Vi præsenterer her, en standardiseret protokol for at måle den nasale spændingsforskel (NPD). Cystisk fibrose transmembrane ledningsevne regulator (CFTR) og epitelial natrium kanalen (ENaC) funktion evalueres ved ændring i spændingen på tværs af den nasale epitel efter superfusion løsninger, der ændre ion-kanal aktivitet, giver en resultat foranstaltning.
Vi beskrive et standardiseret måling af nasal spændingsforskel (NPD). I denne teknik, er cystisk fibrose transmembrane ledningsevne regulator (CFTR) og funktionen epitelial natrium kanalen (ENaC) overvåget af ændringen i spænding på tværs af den nasale epitel efter superfusion løsninger, der ændrer ion-kanal aktivitet. Denne aktiveres ved måling af potentielle forskel det subkutane rum og luftvejene epitel i næsebor, udnytter et kateter i kontakt med den ringere nasale turbinate.
Testen giver mulighed for måling af stabil basislinje spænding og successive netto spændingsændringer efter perfusion af 100 µM amilorid, en hæmmer af Na+ reabsorption i Ringers løsning; en klorid-gratis løsning indeholdende amilorid at drive chlorid sekretionen og 10 µM isoproterenol i en klorid-gratis løsning med amilorid at stimulere den cyklisk adenosin fra (cAMP)-afhængige chlorid konduktans relateret til CFTR.
Denne teknik har fordelen at demonstrere de elektrofysiologiske egenskaber af to vigtige komponenter oprettelse af hydrering af luftvejene overflade væske af respiratoriske epitel, ENaC og CFTR. Derfor er det en nyttig forskningsværktøj til fase 2 og bevis for konceptet forsøg af agenter, der er målrettet CFTR og ENaC aktivitet til behandling af cystisk fibrose (CF) lungesygdom. Det er også en vigtig opfølgningsprocedure at etablere CFTR dysfunktion, når genetiske test og sved test er tvetydige. I modsætning til sved chlorid er testen relativt mere tidskrævende og dyrt. Det kræver også operatør uddannelse og ekspertise til at gennemføre testen effektivt. Inter – og intra subject variation er blevet rapporteret i denne teknik, især i unge eller usamarbejdsvillig emner. For at hjælpe med denne bekymring, er fortolkning blevet forbedret gennem en nylig validerede algoritme.
Det overordnede mål med denne metode er at måle den nasale spændingsforskel (NPD), som har til formål at undersøge trans-epitelial ion transport i vivo1. Denne teknik giver mulighed for måling af natrium (Na+) og chlorid (Cl–) transport. NPD er blevet brugt som et analyseværktøj siden slutningen af 1980erne og blev accepteret i 1998 som en diagnostisk procedure ved cystisk fibrose Foundation (CFF) konsensus erklæring2 og i 2017 i retningslinjerne cystisk fibrose Foundation (CFF) konsensus diagnostiske 3. ja, biologiske CFTR dysfunktion, som er årsag til CF, fremgår af en øget Na+ absorption på den apikale membran og en defekt i Cl– sekretion. Denne funktionelle test giver fordelen, at en yderligere diagnose værktøj når genetik er ikke afgørende i patienter med ubestemt mellemliggende sved test resultater3. Selvom disse oplysninger kan også fås ved tarm aktuelle måling biopsier (ICM), ICM er dog kun tilgængelige i et par Centre globalt og yderligere behov standardisering. NPD er mere tilgængelig i ca 60 globale Centre og derudover mål respiratorisk epitel, der er den vigtigste placering af sygdommen.
