e em seguida mancha com filtrado 1% eosina aquosa por 3 min.
- Enxágue slides sob água corrente até que água saia clara.
Nota: A coloração pode ser avaliada usando um microscópio de luz. Se a coloração é muito escura, slides podem ser desidratados em etanol 100%, por mais que o tempo especificado. Se a coloração mais escura é necessária, slides podem ser manchados com eosina por 1 – 2 min mais, antes de prosseguir para as etapas subsequentes. - Desidratar slides usando 3 lavagens de etanol 100% por 30 s cada, seguido de 3 lavagens de xileno por 2 min cada. Certifique-se de soluções novas são utilizadas em cada estágio.
- Monte lâminas com meio de montagem. Adicione uma gota de meio de montagem no centro de uma lamela limpo antes de colocar suavemente o slide no topo com seções virado para baixo.
Nota: Não seque slides antes da capa escorregando. - Coloque slides sobre uma superfície plana e deixar secar ao ar. Slides também podem ser secados em uma coifa para acelerar o tempo de secagem.
- Coloração de Giemsa dos tecidos do estômago
- Dewax slides usando 2 lavagens de histolene por 5 min cada, seguido por 2 lavagens de etanol 100% por 3 min cada e, em seguida, uma lavagem final em etanol a 70% por 3 min. Certifique-se de soluções frescas são usadas para cada lavagem.
- Enxágue slides na água da torneira para 30 a 60 s.
- Prepare a solução de Giemsa misturando 20% Giemsa mancha com água destilada de 80%. Mancha de slides com Giemsa solução por 1h.
- Coloque slides em 100 mL de água destilada contendo 3-4 gotas de ácido acético para s de 2 – 3.
Nota: Solução deve ser misturada bem antes de usar. Nesta fase, slides devem aparecer azul pálido na cor. - Lavar as lâminas em etanol a 96% para 30 s.
- Lave slides em 3 banhos de isopropanol por 2 min cada, seguido de 3 banhos de histolene por 2 min cada. Use o isopropanol fresco e histolene para cada lavagem.
- Lamela desliza com meio de montagem, conforme descrito anteriormente.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Este protocolo descreve uma técnica de gavagem oral para alcançar intragástrico infecção com H. pylori ou H. felis em modelos do rato murino (Figura 1). Após eutanásia, estômagos são removidos, pesados e divididos em 2 metades iguais, compreendendo os antro, corpo e regiões não-glandular dos tecidos gástricos (Figura 2). A região não-glandular é removida antes de realizar qualquer análise.
Colonização bem sucedida do...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este protocolo descreve a utilização de um modelo de rato in vivo de Helicobacter infecção. Os passos críticos do processo são a: 1) preparação de inóculos de Helicobacter contendo bactérias motile e viáveis; 2) a entrega dos números adequados de bactérias para o mouse através de gavagem intragástrico; 3) a detecção da infecção bacteriana por contagem de colônia e/ou PCR; e 4) processamento de tecidos gástricos para permitir a avaliação da histopatologia em infectados estômagos. Mais sugestões ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostaria de agradecer a Sra. r. De Paoli e MS. Georgie Wray-McCann para assistência técnica. Os autores reconhecem a utilização das instalações e assistência técnica da plataforma de histologia de Monash, departamento de anatomia e biologia do desenvolvimento, Universidade de Monash. O laboratório é suportado pelo financiamento da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) para RLF (APP1079930, APP1107930). RLF é apoiado por uma bolsa de pesquisa sênior do NHMRC (APP1079904). KD e MC são suportados por bolsas de pós-graduação de Monash. KD também é apoiado pelo centro de imunidade inata e infecciosa doenças, Hudson Instituto de pesquisa médica, enquanto MC tem uma bolsa de pós-graduação internacional desde a faculdade de medicina, enfermagem e Ciências da saúde, Universidade de Monash. Pesquisa no Instituto de investigação médica Hudson é suportada pelo programa de apoio de infra-estrutura operacional do governo vitoriano.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes bacteriológicos | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolver em água deinonizada antes da esterilização |
| Sangue de cavalo desfibrinado premium | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolva em água desinonizada antes da esterilização |
| Pacotes de gás CampyGen | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Reagentes histológicos | |||
| Formalina, tamponado neutro, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Álcool absoluto, 100% desnaturado | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xileno (sem enxofre) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filtro antes do uso |
| Eosina, Coloração Aquosa | Amber Scientific | EOCA-1L | Filtro antes do uso |
| Coloração Wright-Giemsa, modificado | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Diluir antes de usar (20% Giemsa, 80% água deionizada) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX meio de montagem | VWR | 1.00579.0500 | |
| Reagentes de biologia molecular | |||
| Qubit dsDNA BR Kit de ensaio | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotídeos | Sigma Aldrich | A temperatura de recozimento dos primers ureB usados neste estudo é de 61 &graus; C | |
| GoTaq Flexi DNA Polimerase | Promega | M8291 | O kit inclui 10x tampão PCR e dNTPs de cloreto de magnésio |
| Bioline | BIO-39028 | Diluir a 10 mM em água livre de nuclease estéril antes de usar | |
| Grau molecular | Agarose Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnésio Sulfato Heptahidratado | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibióticos | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolver em água deionizada |
| Polimixina B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolver em água deionizada |
| Trimetoprim (≥ 98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolver em 100% (absoluto) Etanol |
| Anfotericina | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolver em água deionizada |
| Bacitracina de Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolver em água deionizada |
| Ácido naladícico | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolver em água deionizada |
| Outros reagentes | |||
| Metoxiflurano (Pentrhox) | Medical Developments International | Não aplicável | |
| Cera | parafina Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipamento e material plástico | |||
| Frascos anaeróbicos de oxóide | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipetas | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrífuga | Colete pellets bacterianos por centrifugação a 2.200 rpm por 10 minutos a 4 &graus; | ||
| Agulha de deslizamento de precisão C 23 g | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Tubo de polietileno de furo fino Portex | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Cateteres de alimentação de plástico | Instech Laboratórios | FTP20-30 | |
| Seringas descartáveis de 1 mL tuberculina luer slip | BD Bioscience | 302100 | |
| Micropilão Eppendorf para tubos de 1,2 - 2 mL | Pilões de polipropileno autoclaváveis Sigma Aldrich Z317314 usados para homogeneização do estômago | ||
| Dissociador GentleMACs | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use um gentleMACS predefinido Programas para tecido estomacal de camundongo |
| Tubos M (tampa laranja) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Fluorômetro Qubit | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Loop de plástico estéril | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Sistema de Incorporação | Leica Biosystems | Não aplicável | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Sistema Uni- | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus lâminas de vidro | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
Referências
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O'Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181(2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9(2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396(2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
