方法文章

标准化鼻黏膜跨上皮电位差（NPD）测量方法

DOI：

10.3791/57006

⸱

2018年9月13日

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1Department of Medicine and the Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Pulmonology and Tuberculosis, University Medical Center Utrecht, 3Center for Experimental Medicine, Queens University, Northern Ireland, 4Hadassah Hebrew University Medical Center, Jerusalem, 5Centro Fibrosi Cistica, Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata, 6Service de Pneumologie et Allergologie Pédiatriques and Center de Ressources et de Compétence de la Mucoviscidose, Hôpital Necker Enfants Malades, 7INSERM U 1151, Institut Necker Enfants Malades

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种测量鼻电位差（NPD）的标准方案。通过灌注可调节离子通道活性的溶液，测定鼻黏膜上皮电压的变化，从而评估囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）和上皮钠离子通道（ENaC）的功能，获得相应的检测结果。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了一种标准化的鼻电位差（nasal potential difference, NPD）测量方法。该技术通过向鼻腔上皮表面灌注可调节离子通道活性的溶液，监测鼻上皮电压的变化，从而评估囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR）和上皮钠通道（epithelial sodium channel, ENaC）的功能。该方法通过测量鼻腔内皮下 compartment 与气道上皮之间的电位差实现，利用与下鼻甲接触的导管进行检测。

该检测可测量在灌注100 µM阿米洛利（一种在林格液中抑制Na+重吸收的抑制剂）后稳定的基线电压，以及随后的净电压变化；接着使用含阿米洛利的无氯溶液以诱导氯离子分泌，最后在含阿米洛利的无氯溶液中加入10 µM异丙肾上腺素，以刺激与囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）相关的环磷酸腺苷（cAMP）依赖性氯离子电导。

该技术的优势在于能够展示呼吸道上皮表面液体水合作用中两个关键组分——ENaC 和 CFTR——的电生理特性。因此，它是用于研究靶向调控 CFTR 和 ENaC 活性的药物在囊性纤维化（CF）肺病治疗中第二阶段及概念验证试验的一项有用研究工具。此外，当基因检测和汗液检测结果不明确时，该技术也是确认 CFTR 功能障碍的关键后续检测手段。与汗液氯离子检测不同，该检测相对更耗时且成本较高，同时要求操作者接受专门培训并具备相应技术专长才能有效实施。已有报道指出，该技术在受试者间和同一受试者内的重复性存在变异，尤其在年幼儿童或不配合的受试者中更为明显。为应对这一问题，近年来已通过一种经过验证的算法显著改进了结果判读的准确性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方法的总体目标是测量鼻电位差（NPD），旨在体内研究跨上皮离子转运in vivo1。该技术可用于测量钠离子（Na+）和氯离子（Cl-）的转运。自20世纪80年代末以来，NPD一直被用作研究工具，并于1998年被囊性纤维化基金会（CFF）共识声明2以及2017年囊性纤维化基金会（CFF）共识诊断指南3采纳为诊断程序。事实上，囊性纤维化（CF）的病因是CFTR生物学功能障碍，其特征为顶端膜上Na+吸收增加以及Cl-分泌缺陷。当遗传学检测结果不明确且汗液检测结果处于不确定的中间状态时，该功能检测可作为额外的诊断工具提供优势3。尽管这些信息也可通过肠道电流测量活检（ICM）获得，但ICM目前仅在全球少数中心可开展，且仍需进一步标准化。相比之下，NPD目前在全球约60个中心可用，且更重要的是，其靶向的是该疾病的主要病变部位——呼吸道上皮。

鉴于其能够提供关于CFTR活性的信息，该方法也用于概念验证研究，以评估调节剂疗法对CFTR蛋白功能恢复的效果。4,5,6,7,8。事实上，CFTR mRNA/基因编辑、CFTR 增效剂和校正剂治疗的研究数据均显示出 Cl⁻ 传导功能的显著改善- 和 Na+ 治疗中的转运6,9 并证实NPD可作为临床试验中具有响应性的终点指标。由于目前缺乏能够在短期内检测患者临床状况细微变化的敏感性临床终点，这一临床前生物标志物可能具有重要信息价值。CFTR调节剂疗法领域正在迅速拓展，我们迫切需要相关检测方法 体内 能够在进入大规模3期试验之前快速解析活性化合物10.

该技术的生理学原理基于测量鼻腔气道上皮与皮下组织之间的电位差。通过测量稳定的基线最大电位差（PD），以及在阻断与ENaC相关的Na+吸收后、通过不同的顶端膜Cl-转运体（包括CFTR）刺激Cl-分泌所引起的电位差变化，来探究离子通道的活性。CFTR功能障碍表现为：通过cAMP依赖性通路刺激Cl-分泌时，电位差变化极小；同时，ENaC介导的Na+吸收增强，表现为基线电位差更负，且对阿米洛利（amiloride）的反应增强。CF与正常电位差的机制基础总结于图1中。