Givet de oplysninger, det giver på CFTR aktivitet, bruges det også i proof-of-concept undersøgelser med henblik på at vurdere funktionel genopretning af CFTR protein af modulator behandlinger4,5,6,7, 8. Faktisk, data fra undersøgelser med CFTR mRNA-genet redigering, CFTR potentiator og corrector terapier, fremhæve væsentlige ændringer i Cl– og Na+ transport med terapi6,9 og bekræfter, at NPD kan være en lydhør slutpunkt i kliniske forsøg. Da vi mangler følsomme kliniske endepunkter købedygtig opdager en subtil ændring i kliniske status for patienten på kort sigt, kan denne prækliniske biomarkør være meget oplysende. Feltet af CFTR modulator terapier udvider hurtigt og vi har hårdt brug for test i vivo , der kan hurtigt dechifrere aktive forbindelser før de går til store fase 3 forsøg10.
Den fysiologiske rationale for teknikken er baseret på måling af de potentielle forskel mellem luftvejs epitel i næsebor og det subkutane rum. Ion-kanal aktiviteter udforskes ved at måle stabil maksimal baseline potentielle forskel (PD), dets ændringer efter blokering af ENaC relateret Na+ absorption og køre Cl– sekretion via forskellige apikale Cl– transportører herunder CFTR. CFTR dysfunktion er vist af en minimal ændring i potentielle forskel ved stimulation af Cl– sekretion gennem en cAMP afhængige vej og en øget ENaC medieret Na+ absorption som påvises ved en mere negativ baseline spændingsforskel og en forbedret reaktion på amilorid. Mekanistiske grundlaget for CF versus normal PD er sammenfattet i figur 1.
Figur 1: sammenfattende figur af Ion-kanal aktivitet. (A) Ion aktivitet i respiratoriske epitel viser balanceret aktivitet af ENaC og CFTR hos normale forsøgspersoner og (B) tab af CFTR aktivitet resulterer i øget ENaC medieret natrium transport og reduceret CFTR afhængige chlorid transport. ENaC: epitelial natrium kanalen, Na+: natrium, CFTR: cystisk fibrose transmembrane regulator, CL–: chlorid, mV: millivolt, PD: spændingsforskel, min: minut/s Klik her for at se en større version af dette tal.
Dog, denne test viser en vis grad af variabilitet både på gentagne målinger inden for den samme patient og hos patienter med samme genotype. Dette er yderst vigtigt at lette fortolkningen af ændringerne efter modulator behandling. Derudover mangler vi stadig validerede tærskler diskriminere mellem CF og raske forsøgspersoner. Dette kan delvis skyldes forskelle mellem tilgængeligheden af kliniske faciliteter og de anvendte teknikker. Derfor er en betydelig international indsats med henblik på standardisering af testen igangværende. Både os CFF-TDN (cystisk fibrose Foundation-Therapeutics udvikling netværk) og Iværksætterkapitalfonde-CTN (europæisk cystisk fibrose samfund-kliniske forsøg netværk) lavet en NPD Standard Operating Procedure (SOP) for brug i multicenter og forskning forsøgene. Denne seneste samarbejde af CTN og TDN har resulteret i en kombineret, internationale SOP, at samle ekspertise fra CTN og TDN (2014)11. Dette paper præsenterer protokol og test teknikkerne til at ansætte NPD for CF diagnose eller investigator-initierede proof-of-concept forsøg. Hvert center implementere teknikken er ansvarlig for ansøgning til sin institutionelle menneskelige videnskabsetisk Komité for godkendelse.
Figur 2: skematisk af hele anbefalede NPD setup. Bemærk, at den anbefalede opsætning er vist, herunder Sekventiel perfusion pumper, og opsætningen til 4-stop-pik serien. Særlige forbindelser og eksempler på komponenter er vist i SOP. (Diagram ændres med tilladelse fra Solomon, G.M. brystet, 201013) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Den generelle eksperimentelle flow er skitseret i figur 2, hvorved NPD måles mellem udforske broen placeret på epitel overflade og reference broen placeret i det subkutane rum, begge er tilsluttet elektroder og en høj-impedans voltmeter.
