Functionalization superfície de nanopartículas de vírus de hepatite E usando métodos de conjugação química

Summary

Temos engenharia da proteína do capsídeo do vírus de hepatite E como um theranostic de nanopartículas (HEVNP). HEVNP auto monta em uma gaiola icosahedral estável na entrega da mucosa. Aqui, descrevemos a modificação do HEVNPs para tumor definião mutando superfície exposta resíduos de cisteínas, que conjugue ligantes sintéticos que se ligam especificamente as células do tumor.

Abstract

Partículas vírus-like (VLP) tem sido usadas como nanocarriers para exibir resumos estrangeiros e/ou entregar pequenas moléculas na detecção e tratamento de várias doenças. Esta aplicação baseia-se na modificação genética, auto-montagem, e conjugação de cisteína para cumprir a aplicação multiplataforma em tumor de VLPs recombinantes. comparado com genética conjugação sozinho, química de modificação dos peptides extrangeiros para VIPs oferece uma significativa vantagem, porque permite uma variedade de entidades, tais como peptídeos sintéticos ou oligossacarídeos, para ser conjugada com a superfície de VIPs de forma modulada e flexível, sem alteração da Assembleia VIP.

Aqui, demonstramos como utilizar a hepatite E vírus de nanopartículas (HEVNP), uma cápsula de theranostic modularizado, como um portador de entrega multifuncional. HEVNPs funções tecido-alvo, imagem e entrega terapêutica. Baseado na pesquisa estrutural bem estabelecida do HEVNP, os resíduos estruturalmente independentes e superfície exposta foram selecionados para substituição de cisteína como sites de conjugação para grupos químicos maleimide ligados através de ligações tiol-seletivo. Um particular cisteína-modificado HEVNP (substituto da asparagina em 573 Cys aa HEVNP - 573C) foi conjugada com um ligante de célula específica de câncer de mama, LXY30 e rotulados com tintura infravermelho próximo (NIR) fluorescência (Cy5.5), tornando o tumor-alvo HEVNPs como cápsulas de diagnósticos eficazes (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Estratégias de engenharia semelhantes podem ser empregadas com outros complexos macromoleculares com estruturas atômicas conhecidas para explorar potenciais aplicações na entrega de theranostic.

Introduction

O desenvolvimento de vetores nanométricas em entrega de diagnóstica e terapêutica, conhecida como nanotheranostics, deslocou-se muito do campo biomédico longe tratamentos generalizados no sentido de alvo entrega¹. Nanotheranostic alvo entrega nanométricas vetores (nanopartículas) integra-se com moléculas de theranostic para direcionar estàvel theranostic moléculas de um determinado tecido doente ou via metabólica^2,3,4 . Nanomedicina chegou para a vanguarda da entrega alvo porque otimamente tamanhos nanopartículas têm capacidade para estabilizar a circu....

Protocol

1. HEVNP produção em células de inseto

Nota: Todas as etapas a seguir devem ser executadas em um capuz de cultura de células. Consulte a nossa publicação anterior para mais detalhadas HEVNP produção procedimentos¹¹.

1. Células de cultura Sf9 no inseto pilha media (ver Tabela de materiais) para confluência de 50-75% em placas de 6-poços.
2. Utilizando reagentes de transfecção celular inseto de acordo com os protocolos do fabricante, transfect Bacmids contendo HEVNP - 573 C ORF2 em células Sf99 para produzir baculovirus recombinante. Incube as células transfectadas a 27 ° C durante 3 a 6 ....

Results

Semelhante de HEV-VIPs, Cys todos modificado HEVNPs formados solúvel icosahedral capsids e não agregam em solução durante a produção ou purificação. Antes e depois de conjugação de etapa única maleimide-biotina, cada uma a Cys modificado HEVNPs eram indistinguíveis de HEV-VIPs na mancha negativa EM (Figura 2). Eficiência da conjugação maleimide-biotina para Cys modificados HEVNPs primeiro foi testado com mancha ocidental através da ligação streptavidin quimio.......

Discussion

Em contraste com o procedimento demorado a engenharia genética, que normalmente leva semanas, aqui podemos demonstrar duas etapas simples e procedimentos de conjugação química uma etapa, que podem ser concluídos no prazo de 3 dias, adicionando o câncer visando ligante e/ou tintura de deteção de fluorescência para os sites de Cys/Lys de HEVNPs. A técnica pode ser usada a tela para o melhor destino de ligante de um pool de candidatos e assim, aproveita-se dos serviços disponíveis do peptide/pequena molécula síntese em um t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Unidades de Diálise MINI, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	unidade de diálise
mini High Five Cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	Tn5 células
SF9 Cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Células Sf9
Sistema de Expressão de Baculovírus Bac-to-Bac	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	Sistema de Expressão de Baculovírus
Bac-to-Bac Sistema de Expressão de Baculovírus	Life Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Insect Cell Media	Expression Systems LLC	96-001-01	inseto meio celular
Cy5.5 NHS éster, 5mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS éster
Zeba Spin Dessalinização Colunas, 40K MWCO, 0,5 mL	Thermo Scientific	87766	coluna de dessalinização por rotação
MES Hydrate	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes Beckman	Coulter, Inc	Depende do Rotor	tubo de ultracentrífuga
NuPage 4-12% Bis-Tris Géis de Proteína	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	SDS gel de proteína
Cellfectin II	Reagente Thermo Fisher Scientific	10362100	reagente de transfecção
EMS Descarregador de brilho	Microscopia Eletrônica Ciência		descarregador de brilho