电化学梯度示意图，CFTR/ENaC 活性，上皮转运，囊性纤维化病理分析。
图 1：离子通道活性示意图。（A）呼吸上皮中的离子活性，显示正常个体中 ENaC 与 CFTR 活性的平衡状态；（B）CFTR 活性丧失导致 ENaC 介导的钠离子转运增强，以及依赖 CFTR 的氯离子转运减少。ENaC：上皮钠通道，Na+：钠离子，CFTR：囊性纤维化跨膜调节因子，Cl-：氯离子，mV：毫伏，PD：电位差，min：分钟 请点击此处查看此图的放大版本。

然而，该检测在同一个患者多次测量之间以及相同基因型患者之间均表现出一定程度的变异性。这一点对于解释调节剂治疗后变化的解读至关重要。此外，我们目前仍缺乏经过验证的、用于区分囊性纤维化患者与健康个体的判断阈值。这可能部分归因于不同地区临床设施可及性及所采用技术之间的差异。因此，目前正在进行大规模的国际努力，以推动该检测的标准化。美国囊性纤维化基金会-治疗开发网络（CFF-TDN）和欧洲囊性纤维化学会-临床试验网络（ECFS-CTN）均已制定了用于多中心和研究性试验的鼻电位差（NPD）标准操作程序（SOP）。CTN与TDN近期的这一合作成果整合了双方的专业经验，形成了统一的国际SOP（2014）11。本文介绍了将NPD用于囊性纤维化诊断或研究者发起的概念验证试验的实验方案与检测技术。各中心在实施该技术时，须自行向本机构的人体研究伦理委员会提交申请并获得批准。

神经科学示意图；注射泵、电极、计算机接口；神经电位测量。
图2：推荐的NPD装置整体示意图。 注意图中显示了推荐的装置配置，包括串联的灌注泵和四通旋塞阀系统。具体连接方式和组件示例见标准操作程序（SOP）。（示意图经Solomon, G.M. Chest, 201013许可修改） 请点击此处查看此图的放大版本。

常规实验流程如图2所示，通过将置于上皮表面的探测电极桥与置于皮下空间的参考电极桥连接至电极和高阻抗电压表，测量两者之间的电位差（NPD）。

这一点通过两种不同的系统来保证：存在两种可接受的参比电极装置：（i）平衡的Ag/AgCl电极，以及通过轻微磨擦连接到皮下空间的充满心电图（ECG）导电膏的桥接装置；或（ii）饱和甘汞半电池，以及皮下插入的填充琼脂的22至24号针头。与鼻黏膜的接触通过双腔导管实现。其中一个腔道填充琼脂或ECG导电膏，并连接至测量电极，另一个腔道则用于将不同溶液灌注到鼻黏膜上。

将探查导管的尖端置于下鼻甲下方的呼吸黏膜上（图3）。

导管放置过程；鼻内窥镜示意图显示下鼻甲和中鼻甲的结构。
图3：探查导管在呼吸道黏膜上的放置。（A）外部视图显示放置位置。（B）鼻镜视图展示放置情况。（C）示意图标明导管放置的解剖位置。PD：电位差

为了研究PD对多种药物的反应，通过导管的第二管腔施加灌流溶液。关于NPD测量的准备和实施，有几个关键步骤，本方案中将从初始准备到数据分析进行详细说明。

在配制溶液和制备电极后，对电极和导管进行充分的质量检测，以确保测试的基本顺利进行。首先在下鼻甲处进行基础测量，以选择最佳测量位置，通常选择测得电位最负的部位。随后通过依次灌注来测定Na+ (ENaC) 和 Cl- 通过鼻上皮电压的变化来检测（CFTR依赖性）离子流。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

涉及人类受试者的实验方案已获得所有参与机构研究委员会的批准。每个实施该技术的中心均有责任向其机构的人类研究伦理委员会提交申请并获得批准。

1. 溶液配制

  1. 在实验前配制1 L的溶液#1、#2和#3（均为基础溶液），并现场储存（见表1）。
    注意：阿米洛利对光敏感，必须避光保存（溶液成分见表1）（详细溶液配制方法参见标准操作程序11）。
    1. 将所有溶液用pH 7.4缓冲，并使用0.22 µm瓶顶滤器过滤。
    2. 配制溶液#3时，先加入含磷酸盐的盐类，使其充分电离以防止结晶（溶液成分见表2）。
      注意：溶液#3的混合顺序至关重要。
    3. 将这些溶液储存于4 °C（可稳定3个月）或-20 °C（可稳定6个月）。
    4. 在NPD测试当天配制溶液#4和#5，加入相应试剂。异丙肾上腺素对光和氧化敏感，在室温下会失活（在4–8 °C下4小时内活性下降4%）。储存于4 °C。
      注意：ATP对光和氧化敏感（见表3）。
化合物分子量浓度 (mM)组成 (g/L)
NaCl581488.58
CaCl2 2H2O1472.250.33
KCl754.050.3
K2HPO41742.40.42
KH2 PO41360.40.05
MgCl2 6H2O2031.20.24

表1：溶液组成。

化合物分子量浓度 (mM)组成 (g/L)
Na Gluconate21814833.26
Ca Gluconate4302.250.97
K Gluconate2344.050.95
K2 HPO41742.40.42
KH2 PO41360.40.05
MgSO4 7H2O2461.20.24