Dette sikres gennem 2 forskellige systemer: der er 2 acceptable reference elektrode opsætninger: (i) afbalanceret Ag/AgCl elektroder og et elektrokardiogram (EKG) fløde-fyldt bro forbundet til det subkutane rum ved let slid eller (ii) mættet kalomel Half-cells og en agar fyldt 22 – 24-gauge kanylen indføres subkutant. Kontakt til næseslimhinden er aktiveret af en dobbelt lumen kateter. En lumen er fyldt med agar eller ECG fløde og tilsluttet den måling elektrode, den anden tillader perfusion på næseslimhinden af de forskellige løsninger.
Spidsen af udforske slangen er placeret på den respiratoriske slimhinden under ringere nasale turbinate (figur 3).
Figur 3: placering af at udforske slanger på respiratoriske slimhinden. (A) ekstern visning viser placering. (B) Rhinoscopic Se demonstrerer placering. (C) Diagram viser den anatomiske placering for kateter placering. PD: spændingsforskel
For at studere svar af PD på flere lægemidler, anvendes de superfusion løsninger via den anden lumen af kateteret. Der er flere vigtige skridt med hensyn til forberedelse og afholdelse af NPD målinger, som er nærmere beskrevet nedenfor i protokollen, fra indledende forberedelse gennem til dataanalyse.
Efter udarbejdelsen af løsninger og elektroder, passende kvalitetstest af elektroder og katetre giver mulighed for den grundlæggende adfærd af testen. Basal målingerne foretages langs ringere turbinate, der tillader udvælgelse af de bedste sted for måling, normalt, med den mest negative måling. Derefter bestemme sekventielle perfusions Na+ (ENaC) og Cl– (CFTR-afhængige) ion flux via en ændring i spændingen over den nasale epitel.
In vivo, NPD giver en unik måling, der kan udføres gentagne gange på grundlag af langsgående og demonstrerer, at lignende langsgående resultater med gentagne målinger, overholdes på en group-wise og individuel basis14, 15. Der er stærke beviser at NPD har fremragende forskelsbehandling gyldighed for at skelne CF fra ikke-CF. 25 undersøgelser vist konsekvent en statistisk signifikant forskel i Cl– og Na+ ledningsevne mellem patienter med CF og raske kontrolpersoner10. Mens flere tidligere udviklet indekser demonstrere denne kapacitet, forventer vi, at nye opdateringer er nødvendige givet de seneste standardiseringer af metode7,8.
Ændringer og fejlfinding
Denne test kræver flere vigtige skridt til at sikre nøjagtige målinger. Dette omfatter forskydningen af elektroder og katetre lukket kredsløb for at sikre, at systemet udfører anbefalede standarder. Patienter skal forblive stadig og afholde sig fra at tale som dette minimerer artefakter og kateter hjemstavnsfordrivelse. Dette gør testen vanskeligt i usamarbejdsvillige patienter og teknikken er kun blevet rapporteret i en undersøgelse hos børn under 6 år alder7.
Inden inspektionen af den nasale epitel er nødvendige for at sikre, at der er ingen skorper eller slim på epitel, som kan påvirke målingerne.
Meget vigtigt, skal det påpeges, at placeringen af placeringen af kateteret er genstand for debat. SOP præsenteres her udnytter måling under ringere turbinate, (IT). Placeringen af kateter under IT er blevet standardiseret og udført i multicenter forsøg, og derfor er den anbefalede teknik. Måling under IT er udført med side-hul kateter, som kan være svært at vedligeholde i fast kontakt med næseslimhinden, samtidig med at være i kontakt med løsningerne. Andre grupper kan måle PD på de nasal gulv, som er teknisk lettere. Vigtigere, viste Vermeulen (2011), at de 2 metoder er sammenlignelige16.
Opvarmning af løsningerne er stadig et spørgsmål om forhandling mellem europæiske og amerikanske-centers17,18. Det har anbefalet at bruge løsninger ved 37 ° C i stedet for 22 ° C øger observerede samlede chlorid svar af ca 25% og isoproterenol-afhængige chlorid svar ca 95%18. Men opvarmning øger variabilitet, som vurderet af en større standardafvigelse af samlede chlorid svar17. Derfor, da opvarmning af løsninger er en yderligere faktor variation, det tilrådes ikke at varme løsningerne, medmindre det kræves på grundlag af undersøgelsen.
