Summary
We beschrijven de evolutie van een sferoïde gebaseerde, driedimensionale in vitro model waarmee we kunnen testen van de huidige standaard voor experimentele therapie regimes voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom op cellijnen, die gericht zijn op het evalueren van therapie gevoeligheid en weerstand op primaire cellen van menselijke specimens in de toekomst.
Abstract
Huidige behandelingsopties voor geavanceerde en steeds terugkerende hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) omsluiten straling en chemo-straling benaderingen met of zonder chirurgie. Terwijl platinum gebaseerde chemotherapie regimes momenteel vertegenwoordigen de goudstandaard in termen van werkzaamheid en worden gegeven in de overgrote meerderheid van de gevallen, nieuwe chemotherapie regimes, namelijk immunotherapie zijn in opkomst. De berekening van responsrates en therapie resistentie mechanismen voor beide chemo regime zijn echter moeilijk te voorspellen en blijven onvoldoende begrepen. Brede variaties van chemo en straling resistentie-mechanismen zijn bekend tot op heden. Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een gestandaardiseerde, hoge-doorvoer in vitro assay beoordelen HNSCC cellijn reactie op verschillende therapie-regimes, en hopelijk op primaire cellen van individuele patiënten als een toekomstige instrument voor gepersonaliseerde tumor therapie. De bepaling is ontworpen om te worden geïntegreerd in de kwaliteit-gecontroleerde standaard algoritme voor HNSCC patiënten bij onze tertiaire care center; Dit is echter onderwerp van toekomstige studies. Technische haalbaarheid ziet er veelbelovend voor primaire cellen van de tumor Biopten van daadwerkelijke patiënten. Monsters worden vervolgens overgebracht naar het laboratorium. Biopten worden mechanisch gescheiden gevolgd door enzymatische spijsvertering. Cellen worden vervolgens gekweekt in ultra-lage wrijvingscoëfficiënt cel cultuur flesjes ter bevordering van de reproduceerbaar, gestandaardiseerde en spontane vorming van driedimensionale, sferoïde-vormige cel conglomeraten. Spheroïden zijn dan klaar om te worden blootgesteld aan chemo-straling protocollen en immunotherapie protocollen zo nodig. De grootte van de laatste cel levensvatbaarheid en sferoïde zijn indicatoren van therapie gevoeligheid en daarom in de toekomst te beoordelen van de patiënten waarschijnlijk therapie antwoord rekening konden worden getrokken. Dit model zou een waardevolle, kosten-efficiënte hulpmiddel naar gepersonaliseerde therapie voor hoofd en nek kanker.
Introduction
Hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) is de zesde gemeenschappelijkste kanker wereldwijd met een stijgende incidentie voor cutane humaan papillomavirus (HPV) infectie-geassocieerde pathogenese, naast een meerderheid van de gevallen veroorzaakt door buitensporige nicotine en alcohol verbruik 1,2. Terwijl kleinere tumoren en vooraf invasieve stadia meestal goed te behandelen met chirurgische excisie zijn, meestal in combinatie met cervicale lymfeklier dissectie, blijft behandeling voor geavanceerde-fase en terugkerende HNSCC uitdagend als gevolg van agressieve tumor invasie met metastatische verspreiding en weerstand tegen straling en chemotherapie protocollen3,4,5,6,7,8. Recente studies suggereren een hoge variabiliteit van cellulaire fenotype en sub karakterisering van circulerende en gedissemineerde tumorcellen is net begonnen9,10. De eerdere overtuiging van een solide, uniforme tumor massa moest worden herzien in het licht van de recente studies in het verleden jaar11,12,13,14. Huidige benaderingen voor de karakterisering van de tumor en identificatie van belangrijke mutaties kunnen het identificeren van verschillende genen die lijken te worden geassocieerd met therapie resistentie maar blijven een kosten-intensieve aanpak. Bovendien kennis met genotype niet noodzakelijkerwijs toe dat een betrouwbare voorspelling van fenotype en de reactie van de behandeling.
