Terapia de testes em um modelo de cultura celular 3D baseado no Spheroid para cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas

Summary

Descrevemos a evolução de um modelo tridimensional, esferoide-baseado em vitro que permite-nos testar o padrão atual de regimes de terapia experimental para cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas na linha de celular, com o objetivo de avaliar a terapia susceptibilidade e resistência em células primárias de espécimes humanos no futuro.

Abstract

Opções atuais do tratamento para avançados e recorrente de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) Coloque a radiação e quimioterapia-radiação abordagens com ou sem cirurgia. Enquanto esquemas de quimioterapia baseados em platina, atualmente, representam o padrão ouro em termos de eficácia e são dadas na grande maioria dos casos, novos regimes de quimioterapia, ou seja, imunoterapia estão surgindo. No entanto, as taxas de resposta e mecanismos de resistência de terapia para qualquer regime de quimioterapia são difíceis de prever e permanecem insuficientemente compreendida. Grandes variações dos mecanismos de resistência a quimioterapia e a radiação são conhecidas até à data. Este estudo descreve o desenvolvimento de um ensaio padronizado, elevado-throughput em vitro para avaliar a resposta da linha celular HNSCC para diferentes regimes de terapia e espero que em células primárias de pacientes individuais como futura ferramenta para tumor personalizado terapia. O ensaio é projetado para ser integrado o algoritmo padrão de controle de qualidade para pacientes com HNSCC em nosso centro de atendimento terciário; no entanto, este será o tema de estudos futuros. Viabilidade técnica parece promissor para as células primárias de biópsias de tumor de pacientes reais. Amostras são então transferidas para o laboratório. Biópsias são mecanicamente separadas seguido por digestão enzimática. Então, as células são cultivadas em frascos de cultura de células de ultra baixa adesão que promovem a formação reprodutível, padronizada e espontânea dos conglomerados de células tridimensionais, em forma de esferoide. Esferoides então estão prontos para ser exposto a protocolos de quimioterapia-radiação e protocolos de imunoterapia conforme necessário. O tamanho de viabilidade e esferoide de final de célula são indicadores de susceptibilidade de terapia e, portanto, poderia elaborar-se em consideração no futuro para avaliar a resposta do provável terapia dos pacientes. Este modelo pode ser uma ferramenta valiosa, custo-eficiente para terapia personalizada para câncer de cabeça e pescoço.

Introduction

Cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) é o sexto mais comum de câncer em todo o mundo com uma incidência crescente de patogénese associada a infecção da mucosa papilomavírus humano (HPV), ao lado de uma maioria de casos causados por álcool e nicotina excessiva consumo de ^1,2. Enquanto tumores menores e estágios pre-invasoras são geralmente bem tratáveis com excisão cirúrgica, geralmente combinado com dissecação de linfonodo cervical, o tratamento para estado avançado e recorrente HNSCC permanece desafiador devido à invasão de tumor agressivo com disseminação metastática e resistência à radiaçã....

Protocol

Todos os estudos mostrados neste manuscrito, ou seja, a utilização de amostras de tumor humano, estão protegidos sob e em consentimento com decisões anteriores da Universidade de medicina de Mainz/Universidade da Comissão de ética médica de centro de Munique. Pacientes deram o consentimento informado, de acordo com as diretrizes legais nacionais concordando para uso científico de excesso de material biológico que foi obtido no decorrer de seu tratamento. Pesquisa foi realizada em conformidade com todas as orientações institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano.

1. tendo uma biópsia de Tumor de cabeça e Carcinoma de célu....

Results

Fomos capazes de gerar reproducibly esferoides de suspensões de célula única, primeiro a partir de linhas de células diferentes, incluindo a linha de celular proprietária da PiCa, depois a partir de células de câncer humano primário derivado de biópsias de tumor fresco conforme descrito em Hagemann et al . ²⁶. foram avaliados dois métodos estabelecidos para a geração de esferoide; os dois sendo o so-called enforcamento cair (HD) método e o método de ultra .......

Discussion

Fomos capazes de estabelecer um protocolo para gerar esferoides reprodutíveis de suspensões celulares, para ambas as linhas de célula e, em experimentos preliminares, as células do tumor primário humano. Nós primeiro avaliados dois métodos anteriormente descritos e identificado o ULA-método, um método onde as placas de cultura com ultra baixa aderência são utilizadas, para ser a mais segura e confiável para a geração de esferoides tridimensionais uniformes. Combinando dois métodos distintos para a leitura do ensaio (tama.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Meio de Eagles modificado com Dulbeccos (DMEM)	Biochrom, Berlim, Alemanha	F 0425
Soro fetal bovino	Gibco Life Technologies, Paisley, Reino Unido	10500-064
penicilina/estreptomicina	Biochrom, Berlim, Alemanha	A2212
piruvato de sódio	Biochrom, Berlim, Alemanha	L0473
aminoácidos	não essenciaisBiochrom, Berlim, Alemanha	K0293
L-Glutamina	Biochrom, Berlim, Alemanha	K0293
Liberase	Roche Life Sciences, Basel, Suíça	5401127001
Plataforma de Cultura e Ensaio 3D GravityPLUS	InSphero, Schlieren, Suíça	PB-CS 06-001
Placa GravityTRAP	InSphero, Schlieren, Suíça	PB-CS-01-001
Placas de cultura de fixação ultrabaixa (ULA)	Corning, Corning, NY, EUA	4520
meio de crescimento de células epiteliais das vias aéreas	Promocell, Heidelberg, Alemanha	C-21060
anfotericina B	Biochrom, Berlim, Alemanha	A 2612
mistura de suplemento de meio de crescimento de células epiteliais das vias aéreas	Promocell, Heidelberg, Alemanha	C39165
Teste WST-8	Promocell, Heidelberg, Alemanha	PC PK-CA705-CK04
Queratinócito SFMedium + L-Glutamina 500mL	Invitrogen	#17005-034
Extrato de hipófise bovina (BPE), 25mg	Invitrogen	#37000015 Fator de
crescimento epitelial humano recombinante 2,5 µ g	Invitrogen	#37000015
DMEM Alta Glicose	Invitrogen	#21068-028
Penicilina Estreptomicina 10000U/mL Penicilina/ 10000µ g/mL Estreptomicina	Invitrogen	#15140-122
F12 Nutrient Mix	Invitrogen	#21765-029
Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide em NaCl)	Invitrogen	#35050087
HBSS (Ca, Mg)	Life Technologies	#14025-092	(sem vermelho de fenol)
1x Enzima TrypLE Expres	Invitrogen	#12604-013	(sem vermelho de fenol)
Accutase (solução de desprendimento de células enzimáticas)	Tecnologias celulares inovadoras	Cat# AT104
70 µ m Filtro de células Falcon	BD Biosciences, EUA	#352350