Vi har tidligere sammenlignet både af elektrode teknikker og fundet, at både AgCl og Calomel elektrode systemer drives på samme måde i basal og stimuleret strømninger i normale individer13.
Begrænsninger af teknikken
Denne test er underlagt betydelige inden for emnet variabilitet. Variation af scoring er især udbredt i patienter med ubestemt tracings og dette bør regnskabsføres i diagnostisk program19. Faktorer af variabilitet omfatter akut øvre luftvejsinfektion, omfattende næsepolypper, forudgående sinus kirurgi og CF-relaterede inflammation, som falde dets specificitet og sensitivitet20,10. Derudover fortolkning af tracings kan være forskellige mellem læsere, selv om ekspert læsere viser glimrende aftale af kvantitative scoring og interpretability i CF og ikke-CF tracings, kontrast med en betydelig variation i de tillid til sporing af19.
Iboende variabilitet versus betydelig tærskler
Meget vigtigere, fysiologiske variabiliteten af måling er betydelige, som illustreret i forskellige undersøgelser10, såsom CFTR gen terapi forsøg, som viste betydelig variation i ændringer i klorid samlede transport og amilorid spænder21,22. Tværsnits evaluering tyder på, at nul Cl– plus isoproterenol svar over tærsklen på -5 til -7 mV er afgrænsningen mellem CF og ikke-CF fag10.
Vi mangler ikke desto mindre klar viden om omfanget af ændringen af denne parameter repræsenterer en effektiv CFTR korrektion i fase II forsøg med Sygdomsmodificerende behandlinger. For at vurdere enkelte svar, kan gentagne forsøg overvågning svar til en intervention være nødvendigt at skelne mellem væsentlige ændringer fra iboende variabilitet. Meget vigtigere, skal fremtidige langtidsstudier med sygdomsmodificerende lægemidler vise, at forbedring af CFTR funktion korrelerer med forbedring af klinisk relevante resultater eller surrogat resultater (såsom forbedring i FEV1) af CF sygdom. Faktisk markeret en nylig fase II Ivacaftor undersøgelse viste klinisk fordel trods en lille forbedring i chlorid sekretionen23.
Disse undersøgelser vil bidrage til at etablere, hvis en cut-off værdi forbedring i trans-epitelial Cl–ledningsevne kan være en surrogat parameter for klinisk fordel. Dette ville være en vigtig parameter for at vejlede udviklingen af CFTR ændre behandlingsformer.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder: sved Test og tarm aktuelle målinger (ICM)
Hos patienter med ” tvivlsom ” cystisk fibrose, som vurderet af en mellemliggende sved Cl– koncentration mellem 30 og 60 mM, NPD composite score forudsat en yderst følsom værktøj for at diagnosticere patienter som ” CF-sandsynligvis ” og ” CF-usandsynligt ”10 . Tarm aktuelle måling (ICM), som giver en ex vivo -måling af den netto Cl– strømme på tværs af rektal epitel, giver også bestemmelse af resterende CFTR funktion med en høj følsomhed, fordi CFTR er stærkt udtrykt i denne epitel.
Overvejer ændring af CFTR funktion af CFTR modulatorer, forholdet mellem disse forskellige CFTR biomarkør ændringer er i øjeblikket uklart. Selv om de seneste arbejde baseret på besluttet Ivacaftor at NPD og sved test er korreleret4, det endnu ikke blevet etableret hvis en måling i luftvejene er en bedre indikator for respiratorisk resultatet end for eksempel, sved test24 , 25 eller ændring af ICM. Desuden kan modifier narkotika også variere i deres orgel specifikke efficacies. Med hensyn til NPD er det vigtigt at bemærke, at ændringer i basal PD og amilorid svar express Na+ transport, mens ændringer i 0 Cl– og isoproterenol svar express Cl– transport. Det er endnu at fastslås, hvilke af disse er vigtigere for sygdom forbedringsanlæg.