Er zijn weinig vorderingen bij het verbeteren van de algehele en ziektevrije overleving voor geavanceerde-fase en terugkerende ziekte. Nicotine - evenals virus-geassocieerde carcinoom, huidige behandelingsopties naast chirurgie plaatst u agressieve straling en chemotherapie platina gebaseerde regimes. Zijn er gevolgen voor verschillende respons tussen HPV-negatieve en positieve carcinoom; echter dit is nog niet leiden tot een wijziging in het algemeen therapie richtlijnen. Weerstand naar de bestraling en chemotherapie is een wijdverspreid fenomeen in alle stadia van de tumor en bestaat voor platina gebaseerde chemotherapie alsook voor gerichte therapie (Anti-EGFR; epidermale groeifactor-receptor) en onlangs opkomende checkpoint remming15. Ineffectief bestraling en chemotherapie komt op een hoge kosten van significante patiënt morbiditeit in termen van dysfagie, mucositis, droge mond en risico daling van renale of cardiale functie onder anderen. Voorspellen van therapie antwoord vóór lijkt het besluit van een algemene therapie-concept voor elke individuele patiënt het cruciale doel, het voorkomen van geen onnodige behandeling concepten, de bijwerkingen en de kosten.
Wij willen een model om te testen van de individuele patiënt behandeling gevoeligheid naar huidige standaard chemo-straling die kan worden geïntegreerd in het algoritme van de regelmatige en kwaliteit-gecontroleerde oncologische behandeling van een technische staande punt vestigen. De verre doel was om het gebruik van het model zonder het gebruik van sterk veranderde en leeftijd cellijnen, als ze slecht werkelijke menselijke tumorcellen zonder hun variabiliteit vertegenwoordigen en heterogeniteit zoals we nu, terwijl de vaststelling van het protocol weten werd gedaan in verschillende cellijnen. Om onafhankelijk te zijn alleen van commercieel beschikbare cellijnen, wij onlangs met succes gegenereerd een tussenliggende cellijn genaamd "PiCa" uit primaire HNSCC cellen van menselijke tumor exemplaren met geconserveerde cellulaire markeringen op het oppervlak en beperkte passages 16. deze PiCa cellijn dient als voorbereiding op de ontwikkeling van het model op de weg om vervolgens te proeven met verse menselijke kankercellen van tumor biopsieën later volgen. Het is aangetoond dat cellen in drie-dimensionale cel culturen anders reageren en meer in-vivo-beheer van kanker medicijnen dan die groeien in monolayers17,18,19,20 willen ,21, voornamelijk te wijten aan de instandhouding van migrerende en sub differentiatie eigenschappen van bepaalde cel subsets22,23,24. Hier beschrijven we het protocol van een sferoïde gebaseerde, driedimensionaal model van tussenliggende cellijnen en primaire menselijke plaveiselcelcarcinoom cellen en manieren hoe een dergelijk model in de behandeling van kanker van het hoofd en de nek chirurg en oncoloog ( integreren Figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studies aangetoond in dit manuscript, namelijk het gebruik van menselijke tumor specimens, zijn beschermd onder en in toestemming met voorafgaande beslissingen van universiteit geneeskunde van Mainz/Universiteit van München Medical Center ethisch comité. Patiënten hebben geïnformeerde toestemming volgens de nationale wettelijke bepalingen akkoord te gaan met wetenschappelijk gebruik van overtollige biologisch materiaal dat werd verkregen in de loop van hun behandeling gegeven. Onderzoek is uitgevoerd met inachtneming van alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het menselijk welzijn.
1. het nemen van een Tumor biopsie van hoofd en Heck plaveiselcelcarcinoom
- Uitvoeren van algemene (propofol en/of Sevofluraan, spier ontspannen agent) of lokale infiltratie (2% ultracaine, adrenaline) / oppervlakte (xylocaine) verdoving in de operatiekamer of kno onderzoek stoel. Visualiseren van de massa van de tumor in de orale holte/keelholte/strottenhoofd/andere delen van de bovenste spijsvertering en respiratoire tractus met standaard operationele instrumenten en, indien nodig, onder de Microscoop.
