Mecanismos epigenéticos são frequentemente alterados no glioma. Imunoprecipitação da cromatina pode ser usada para estudar as consequências de alterações genéticas no glioma que resultam de mudanças nas modificações do histone que regulam a transcrição de gene e a estrutura da cromatina. Este protocolo descreve imunoprecipitação da cromatina nativa na neurospheres de tumor murino de cérebro.
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Artigo de método
Imunoprecipitação da cromatina nativa usando Neurospheres de Tumor de cérebro murino
Neste artigo
Resumo
Resumo
Modificações epigenéticas podem estar envolvidas no desenvolvimento e progressão de glioma. Mudanças na metilação e acetilação de promotores e regiões reguladoras de oncogenes e supressores de tumor podem levar a mudanças na expressão gênica e desempenham um importante papel na patogênese de tumores cerebrais. Imunoprecipitação da cromatina nativa (ChIP) é uma técnica popular que permite a detecção de modificações ou outras proteínas rigidamente vinculadas ao DNA. Em contraste com o reticulado ChIP, no ChIP nativo, as células não são tratadas com formaldeído para ligar covalentemente proteínas para DNA. Isto é vantajoso, porque às vezes reticulação pode fixar as proteínas que apenas transitoriamente interagem com o DNA e não têm significado funcional na regulação gênica. Além disso, os anticorpos geralmente são disparados contra péptidos não fixados. Portanto, a especificidade do anticorpo é aumentada em ChIP nativo. No entanto, é importante manter em mente que o ChIP nativo só é aplicável para estudar as histonas ou outras proteínas que se ligam firmemente ao DNA. Este protocolo descreve a imunoprecipitação da cromatina nativa na neurospheres de tumor murino de cérebro.
Introdução
Eventos epigenéticos são frequentes em gliomas e provavelmente desempenham um papel importante na patogênese do tumor. Com efeito, em pediátrica glioma de alto grau, mutações em genes que codificam as variantes de histona H3.3 e H3.1 ocorrem com frequência1. As mutações afetam modificações do histone e tem importantes consequências epigenéticas2,3. No adolescente ao espectro de adulto, mutações recorrentes isocitrato desidrogenase gene 1/2 (IDH1/2), uma mutação que inibe a histona dependente de α-KG e DNA de-methylasaes e alterações genéticas em outros reguladores de cromatina como ATRX....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Michigan e institucional Cuidado Animal.
1. geração de tumor cerebral NS e as condições de cultivo.
- Prepare o meio de células-tronco neurais (NSC) com de Dulbecco suplemento modificado águia médio/F12B27 (1x), suplemento de N2 (1x) e um reagente antimicrobiano. Suplemento médio NSC no dia de uso com humano recombinante fator de crescimento endotelial (EGF) e fator de crescimento fibroblástico-basic (FGF) em uma concentração final de 20 ng/mL cada.
- Induzi o tumor cerebral no mouse usando o sistema de transposon de bela adormecida....
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Resultados
Uma representação esquemática de tumor NS gerados a partir de um tumor cerebral, onde as células do tumor de cérebro são Katushka positiva é apresentada na Figura 1. A Figura 2 é uma representação esquemática da técnica ChIP inteira. A Figura 3 mostra os resultados representativos da cromatina de tumor cerebral NS digerido com MNase para 12 min, rendendo uma maioria de mono, di- e tri-os nucleossomas.......
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Discussão
O protocolo aqui apresentado permitirá que o usuário realizar ChIP nativo no NS derivada de tumores cerebrais geneticamente modificados. Em contraste com o cross-linking do ChIP, este protocolo é limitado para o estudo de proteínas que associam firmemente com DNA6. O número de células utilizado pode ser modificado conforme necessário e o protocolo pode ser ampliado. Nós usamos 1 X 106 células por IP, no entanto, o ChIP nativo também pode ser efectuado com tão pouco quanto 4 x 104
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo National institutos de saúde nacional Instituto de doenças neurológicas & Stroke (NINDS/NIH) subvenções R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 para M.G.C.; NINDS/NIH concede R01-NS076991 e NS082311-R01 R01-NS096756 a P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; o departamento de neurocirurgia; Leah está feliz corações e Chad embora Foundation para M.G.C. e P.R.L. RNA biomedicina Grant F046166 para M.G.C. F.M.M. é suportado por um F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. é suportado pelo NIH / NIGMS concessão 5T34GM007821-37.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 Bioanalisador | Agilent | G2946-90004 | bioanalisador |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerado | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 camundongo |
| Cloreto de cálcio | Aldrich | 22350-6 | tampão reagente |
| D-Luciferina, Sal de Potássio | Goldbio | LuckK-1g | |
| A cremalheira magnética Diamag1.5 | Diagenode | B04000003 | para lavagens magnéticas do grânulo |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | rotador |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC componente |
| Dynabeads Proteína A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | proteína A contas magnéticas |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | proteína G contas magnéticas |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | preparar 20 μ g/mL em 0,1% BSA e alíquota. |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Sigma | E-4884 | tampão reagente |
| etilenoglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético) (EGTA) | Sigma | E-4378 | tampão reagente |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | qPCR reagente |
| Fetal bovino | Gibco | 10437028 | para congelamento de células |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Prepare 20 μ g/mL em 0,1% BSA e alíquota. |
| Fórceps | Fine Science Tools | 11008-13 | para dissecção de glicerol |
| tumoral, MB Grau | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | solução salina balanceada |
| Fluriso | VETone | 501017 | anestésico inalatório |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | in vivo sistema de imagem óptica |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | meios de descolamento de células |
| Reagente tampão | de cloreto de lítio | Sigma | L8895 |
| Microtubos de baixa ligação Corning | Costar | CLS3207 | tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas |
| Tubo de microcentrífuga | Fisher | 21-402-903 | tubo de microcentrífuga regular |
| Micrococcal Nuclease | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | cada lote pode ser diferente; compre quantidade suficiente para experimentos e alíquota. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC componente |
| Normal Rabbit IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | agente antimicrobiano, use a 0,1 mg / mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | tampão |
| reagente Kimble Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Inibidor de Protease Coquetel | Sigma-Aldrich | P8340 | alíquota e armazenar a -20 ° C. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | faz estoque de 10 mg / mL em água; alíquota e armazenamento a -20 ° C. |
| Kit de purificação de PCR QIAquick | Qiagen | 28104 | Kit de purificação de DNA |
| Bisturi | Fine Science Tools | 10007-16 | para dissecção de tumor Cloreto de |
| sódio | VWR | 0241-5KG | tampão reagente |
| Desoxicolato de sódio | Sigma-Aldrich | D670-25G | tampão reagente |
| Dodecil sulfato de sódio (SDS) | Sigma | L-4390 | reagente tampão |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | reagente tampão |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | éter octilfenílico de polietilenoglicol |
| Centrífuga Padrão | Fisherbrand | 12-006-901 | mini centrífuga padrão |
| Microscópio SZX16 | Microscópio de dissecação fluorescente | Olympus | SZX16 |
| Sistema de PCR em tempo real ViiA 7 com biossistemas aplicados em bloco rápido de 96 poços | 4453535 | ||
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
Referências
- Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
- Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma th....
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Reimpressões e permissões