表2：溶液组成。

溶液溶液编号成分EDC 标记
Ringers 注射液溶液 #1/A缓冲 Ringers 注射液RINGERS
Ringers + 阿米洛利溶液 #2/B缓冲 Ringers + 100 μM 阿米洛利AMIL
无 Cl- + 阿米洛利溶液 #3/C缓冲无 Cl- 溶液 + 100 μM 阿米洛利OCL
无 Cl- + 阿米洛利 + 异丙肾上腺素溶液 #4/D缓冲无 Cl- 溶液 + 100 μM 阿米洛利 + 10 μM 异丙肾上腺素ISO
无 Cl- + 阿米洛利 + 异丙肾上腺素 + ATP溶液 #5/E缓冲无 Cl- 溶液 + 100 μM 阿米洛利 + 10 μM 异丙肾上腺素 + 100 μM ATPATP

表3：溶液列表。

2. 导管

  1. 使用专为NPD设计的PVC材质、无菌、一次性双腔导管（内径0.7 mm），末端呈圆形且光滑（外径2.5 mm）。
    1. 通过侧孔与黏膜接触，侧孔距导管尖端2 mm，尖端另有一孔用于灌注（见步骤10.1）。
    2. 将导管的两个鲁尔锁接口之一连接至测量电极，另一个连接至灌注泵。使用蓝色染色的通道作为测量腔。沿导管每0.5 cm标记一次，直至10 cm处。
      注意：死腔体积为0.3 mL。建议采用上述方法准备导管；若不可行，则执行接下来的两个步骤。
    3. 裁剪等长（约76 cm）的PE50和PE90导管管路。
    4. 用一段1 cm长的硅胶管将两者连接固定。将一支25 G钝头针紧密插入PE90导管的另一端，将一支25 G蝶形针紧密插入PE50导管的另一端，注意插入时不得刺穿管壁。

双腔导管示意图；标注尺寸；用于医疗液体输注。
图4：用于NPD测量的导管。 插图框显示了带有测量孔的导管尖端。

3. 琼脂皮肤桥（蝴蝶针）和导管的制备

注意：操作熔化的琼脂时可能造成烫伤，应谨慎进行。

  1. 通过将3 g琼脂与100 mL溶液#1混合于广口瓶中配制3%琼脂溶液，在微波炉中加热至溶解（透明）。
    1. 用温热的琼脂填充10 mL注射器。
    2. 随后将注射器连接至蝴蝶针（23 G）以及导管的标记管腔，注入琼脂直至其出现在导管尖端。
    3. 冷却至少10分钟。
    4. 确保皮肤桥和导管完全填充，并目视确认无气泡。
    5. 将备用皮肤桥储存在4 °C的溶液#1中，且超过1周后不得使用。

4. 如果使用心电图导电膏

  1. 按1:1（v/v）比例用溶液#1（林格氏液）稀释ECG凝胶，静置至无气泡。
    1. 用10 mL注射器抽取稀释后的ECG凝胶。
    2. 将注射器连接至导管的标记管腔，缓慢注入ECG凝胶，直至其从下方侧孔处出现。
    3. 确保导管完全充满且无气泡。

5. 数据采集系统

注意：数据采集系统的总体设置如图5所示。

用于神经信号分析的电生理装置，包含生物放大器、电极和数据采集系统。
图 5：数据采集系统的装置示意图。 展示生物放大器和前置放大器与计算机接口的连接方式，以及电极与前置放大器之间的连接11。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 连接
    1. 使用 USB 线缆将计算机连接到数据采集系统（材料表）。
    2. 要将数据采集系统连接到生物放大器，请将 BNC 线缆从数据采集系统前面板的通道 1 输入端连接至生物放大器背面的输出端。
    3. 使用一根定制线缆将生物放大器连接至前置放大器：该线缆已预先连接至前置放大器的螺丝端，并插入生物放大器前面的输入部分。
    4. 将前置放大器连接至电极和接地电极。使用标准的 2 mm 母-母连接器将前置放大器前端与电极相连。
      注意：接口为内凹式设计，仅允许 2 mm 线缆单向插入：红色测量电极连接至患者鼻部（通过鼻导管）；黑色参考电极连接至患者鼻梁皮肤；白色电极连接至接地于受试者皮肤的 ECG 电极。
    5. 按如下方式设置生物放大器：偏移（Offset）：拉出以激活，旋转调节，调节完成后保持拉出状态；电压模式：直流（DC）；1 mV 校准（1 mV cal）：置于中立位置；电源（Power）：采集数据时打开，为电池充电时关闭；增益（Gain）：设为 10；带通滤波器低频端（LoFreq，外旋钮）：DC；带通滤波器高频端（HighFreq，内旋钮）：1 kHz；音量（Volume）：关闭。

6. 调整头级偏移

  1. 按照标准操作程序（SOP）11 中指示的顺序连接笔记本电脑和放大器。先打开数据采集系统，然后打开笔记本电脑（此顺序对软件识别用于数据采集的设备至关重要）。
    1. 根据标准操作程序（SOP）的步骤调整头级偏移（Head-Stage Offset）。