- Neem een biopsie verse tumor vanuit de periferie van de kanker laesie met botte of snijdende instrumenten. Vermijd het midden van de laesie vanwege overvloedige necrose op dit gebied. Het verkregen weefsel aan een steriele container met isotone natriumchlorideoplossing plaatsen
- Voer na de biopsie, hemostase zo nodig, bijv., met een bipolair of monopolaire coagulatie apparaat naast het gebruik van vasoconstrictive stoffen.
- Breng de biopsie van de tumor die bestemd zijn voor cel cultuur experimenten rechtstreeks naar de aangrenzende laboratorium tractus. Andere tumor biopsieën verzenden door de patholoog zoals gebruikelijk aan het uitsluiten van kanker.
- Zorg ervoor dat een laboratoriumtechnicus klaar is voor het verwerken van het specimen direct.
2. verwerking van de Tumor Specimen
- Plaats van de tumor specimen op een geschikte en steriele ondergrond en het grondig met een steriel scalpel voor eenmalig gebruik in zo weinig mogelijk stukjes gesneden.
Let op: Controleer of de status van besmettelijke en bloed overdraagbare ziekten is goed gedocumenteerd en de technicus in de aandacht van de instellingen standaard protocollen om te voorkomen dat naald stok of snijden letsel met potentieel biohazard patiënt materiaal en de protocollen te volgen na mogelijke verwonding. - Na voldoende mechanische scheiding van het primaire weefsel, zet het weefsel in een flesje met Collagenase ik / II en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Zeef door een 70 µm falcon cel zeef en wassen van de vering met Hanks evenwichtige zoutoplossing (HBSS).
-
Na de succesvolle scheiding en latere wassen, plaats de schorsing met 1-2 × 106 cellen in een T75 cel cultuur kolven (75 cm2) te groeien naar sub-confluentie 5% CO2 en een temperatuur van 37 ° C. Deze stap kan tot 10 dagen duren.
- Gebruik van speciale Keratinocyt kweekmedium dat bestaat uit de volgende: 125 mL Dulbecco gewijzigd van eagles medium (DMEM), 250 mL Keratinocyt aangevuld voedingsbodem (aangevuld medium bestaande uit 500 mL Keratinocyt SF Medium, 15 mg van boviene hypofyse uittreksel (BPE), 2,5 mL penicilline/streptomycine, 150 ng recombinante menselijke epitheliale groeifactor (EGF), 516 µL van 300 mM CaCl2, voorraad mix worden van tevoren voorbereid), 125 mL van F12 nutriënten mix, 10 mg voor BPE (0,75 mL), 75 ng recombinante menselijke EGF (2 µL) , 3,75 mL 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide (tabel van materialen).
3. zaaien de cellen in ultra-lage wrijvingscoëfficiënt cel cultuur platen
- Bevestig de celgroei tumor onder een microscoop. De cellen in cultuur tellen (primaire of cel cultuur) en zaad van 5.000 primaire tumorcellen of 1000 en 2000 cellen van tussenliggende cellijn / andere cellijn in 200-300 µL van media (stap 3.2.) in een ultra-lage wrijvingscoëfficiënt plaat met concaaf, ronde bodems (96-Wells).
-
Cultuur van de cellen bij 5% CO2 bij 37 ° C en in gelijke delen DMEM en airway epitheliale cel medium (BEGM), foetaal runderserum 10%, 1% penicilline/streptomycine, 1% natrium pyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% L-glutamine (stap 2.3.). Als cellijnen worden gebruikt, is media op basis van de DMEM volstaat.
- Uitvoeren van wijzigingen van de media om de andere dag. Let niet op de sferoïde met de pipet tijdens media wijzigingen gecombineerd. De spheroïden cultuur tot op het niveau van de groei, zoals beschreven in punt 3.3 is bereikt (ongeveer 7-10 dagen).
- Bevestig spontane sferoïde vorming onder de Microscoop door op zoek naar driedimensionale, sferoïde-vormige cel conglomeraten. Sluiten de putjes met onregelmatige en/of meerdere sferoïde vorming van verder onderzoek.