Fremtidig anvendelse af denne teknik
Brug af denne teknik forventes uden for feltet CF. Da denne teknik er enestående egnet til at påvise Na+ og Cl– ion-kanal, kan det anvendes til at påvise dysfunktion i luftvejene sygdomme herunder astma26, kronisk bronkitis27, ikke-CF bronchiectasis28 og tilbagevendende pankreatitis29. Desuden har ændringer af denne teknik været brugt i de nedre luftveje (LAPD) for at demonstrere lavere airways-fokuserede CFTR dysfunktion i kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) patienter med kronisk bronkitis30.
NPD giver en følsom i vivo biomarkør af CFTR funktion, som kan bruges til både diagnose og også for proof of concept undersøgelser med henblik på at korrigere CFTR og ENaC kanal aktivitet i Translationel forskning. Dette giver mulighed for langsgående vurdering af trans-epitelial funktion og holder løfte som en strategi for personlig medicin til at skræddersy den mest effektive corrector for hver patient med CF.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af arbejdsgruppen for CFTR funktion af standardisering Udvalget (kliniske forsøg netværk, europæiske cystisk fibrose samfund) og nationale ressourcer Center Working Group (Therapeutics udvikling netværk, cystisk fibrose Foundation). Yderligere støtte blev leveret fra CF Foundation (Clancy FY09 til GMS) og NIH (DK072482 til SMR og GMS).
KD Scientific infusion pump (or equivalent – such as programmable infusion pumps provided by the institution/hospital) | Fisher Scientific | ||
Powerlab 4/30 | AD Instruments | ||
BMA-200 AC/DC portable bioamplifier | AD Instruments | ||
IS0-Z isolation headstage for BMA-200 | AD Instruments | ||
Windows compatible PC – Minimum requirements of Windows XP or higher | Various | ||
AD Instruments software: GLP Client V6 (Windows) or higher | AD Instruments | ||
ECG electrode (ground for study subject) | Hospital standard | ||
2 mini calomel reference electrodes | Fisher Scientific | 13-620-79 | |
Potassium Chloride KCl, Granular – USP, formula weight 76, qty: 500 gm | Spectrum | ||
Sterile container (such as specimen collection container , or similar) to be used for KCl calomel bath, with holes cut in lid to hold electrodes in place. (If not provided by electrode manufacturer.) | Hospital standard | ||
2 electrodes: Ag/AgCl 8 mm TP electrode | BIOPAC Systems | UNSHLD-EL258 | |
2 Ag/AgCl electrodes, B0194, plug 4 mm | SLE Instruments | ||
Signacreme® Conductive Electrode Cream | Fisher Scientific | Parker Labs ref # 17-05 | |
Skin abrasion device | PROMED Feeling | Ref 374901 | |
Hi Di 541 M, Diamond tipped dental burrs | Ash Instruments | ||
Becton Dickinson PE 50 tubing | Fisher Scientific | 427411 | |
Becton Dickinson PE 90 tubing | Fisher Scientific | 427421 | |
Silastic tubing, 0.062” ID, 0.095” OD | Fisher Scientific | 508-007 | |
Micropore Surgical Tape Paper (25 mm x 9.1 m) | 3M | 1530-1 | |
Marquat double lumen catheter Length: 80 cm; Outer diameter: 2.5 mm; Internal diameter of the channels: 0.8 mm; Distance of the side-holes to the tip: 2 mm. EU label Agreement for NPD: I0202US | Marquat | I0202US | |
1" X 10 yards silk tape | 3M Durapore | 1538-1 | |
IV extension tubing (30", 50/box) | International Limited | IMN30 | |
Three-way stopcock (50/box) | Medex | MX5311L | |
Sterile syringe filters (ANOTOP 25 sterile 50pk; 0.22-micron or smaller filters; or equivalent) | Fisher Scientific | 09-926-7 | |
Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20G, for connection to PE90 if using nasal catheter produced at study site) | Fisher Scientific | 427564 | |
Becton Dickinson 23G, 0.75” Vacutainer (“butterfly”) needles (0.6 x 19 mm; 50U/box) (for connection to PE50) if using nasal catheter produced at study site) | Fisher Scientific | 367283 | |
Becton Dickinson Syringe 60 ml without needle Luer-Lok tip (40/Box) | Fisher Scientific | 309653 | |
Becton Dickinson Syringe 10 ml without needle Luer-Lok tip (100/Box | Fisher Scientific | 309604 | |
Single use sterile wipes (per institutional availability) | Hospital standard | ||
70% EtOH (1 pint), Aaper Alcohol and Chemical Co. catalog number NC9274019 (or equivalent) | Fisher Scientific | ||
Corning single use sterile bottle-top filters, 0.22 μm pore size (0.15 – 1.0 litre volumes acceptable) | Fisher Scientific | 430624 | |
Buffer Cert Ph 10.00 (1L Sn04332) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
Buffer Cert Ph 4.00 (1L Sn04327) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
Buffer Cert Ph 7.00 (500 ml Sn04328) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
Disposable underpads (Blue Pads; 23"X36" 150/Box; or equivalent per hospital standard) | SureCare | ||
23G, 0.75” Vacutainer “butterfly” needles (0.6×19 mm; 50U/box) | Becton Dickinson | 367283 | |
Difco Laboratories Agar (Noble 100g 0142-15-2; or equivalent) | Fisher Scientific | ||
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (or equivalent) | Fisher Scientific | ||
Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with battery | Fisher Scientific | ||
Head and chin rest (or equivalent; optional) | Richmond Products, Inc | 629R | |
Static Dissipative Anti-Fatigue Matting (or equivalent) | Fisher Scientific | No. 791 | |
REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE | |||
Sodium Chloride, Granular – USP NaCl | Spectrum | Formula Weight: 58; Size: 500 gm | |
Calcium Chloride CaCl2•2H2O – USP | Spectrum | Formula Weight: 147; Size: 500 gm | |
Magnesium Chloride Hexahydrate Crystal, MgCl2•6H2O – USP | Spectrum | Formula Weight: 203; Size: 500 gm | |
Potassium Phosphate Dibasic, Anhydrous, Granular, K2HPO4 – USP | Spectrum | Formula Weight: 174; Size: 500 gm | |
Potassium Phosphate Monobasic Crystals – NF (KH2PO4) | Spectrum | Formula Weight: 136; Size: 500 gm | |
Sodium Gluconate- USP (monosodium salt) | Spectrum | Formula Weight: 218; Size: 500 gm | |
Calcium Gluconate – USP (Anhydrous Powder) | Spectrum | Formula Weight: 430; Size: 500 gm | |
Potassium Gluconate- USP (Anhydrous) | Spectrum | Formula Weight: 234; Size: 500 gm | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate – USP MgSO4•7H2O | Spectrum | Formula Weight: 246; Size: 500 gm | |
Amiloride HCl – USP | Spectrum | Formula Weight: 302; Size: 5gm | |
Adenosine 5’-Triphosphate (ATP) (Disodium salt) | Spectrum | Formula Weight: 551; Size: 5gm | |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Crystal – USP MgCl2•6H2O | Spectrum | Formula Weight: 203; Size: 500 gm | |
Double-distilled water (ddH2O) | Hospital Pharmacy | Formula Weight: NA; Size: 1 L | |
Isoproterenol HCL Injection – USP 1 mg/5 ml ampule | Hospital Pharmacy | Formula Weight: 248; Size: single use | |
Ringers Injection, USP or Ringers Irrigation | Hospital Pharmacy | Formula Weight: NA; Size: 5 L |