7. 偏移量

注意：需测试多个偏移量以确保电测量系统的稳定性。（见图6）

  1. 电极偏移设置：将参考（负极）电极和测量（正极）电极同时放入稀释的ECG导电膏或3 M KCl溶液中，确保前置放大器上显示的两电极间电位差接近零。
    1. 设置导管和/或皮肤桥偏移时，将鼻部导管的鲁尔锁端或皮肤桥的鲁尔锁端浸入含有测量（正极）电极的浴液中，将导管的另一端放入含有参考（负极）电极的ECG导电膏浴液或3 M KCl溶液中，确保前置放大器上显示的电位差接近零。
    2. 设置闭合回路偏移时，更换鼻部导管至电极浴液中后应确保电路闭合。检查闭合回路偏移读数是否接近0 mV（即“偏移”值，±2.5 mV范围内）。调节前置放大器的偏移旋钮，使偏移值调整至0 mV。
      注意：此步骤用于确认电路中所有连接均完好无损。若无法实现，可能表明鼻部导管存在问题（如琼脂或ECG导电膏中存在气泡）。此时应更换琼脂桥或推动装置中的ECG导电膏。必须先进行电极偏移校准，再使用电极与桥接装置进行闭合系统（闭合回路偏移）校准（图6）。

KCl 或 ECG 浴电极装置示意图；参考电极和测量电极；鼻导管。
图 6：（A）电极偏移、（B）导管（或桥）偏移、（C）闭环偏移的装置示意图。

8. 注射器设置

注意：以下是推荐的设置方案。

  1. 在测量前约1小时解冻溶液#1、#2和#3。
    1. 将延长管连接至靠近导管的三通阀。
    2. 启动所有泵，并用溶液#1冲洗导管，彻底冲洗导管直至三通阀中无气泡残留。

9. 参考电极和测量电极的放置

在受试者身上安装测量电极和皮下桥接装置的实验设置；神经生理学实验。
图7：已准备好进行测量的受试者，其身上装有测量电极和皮下桥接装置。

  1. 让受试者面向NPD操作者采取坐姿。为增加舒适度，可将双脚放在可选的防静电垫上，头部置于正视光学头托上。
    1. 将接地导联电极连接至放置在受试者手臂上的ECG贴片（图7）。
    2. 将皮下针插入前臂背侧（琼脂系统），或在前臂先前轻微磨擦过的区域上涂抹ECG导电膏后贴附参考电极（见下文第7至10步）。
    3. 通过测量皮肤间的电位差（手指PD），并要求受试者用拇指和食指指尖夹闭导管以封堵“测量孔”，从而检查与皮下空间的连接情况。
    4. 如果手指PD未达到-30 mV或更负，需检查蝶形针的插入情况。重复进行皮肤磨擦（适用于ECG导电膏系统）并检查盐桥连接。
    5. 启动溶液#1的注射泵，流速设为80 mL/h。从右侧鼻孔开始。
    6. 测量手指PD，应为稳定的负电压（典型范围为-40至-80 mV）。
    7. 若使用ECG导电膏系统：将ECG导电膏按1:1比例稀释，并在彻底冲洗探头孔后，用稀释液充满导管，操作方式与之前琼脂系统的处理相同。
    8. 将导管连接至一个装有约半量ECG导电膏的50 mL注射器，以浸润电极，便于检查电极偏移和盐桥偏移。
    9. 通过轻微磨擦皮肤表层，将参考Ag/Cl电极连接至皮下空间；当磨擦至真皮层时，皮肤将呈现“粉红且有光泽”的外观。
    10. 将覆盖有ECG导电膏的测量电极置于已磨擦的皮肤区域上。参照琼脂系统的操作方法，再次检查手指PD。

10. 静息PD的测量

  1. 使用照明鼻镜（或同等设备）观察下鼻甲，将鼻导管插入右侧鼻孔。以下鼻甲前端作为解剖标志，推进导管至下鼻甲下方的呼吸黏膜区域。若插入困难，可将探针孔紧贴鼻腔底部放置。
    注意：该导管具有足够的刚性，可由操作者引导进入鼻孔。为便于放置，导管的一侧通道为蓝色，并带有与下鼻甲接触的探针侧孔，可防止导管旋转。导管上标有从1到10 cm的刻度标记，可提供清晰的参考点。
    1. 测量下鼻甲处的PD。为此，应将导管的测量孔紧贴下鼻甲黏膜，使其完全闭合（标记为右侧基底AT）。
    2. 测量下鼻道内下鼻甲下方3.0、2.0、1.5、1.0和0.5 cm处的PD值：标记右侧基底PD值。
    3. 每次测量均需在指定距离处维持约5秒，以确保读数稳定（±1 mV），并有助于准确解读基础电位差（PD）值。
    4. 重复上述步骤于左侧鼻孔，使用功能键标记左侧基底PDs（3 cm，2 cm， 等等。左侧基底AT
    5. 以基础PD测量值为指导，将鼻导管探头插入信号最负的部位（位于下鼻甲前缘前方最多3 cm处），并用一小块胶带（或等效物）固定于鼻尖。