Opmerking: Spheroïden zichtbaar moeten zijn met het blote oog, ook verdere verwerking en media wijzigingen zoals beschreven hieronder te vergemakkelijken.
4. spheroïden op multimodale standaard of experimentele Tumor therapie bloot
- Kies een gewenste therapie-regime. Het ontwerp van voldoende grote controlegroepen waarmee vergelijkingen van behandelingen om onbehandeld spheroïden of spheroïden ontvangen van slechts gedeeltelijke therapie regimes, bv. straling alleen. De grootte van de controlegroepen hangt af van het ontwerp van de experimentele groep en niet universeel worden gedefinieerd.
- Uitwisseling van de media aan media met additieven, zin media met chemotherapeutica en/of monoklonale antilichamen op de gewenste concentraties. Voeg cisplatine bij de concentraties van 2,5/5/10 µM of 5-fluoruracil (5FU) bij 30 µM.
Opmerking: Voor hoge doorvoer experimenten of grote groep maten/groot aantal groepen, kan men een geautomatiseerde pipetting robot gebruiken wij verdere oprichten in de experimenten. - Als alternatief, stralen de cel cultuur platen met spheroïden op 2 Gy met behulp van een geschikte straling faciliteit.
Let op: Eerbiediging van de instelling protocollen met betrekking tot preventie van schadelijke straling blootstelling van de werknemers. Werken alleen met aangewezen en opgeleide technici volgens richtlijnen van de bescherming van de straling. Indien gewenst, voeg chemotherapeutica zoals beschreven onder 4.2. daarna. - Incubeer de cellen gedurende 24 uur in de eerder beschreven kweekomstandigheden (37 ° C, stap 3.2).
- Na de incubatie, blijven de celcultuur gedurende ten minste 6 dagen met media wijzigingen om de andere dag.
5. beoordeling van sferoïde grootte en omvang van cellulaire proliferatie voor Assay uitlezing
- De sferoïde grootte meten in termen van gebied na digitale foto documentatie op dag 6 (dag 10, dag 16) met een grafische software (parameter 1).
- Na centrifugeren bij 520 x g gedurende 2,5 min van de plaat, verwijder de bovendrijvende substantie. Wassen van de cellen met voldoende hoeveelheid 1 x PBS en centrifuge die de plaat opnieuw zoals beschreven, gevolgd door het verwijderen van het supernatant (PBS).
- Voeg 100 µL van enzymatische cell detachement oplossing aan elk flesje om de spheroïden te ontbinden. Incubeer de plaat gedurende 8 minuten bij 37 ° C.
- Selectievakje voor succesvolle ontbinding van de sferoïde onder de Microscoop. Voeg 100 µL van DMEM. Centrifugeer de plaat bij 520 x g gedurende 2,5 min. Verwijder het supernatant en opschorten van de cellen in 100 µL van DMEM.
- Een commercieel beschikbare colorimetrische proliferatie assay, bij voorbeeld WST-8 test op elke flacon volgens van de instructies van de fabrikant25uitvoeren De bepaling in een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) lezer (parameter 2) voorgelezen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We waren in staat om te spheroïden van eencellige schorsingen, reproducibly eerst te genereren uit verschillende cellijnen, met inbegrip van de propriëtaire PiCa cellijn, later van primaire menselijke kankercellen afgeleid van verse tumor biopsieën, zoals beschreven in Hagemann et al. . 26. we twee gevestigde methoden geëvalueerd voor sferoïde generatie; de twee zijn de zogenaamde opknoping neerzetten (HD) methode en de methode van ultra-lage wrijvingscoëfficiënt (ULA), de laatste is degene die meer effectief en veilig. We waren in staat om te wijzen op de voordelen van de methode van de ULA vergeleken naar HD, met inbegrip van snellere sferoïde groei, minder problemen met plaat handling, daaruit voortvloeiende verlies van spheroïden met zware trillingen en meer reproduceerbare sferoïde groei in termen van uniformiteit ( Figuur 2). Het voorkomen van meerdere spheroïden per flacon was gemeenschappelijker in de HD-methode. Wij gecontroleerd voor een duidelijker karakterisering van sferoïde morfologie. Figuur 3 toont een Immunochemie kleuring voor Ki67, een marker van de proliferatie, van een sferoïde uit PiCa cellen. Zoals beschreven in de literatuur, bestaan spheroïden uit een minder prolifererende kern met een delende buitenlaag, het nabootsen van verschillende regio's van de proliferatie van stevige HNSCC bij de mens. In vitro als in vivo, dit is vermoedelijk veroorzaakt door een gradiënt van voedingsstoffen en zuurstof geleverd door de cel cultuur media veroorzaakt een daling van de periferie naar het midden van de tumor.
Vervolgens probeerden we te laten zien dat de bepaling is kundig voor speurder variaties in sferoïde grootte na de incubatie met chemotherapeutische geneesmiddelen of blootstelling aan ioniserende straling, twee gemeenschappelijke standaard behandeling regimes hier als vertegenwoordiger voor HNSCC. Voordat u eventueel de bepaling te integreren in een routine van de voorbehandeling, zou de validatie van de gevoeligheid van de test een voorwaarde zijn. Twee parameters zijn beschikbaar als eindpunt van de bepaling: sferoïde grootte (gebied; met de parameter 1 uit stap 5.1.) en proliferatie (zie parameter 2 vanaf stap 5.4.), wordt de markering van een surrogaat voor de levensvatbaarheid van de cellen en het groeipotentieel na therapie. De resultaten van de studies van de behandeling met gemeenschappelijk chemotherapeutische en chemo-straling protocollen worden weergegeven in Figuur 4. Blootstelling en incubatie van de spheroïden met cisplatine of 5FU geleid tot een aanzienlijke vermindering in groeisnelheid na verloop van tijd in vergelijking met een onbehandelde controlegroep (p< 0,001). Straling met 2Gy was in staat om groeisnelheid op een significante wijze (p< 0,01). De overleving assay (WST-8) was kundig voor speurder een extra, significante waarde van chemo-straling met cisplatine ten opzichte van straling alleen (p = 0,017), een eerder onopgemerkt verschil in de beoordeling van sferoïde grootte. Dit onderstreept het belang ervan voor de assay als geheel, zijvlakken van de gevoeligheid voor pasmunten therapie antwoord.
Figuur 1: Concept van een model op de weg naar toekomstige gepersonaliseerde therapie. Patiënten met beide achtergrond van mucosal HPV-infectie en/of geschiedenis van tabak en alcohol misbruik aanwezig is om onze tertiaire verwijzing zorg centrum voor vermoedelijke diagnose van kanker van het hoofd en de nek. Biopten van verdachte mucosal gebieden of macroscopische tumor massa worden genomen onder verdoving teneinde de diagnose. Bovendien nemen we tumor biopsieën voor het genereren van driedimensionale sferoïde-vormige celculturen in het laboratorium. Bij voldoende groei van de primaire-cel op basis spheroïden blootstellen we hen aan de huidige standaard of experimentele behandeling regimes om te testen voor individuele therapie antwoord. Verdere analyses van genetische of moleculaire varianten kunnen worden toegevoegd na analyse van de resultaten van de therapie. Therapie resultaten in vitro kan worden getrokken in aanmerking voor het proces van planning therapie concepten voor de patiënt. Dit cijfer is herdruk van Hagemann, J. et al. 26, met toestemming verleend door auteurs en journal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: alle cellijnen betrouwbare spheroïden kunnen genereren; verschillen in grootte en tijd voor uitlezing zijn volgens figuur 1. In voorbereidende experimenten vormden primaire cellen geen reproduceerbare spheroïden in HD maar ULA platen (linksonder). Verdere studies moeten worden verricht om te evalueren sferoïde groei kenmerken van primaire cellen. Het aantal cellen aan de rechterkant is het eerste aantal cellen in het flesje om te vormen van een sferoïde zetten. Dit cijfer is herdruk van Hagemann, J. et al. 26, met toestemming verleend door auteurs en journal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Ki67 Immunochemie kleuring van een sferoïde segment (PiCa). De periferie