11. NPD 追踪连续灌注

  1. 右鼻孔操作
    1. 确认溶液正从患者的鼻腔滴出。让受试者采取舒适体位，头部略向下倾斜（通常可通过让受试者将头 resting 在手上，或使用 chinrest 或其他固定装置来实现）。提醒受试者尽量减少移动，避免触碰鼻子或导管，并避免说话。
    2. 开启溶液 #1（林格氏液）泵（5 mL/min，即 300 mL/h），持续记录直至获得稳定数值（<1 mV/30 s 的变化）。
      注意：达到稳定状态通常需要约 3 分钟。
    3. 关闭溶液 #1 的灌注。
    4. 开始使用溶液 #2（阿米洛利）进行灌注。记录 NPD 至少 3 分钟（若对平台期电压存疑，可继续记录至最多 5 分钟）。
    5. 开始使用溶液 #3（无氯溶液）进行灌注。记录 NPD 至少 3 分钟（若平台电压不稳定，可继续记录至最多 5 分钟）。
    6. 开始使用溶液 #4（异丙肾上腺素）进行灌注。记录 NPD 至少 3 分钟 [若平台电压未达稳定（电压轨迹在至少 30 秒内稳定，漂移 < 1 mV），则继续记录至最多 5 分钟]。
    7. 开始使用溶液 #5（ATP）进行灌注。记录 NPD 至少 1 分钟，直至获得峰值超极化反应。
    8. 重新开启溶液 #1（林格氏液）灌注，持续 30 秒以冲洗导管。
    9. 关闭溶液 #1 的灌注。
    10. 对左侧鼻孔重复上述操作步骤。

12. 测试结束

  1. 重新检查并记录稳定的指尖脉搏压差（“指端后”）持续 5 秒。
    1. 移除受试者皮肤上的表皮桥接装置以及穿刺部位的绷带。对于 AgCl/ECG 凝胶系统，从手臂上取下电极。
    2. 记录“最终闭环偏移”电压，方法同初始闭环偏移的测量（见步骤 7.1.3）。
    3. 使用功能键标记最终偏移值。
    4. 停止数据采集（按下“开始”）。
      注：当前标准操作程序建议使用 100 µM ATP 激活嘌呤能钙依赖性 Cl- 分泌，作为检测的阳性对照；但此为可选测试。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在正常的气道上皮中，Na+ 吸收是主要的离子转运活动。这导致相对于间质而言，气道表面电位差呈负值。灌注 ENaC 通道阻断剂阿米洛利后，电位差的负值减小。随后，用无 Cl- 溶液进行表层灌流，形成 Cl- 的化学梯度，使电位差变得更负，并激活所有 Cl- 转运体，包括 CFTR。异丙肾上腺素可升高细胞内 cAMP 水平，通过特异性激活 CFTR 进一步增加 Cl- 分泌，从而使电位差进一步增大。

相比之下，在囊性纤维化（CF）患者中，CFTR 缺失或功能异常导致由 ENaC 介导的 Na+ 吸收增加12。因此，基础电位差更负。使用阿米洛利（amiloride）后观察到的去极化程度更大，而在通过 CFTR 依赖性途径刺激 Cl- 分泌时，电位差几乎无变化或无任何变化。这一点可在 图8 的代表性记录曲线中看出，该图显示了“健康”与“CF”个体的记录曲线对比。

电生理图表，健康个体与F508del突变个体的电位差变化；阿米洛利、无氯/异丙肾上腺素阶段，研究分析。
图8：健康受试者与囊性纤维化（CF）受试者的代表性记录图。 PD：电位差，ΔAmiloride：阿米洛利引起的电位差变化，0 Cl-/Iso-：低氯环境：溶液#2灌注结束至溶液#4灌注结束期间电位差的变化，S1-S4：阶段1-4，图A和图B中的绿线表示鼻电位差（NPD）记录，黑箭头表示电位差的变化

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

体内，鼻电位差（NPD）提供了一种独特的可重复纵向测量方法，并且通过重复测量发现，在群体和个体层面上均能观察到相似的纵向结果14,15。大量证据表明，NPD在区分囊性纤维化（CF）与非CF个体方面具有优异的判别效度。25项研究一致证明，CF患者与健康对照者之间的Cl-和Na+电导存在统计学上显著差异10。尽管已有若干先前开发的指数具备这种区分能力，但鉴于近期方法学的标准化进展，我们预计有必要对这些指数进行新的更新7,8。

修改与故障排除

该检测需要多个关键步骤以确保测量结果的准确性。这包括对电极和导管进行闭环调零，以确保系统达到推荐的标准性能。患者必须保持静止，避免说话，以尽量减少伪影和导管移位。这使得该检测在不配合的患者中实施较为困难，且该技术在6岁以下儿童中的应用仅在一项研究中被报道过7。

鼻腔上皮的预检查是必要的，以确保上皮表面无结痂或黏液，因为这些因素可能影响测量结果。

非常重要的是，必须指出，导管放置位置的选择目前仍存在争议。本文所介绍的标准操作程序（SOP）采用在下鼻甲下方（IT）进行测量。在下鼻甲下方放置导管的方法已在多中心试验中实现标准化，因此推荐使用该技术。下鼻甲下方的测量使用侧孔导管进行，但在测量过程中，该导管可能难以在接触溶液的同时与鼻黏膜保持稳固接触。其他研究团队可能选择在鼻底进行电位差（PD）测量，该方法在技术上更为简便。重要的是，Vermeulen（2011）已证实，这两种方法具有可比性16。