van de cultuur toont veel hogere proliferatie tarieven dan centrale cellen, het nabootsen van nutriënten distributie in stevige mucosal tumors die vaak Toon necrotische kernen. Dit cijfer is herdruk van Hagemann, J. et al. 26, met toestemming verleend door auteurs en journal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: therapie studies. (A) PiCa cellen werden verbouwd voor het genereren van spheroïden (n = 12 per groep) in ULA platen. Cellen werden gestimuleerd volgens het protocol met beide PBS controle, cisplatine op 5 µM of 5FU op 30 µM. grootte van de spheroïden werden bepaald op dag 6, 10 en 16 volgens standaardprotocollen. Cisplatine en 5FU behandeling geleid tot een aanzienlijke afname van de grootte (p-waarden worden gegeven op de linker onderkant in sectie (B) identieke proefopzet zoals in (A) (n = 12), maar met extra straling van 2Gy. (C) Plot toont min tot max. Volgens de p-waarden in de (C), eerdere straling met 2Gy leidde tot een aanzienlijke afname van de sferoïde grootte in de controlegroep, imiteren van radiotherapie en het tonen van straling gevoeligheid van PiCa cellen. Straling in combinatie met cisplatine behandeling leidde niet tot een verdere aanzienlijke afname van de grootte van de sferoïde (p> 0,05). Perceel toont min tot max. (C) berekend van p-waarden uit 2-way ANOVA-analyse van experimenten A en B. (D) WST8 assay uitgevoerd op dag 16 als alternatief voor planimetrische (gebied) analyse van de spheroïden. WST8 analyses werden kundig voor speurder een significante afname in levende cellen na chemo-straling (straling van de 2Gy en cisplatine) in vergelijking met cisplatine alleen (p = 0,017), vandaar tonen het voordeel van het combineren van zowel planimetrische analyse en WST8 colorimetrische bepaling op het moment van assay uitlezing. Perceel toont min tot max. Dit cijfer is herdruk van Hagemann, J. et al. 26, met toestemming verleend door auteurs en journal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We waren in staat om een protocol voor het genereren van reproduceerbaar spheroïden van cel schorsingen, voor beide cellijnen, en voorbereidende experimenten, primaire tumor van de menselijke cellen. We eerst beoordeeld van de twee eerder beschreven methoden en de ULA-methode, een methode waar cultuur platen met ultra-lage wrijvingscoëfficiënt oppervlakken worden gebruikt, zijn de veiliger en betrouwbaarder voor de generatie van uniforme driedimensionale spheroïden geïdentificeerd. Door het combineren van twee aparte methoden voor kwantitatieve analyse uitlezing (grootte/gebied en cel levensvatbaarheid), is deze multimodale assay voldoende gevoelig zijn voor het identificeren van de kleine verschillen tussen de groepen. Dit is de eerste stap naar het bewijs van technische haalbaarheid voor latere integratie van de bepaling in de klinische traject bij onze tertiaire care center. In de toekomst kan worden gebruikt om (i) het beoordelen van individuele tumor gevoeligheid voor gemeenschappelijke eerste - of tweede-/ derde-lijn therapie protocollen (chemo-reagentia, straling) en experimentele therapie protocollen, (ii) verder karakteriseren de tumorcellen van verse exemplaren en moleculaire oppervlakte of cytoplasmatische patronen therapie antwoord correleren. Spheroïden van specimens afkomstig uit verschillende tumor lokalisaties, bijvoorbeeldprimaire en lymfeklier metastase, zijn denkbaar.