关于溶液是否需要加温，欧洲和美国的研究中心之间仍存在争议17,18。有研究指出，将溶液温度从22 °C升至37 °C，可使观察到的总氯离子反应增加约25%，异丙肾上腺素依赖性氯离子反应增加约95%18。然而，加温会增加实验变异性，表现为总氯离子反应的标准差更大17。因此，由于加温溶液会额外引入变异性因素，除非研究设计特别要求，一般不建议对溶液进行加温。

我们此前比较了两种电极技术，发现AgCl电极和甘汞电极系统在正常受试者的基础电流和刺激后电流中表现相似13。

该技术的局限性

该检测存在显著的个体内变异。评分的变异性在图谱结果为不确定的患者中尤为常见，因此在诊断应用中应考虑这一因素19。影响变异性的因素包括急性上呼吸道感染、广泛的鼻息肉、既往鼻窦手术以及囊性纤维化相关的炎症，这些因素会降低 其特异性和敏感性20,10。此外，不同阅图者对图谱的解读可能存在差异，尽管专家阅图者在囊性纤维化和非囊性纤维化图谱的定量评分及可解读性方面表现出极好的一致性，但在图谱判读信心方面仍存在显著的变异性19。

内在变异性与显著性阈值

非常重要的是，如不同研究所表明的，该测量值的生理变异性相当显著10，例如CFTR基因治疗试验中，氯离子总转运量和阿米洛利作用范围的变化表现出显著差异21,22横断面评估表明，零氯- 高于-5至-7 mV阈值的异丙肾上腺素反应是区分囊性纤维化与非囊性纤维化受试者的临界值10.

然而，我们对于在使用疾病修饰疗法的II期临床试验中，代表有效CFTR校正的这一参数变化幅度仍缺乏明确的认识。为了评估个体反应，可能需要进行多次重复检测以监测干预措施的反应，从而将显著变化与内在变异性区分开来。尤为重要的是，未来针对疾病修饰药物的长期研究需要证明CFTR功能的改善与囊性纤维化疾病的临床相关结局或替代结局（如FEV1的改善）的改善相关。事实上，最近一项关于Ivacaftor的II期研究显示，尽管氯离子分泌仅有轻微改善，但仍表现出显著的临床获益23。

此类研究将有助于确定跨上皮氯离子（Cl-）电导的改善是否可作为临床获益的替代参数。这将是指导CFTR调节治疗药物研发的重要参数。

相较于现有方法的意义：汗液检测与肠道电流测量（ICM）

对于汗液 Cl- 浓度介于 30 至 60 mM 之间的“可疑”囊性纤维化患者，鼻电位差（NPD）综合评分提供了一种高灵敏度的工具，可用于将患者诊断为“很可能为囊性纤维化”和“不太可能为囊性纤维化”10。肠道电流测量（ICM）可对直肠上皮的净 Cl- 流动进行离体（ex vivo）检测，由于 CFTR 在该上皮中高度表达，因此该方法也可高灵敏度地测定残余 CFTR 功能。

考虑到CFTR调节剂对CFTR功能的调节作用，目前尚不明确这些不同CFTR生物标志物变化之间的关系。尽管近期基于伊伐卡托（Ivacaftor）的研究确定了鼻电位差（NPD）与汗液检测之间存在相关性4，但尚未明确呼吸道内的测量值是否比汗液检测24,25或ICM的变化更能预测呼吸系统结局。此外，调节药物在不同器官中的疗效也可能存在差异。关于鼻电位差（NPD）检测，需要注意的是，基础电位差（basal PD）和氨氯吡脒（amiloride）反应的变化反映的是Na+的转运，而0 Cl-和异丙肾上腺素（isoproterenol）反应的变化则反映Cl-的转运。目前尚不清楚这两者中哪一个对疾病改善更为重要。

该技术的未来应用

该技术的应用预期不仅限于囊性纤维化（CF）领域。由于该技术特别适用于检测钠离子（Na+）和氯离子（Cl-）通道功能，因此可应用于展示包括哮喘26、慢性支气管炎27、非囊性纤维化性支气管扩张28 以及复发性胰腺炎29在内的气道疾病中的离子通道功能障碍。此外，该技术的改良版本已被用于下气道（LAPD），以揭示患有慢性支气管炎的慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者中以下气道为主的CFTR功能异常30。

鼻电位差（NPD）提供了一种敏感的体内生物标志物，用于评估CFTR功能，既可用于囊性纤维化的诊断，也可用于转化医学研究中针对纠正CFTR和ENaC通道活性的概念验证研究。该方法可对跨上皮功能进行纵向评估，并有望作为一种个体化医疗策略，为每位囊性纤维化患者量身定制最有效的CFTR功能纠正方案。

披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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本研究得到了囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）功能工作组（标准化委员会，囊性纤维化临床试验网络，欧洲囊性纤维化学会）以及国家资源中心工作组（治疗开发网络，囊性纤维化基金会）的支持。此外，还获得了囊性纤维化基金会（Clancy FY09 项目资助 GMS）和美国国立卫生研究院（NIH，DK072482 项目资助 SMR 和 GMS）的额外资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
KD Scientific 注射泵（或同等产品 – 例如机构/医院提供的可编程注射泵）Fisher Scientific
Powerlab 4/30AD Instruments
BMA-200 交流/直流便携式生物放大器AD Instruments
BMA-200 配套的 IS0-Z 隔离前置放大器AD Instruments
兼容 Windows 的个人电脑 — 最低系统要求为 Windows XP 或更高版本Various
AD Instruments 软件：GLP Client V6（Windows）或更高版本AD Instruments
心电图电极（受试者接地用）医院标准
2 个微型甘汞参比电极Fisher Scientific13-620-79
氯化钾 KCl，颗粒状 – 符合美国药典（USP），分子量 76，数量：500 克Spectrum
无菌容器（如标本收集容器或类似容器），用于 KCl 甘汞电极浴，容器盖上需开孔以固定电极（若电极制造商未提供）医院标准
2 个电极：Ag/AgCl 8 mm TP 电极BIOPAC SystemsUNSHLD-EL258
2 个 Ag/AgCl 电极，B0194，插头 4 mmSLE Instruments
Signacreme® 导电电极膏Fisher ScientificParker Labs 货号 # 17-05
皮肤去角质装置PROMED FeelingRef 374901
Hi Di 541 M，金刚石尖牙科磨头Ash Instruments
Becton Dickinson PE 50 导管Fisher Scientific427411
Becton Dickinson PE 90 导管Fisher Scientific427421
硅胶导管，内径 0.062”，外径 0.095”Fisher Scientific508-007
Micropore 外科纸胶带（25 mm × 9.1 m）3M1530-1
Marquat 双腔导管 长度：80 cm；外径：2.5 mm；通道内径：0.8 mm；侧孔距导管尖端距离：2 mm。欧盟 NPD 标签协议：I0202USMarquatI0202US
1" × 10 码丝质胶带3M Durapore1538-1
静脉延长导管（30"，50/盒）International LimitedIMN30
三通止流阀（50/盒）MedexMX5311L
无菌注射器滤器（ANOTOP 25 无菌，50 个装；0.22-μm 或更小孔径滤器；或同等产品）Fisher Scientific09-926-7
Becton Dickinson Intramedic Luer 接头（20 G，用于连接 PE90，适用于研究现场制备的鼻导管）Fisher Scientific427564
Becton Dickinson 23 G，0.75” Vacutainer（“蝶形”）针头（0.6 mm × 19 mm；50 支/盒）（用于连接 PE50，适用于研究现场制备的鼻导管）Fisher Scientific367283
Becton Dickinson 60 mL 无针 Luer-Lok 接头注射器（40/盒）Fisher Scientific309653
Becton Dickinson 10 mL 无针 Luer-Lok 接头注射器（100/盒）Fisher Scientific309604
一次性无菌擦拭巾（根据机构供应情况）医院标准
70% 乙醇（1 品脱），Aaper Alcohol and Chemical Co. 货号 NC9274019（或同等产品）Fisher Scientific
Corning 一次性无菌瓶口滤器，孔径 0.22 μm（容积 0.15 – 1.0 L 可接受）Fisher Scientific430624
Buffer Cert pH 10.00（1 L Sn04332）– 用于 pH 计校准Fisher Scientific
Buffer Cert pH 4.00（1 L Sn04327）– 用于 pH 计校准Fisher Scientific
Buffer Cert pH 7.00（500 mL Sn04328）– 用于 pH 计校准Fisher Scientific
一次性防护垫（蓝色垫；23" × 36"，150/盒；或按医院标准同等产品）SureCare
23 G，0.75” Vacutainer “蝶形”针头（0.6 mm × 19 mm；50 支/盒）Becton Dickinson367283
Difco Laboratories 琼脂（Noble 100 g 0142-15-2；或同等产品）Fisher Scientific
Welch Allyn 鼻镜 71000-C（或同等产品）Fisher Scientific
Welch Allyn 可转换手柄电池 72300（或同等产品）或带电池的耳镜Fisher Scientific
头部和下颌托架（或同等产品；可选）Richmond Products, Inc629R
防静电抗疲劳地垫 （或同等产品）Fisher ScientificNo. 791
现场配制溶液所用试剂
氯化钠，颗粒状 – USP NaClSpectrum分子量：58；规格：500 克
氯化钙 CaCl2 •2H2O – USPSpectrum分子量：147；规格：500 克
六水合氯化镁晶体，MgCl2•6H2O – USPSpectrum分子量：203；规格：500 克
磷酸氢二钾，无水，颗粒状，KH2PO4 – USPSpectrum分子量：174；规格：500 克
磷酸二氢钾晶体 – 符合美国国家处方集（NF）（KH2PO4）Spectrum分子量：136；规格：500 克
葡萄糖酸钠- USP（单钠盐）Spectrum分子量：218；规格：500 克
葡萄糖酸钙 – USP（无水粉末）Spectrum分子量：430；规格：500 克
葡萄糖酸钾- USP（无水）Spectrum分子量：234；规格：500 克
七水合硫酸镁 – USP MgSO4•7H2OSpectrum分子量：246；规格：500 克
阿米洛利盐酸盐 – USPSpectrum分子量：302；规格：5 克
腺苷 5’-三磷酸（ATP）（二钠盐）Spectrum分子量：551；规格：5 克
六水合氯化镁，晶体 – USP MgCl2•6H2OSpectrum分子量：203；规格：500 克
双蒸水（ddH2O）医院药房分子量：NA；规格：1 L
异丙肾上腺素盐酸盐注射液 - USP 1 mg/5 mL 安瓿医院药房分子量：248；规格：单次使用
林格氏注射液，USP 或林格氏灌洗液医院药房分子量：NA；规格：5 L