Tijdens de oprichting van het protocol en de methode, hebben we verschillende bekende cellijnen, een paar wordt gevestigde decennialang gebruikt. De loutere leeftijd van de cellijnen verhoogt de twijfel van hun verbinding en vergelijkbaarheid om de huidige werkelijke menselijke tumorcellen, vermoedelijk na het verlies van verschillende eigenschappen en keurmerk moleculaire merkers. Resultaten uit in vitro experimenten waren moeilijk te reproduceren in mens of in vivo proeven27. We daarom gericht op een cellijn recentelijk gegenereerde uit menselijke primaire tumorcellen in onze faciliteit, die is goed gekarakteriseerd16. Met deze cellijn PiCa, we waren in staat om uit te voeren behandeling experimenten op een grotere schaal en huidige therapie verwachtingen bevestigd. Dit ondersteunt de theorie dat cellen van PiCa weerspiegelen werkelijke menselijke tumor gedrag beter dan andere, meer oud en gepasseerd cellijnen die onderging talrijke passages. Cellen die kunnen ondergaan niet-fysiologische selectie als gevolg op lange termijn in vitro omstandigheden kunnen chemo-straling gevoeligheid bias. In recente experimenten bevestigd we de haalbaarheid met primaire cellen met betrekking tot de vorming van de betrouwbare sferoïde; echter, moeten verdere en grotere experimenten worden uitgevoerd voordat het zijnde kundig voor uitvoering van de bepaling in klinische routine.
Er wordt verondersteld dat spheroïden en driedimensionale celcultuur in het algemeen reageren anders in vergelijking met conventionele 2D-cultuur wanneer blootgesteld aan chemotherapeutische geneesmiddelen of straling 28. De architectuur van spheroïden leidt tot een helling van zuurstof en voeding levering van buitenoppervlak aan core, en recente studies hebben aangetoond dat drug levering aan verschillende delen van de drie-dimensionale cel cluster ook niet uniform29 is. Bovendien lijken cellen in sferoïde cultuur te behouden bepaalde gen expressiepatronen die zijn gekoppeld aan medicamenteuse resistentie bij dieren modellen 30. Wij stellen voor dat ook zogenaamde straling weerstand, een functie die is gekoppeld aan het hoofd en de nek kanker bij vele patiënten, is een resultaat van cel-cel interactie en verschillende microenvironments leiden tot variaties in de zuurstoftoevoer en metabole activiteit. Dit fenomeen kan worden geïmiteerd in spheroïden als gevolg van een toegenomen in vivo -functionaliteit. Kortom, kunnen het gebruik van primaire cellen en de generatie van spheroïden laten te behouden zo veel als mogelijk kenmerken van in vivo tumorgroei in combinatie met een kosten-efficiënte assay voor het bestuderen van individuele therapie antwoord.
Er zeker zijn beperkingen met betrekking tot de aanpak. Tot op heden, is het onbekend hoe cellen uit verschillende individuele patiënten zal presteren in de bepaling wordt blootgesteld aan de behandeling van de tumor en hoe voorspellende de bepaling is in termen van correlatie met latere therapie uitkomst. Buitensporige studies zijn nodig om gewoon vergelijken de prestaties in vitro vs. klinische cursus. O.a. namelijk twee factoren dragen bij aan de onzekerheid: tumor heterogeniteit en gebrek aan mede cultuur met stromale en immuun cellen. Heterogeniteit van de tumor is een niet volledig begrepen verschijnsel en bestaat tussen verschillende subsites van de primaire, alsmede tussen primaire en metastatische lokalisatie12. Sinds de recente studies, is er een derde site waar zeer verschillende en gespecialiseerde tumorcellen kunnen bestaan en zegevieren in nissen: bloed en beenmerg zijn in staat om het huis circuleren en gedissemineerde tumor cellen9,10. Het ontbreken van andere celtypes zoals stromale cellen en T-cellen (als vertegenwoordiger voor het immuunsysteem) in celkweek is niet beperkt tot de bepaling, maar een geldige nadeel van de meeste in vitro tests bestuderen van tumor therapie gevoeligheid. In het licht van recente drug goedkeuringen en lopende studies die van invloed zijn T-cel-respons, moeten toekomstige experimenten voor drugontdekking plaatsvinden in een combinatie van verschillende tests en methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door een subsidie van de Universiteit van München (FöFoLe project-nr.: 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
- Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
- Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6 (2012).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
- Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
- Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
- Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
- Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters' significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
- Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
- Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
- Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
- Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
- Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
- Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540 (2013).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
- Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
- Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
- Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527 (2012).
- Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
- Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies? PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
- Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