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosenstein, B. What is a Cystic Fibrosis Diagnosis? Clinics in Chest Medicine. 19, 423-441 (1998).
  2. Rosenstein, B., Cutting, G. R. The Diagnosis of Cystic Fibrosis: A Consensus Statement: Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. The Journal of Pediatrics. 132, 589-595 (1998).
  3. Farrell, P. M., et al. Diagnosis of Cystic Fibrosis: Consensus Guidelines from the Cystic Fibrosis Foundation. The Journal of Pediatrics. 181, S4-S15 (2017).
  4. Mesbahi, M., et al. Changes of CFTR functional measurements and clinical improvements in cystic fibrosis patients with non-p.Gly551Asp gating mutations treated with ivacaftor. Journal of Cystic Fibrosis. 16, 45-48 (2017).
  5. Accurso, F., et al. Sweat chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (2), 139-147 (2014).
  6. Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in Persons with Cystic Fibrosis and the G551D-CFTR Mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
  7. Sermet, I., et al. Measurement of nasal potential difference in young children with an equivocal sweat test following newborn screening for cystic fibrosis. Thorax. 65 (6), 539-544 (2010).
  8. Wilschanski, M., et al. Mutations in the Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator Gene and In vivo Transepithelial Potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787794(2006).
  9. Sermet-Gaudelus, I., et al. Clinical Phenotype and Genotype of Children with Borderline Sweat Test and Abnormal Nasal Epithelial Chloride Transport. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (7), 929-936 (2010).
  10. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate endpoint? European Respiratory Journal. 14, 38(2013).
  11. US CFF-TDN (Cystic Fibrosis Foundation-Therapeutics Development Network) and the ECFS-CTN (European Cystic Fibrosis Society- Clinical Trials Network). Standard Operating Procedure 528.01. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). , (2014).
  12. Knowles, M., et al. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in CF. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1493 (1981).
  13. Solomon, G. M., et al. An international Randomised Multicentre Comparison of NPD Techniques. Chest. 138, 919-928 (2010).
  14. Sermet, I., et al. Chloride Transport in Nasal Ciliated Cells of Cystic Fibrosis Heterozygotes. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171, 1026-1031 (2005).
  15. Naehrlich, L., et al. Nasal potential difference measurements in diagnosis of cystic fibrosis: an international survey. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 24-28 (2014).
  16. Vermeulen, F., et al. Nasal potential measurements on the nasal floor and under the inferior turbinate: Does it matter? Pediatric Pulmonology. 46 (2), 145-152 (2011).
  17. Bronsveld, I., et al. Influence of perfusate temperature on nasal potential difference. European Respiratory Journal. 42, 389-393 (2013).
  18. Boyle, M., et al. A multi-center study on the effect of solution temperature on nasal potential difference measurements. Chest. 124 (2), 482-489 (2003).
  19. Solomon, G. M., et al. A Multiple Reader Scoring System for Nasal Potential Difference Parameters. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (5), 573-578 (2017).
  20. Beekman, J. M., et al. CFTR functional measurements in human models for diagnosis, prognosis and personalized therapy: Report on the pre-conference meeting to the 11th ECFS Basic Science Conference, Malta, 26-29 March 2014. Journal of Cystic Fibrosis. 13, 363-372 (2014).
  21. Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
  22. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38, 59-69 (2011).
  23. Accurso, F., et al. Sweat Chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and Ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (2), 139-147 (2014).
  24. Rowe, S., et al. Clinical Mechanism of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Potentiator Ivacaftor in G551D-mediated Cystic Fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (2), 175-184 (2014).
  25. Boyle, M., et al. A CFTR corrector lumacaftor and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 2 (7), 527-538 (2014).
  26. Schulz, A., Tummler, B. Non-allergic asthma as a CFTR-related disorder. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (5), 641-644 (2016).
  27. Sloane, P. A., et al. A pharmacologic approach to acquired cystic fibrosis transmembrane conductance regulator dysfunction in smoking related lung disease. PLoS One. 7 (6), e39809(2012).
  28. Bienvenu, T., et al. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Channel Dysfunction in Non-Cystic Fibrosis Bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (10), 1078-1083 (2010).
  29. Werlin, S., et al. Genetic and electrophysiological characteristics of recurrent acute pancreatitis. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 60 (5), 675-679 (2015).
  30. Dransfield, M. T., et al. Acquired Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Dysfunction in the Lower Airways in COPD. Chest. 144 (2), 498-506 (2013).

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CFTR ENaC

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