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Artigo de método

Functionalization superfície de nanopartículas de vírus de hepatite E usando métodos de conjugação química

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DOI:

10.3791/57020

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11 de maio de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Temos engenharia da proteína do capsídeo do vírus de hepatite E como um theranostic de nanopartículas (HEVNP). HEVNP auto monta em uma gaiola icosahedral estável na entrega da mucosa. Aqui, descrevemos a modificação do HEVNPs para tumor definião mutando superfície exposta resíduos de cisteínas, que conjugue ligantes sintéticos que se ligam especificamente as células do tumor.

Resumo

Partículas vírus-like (VLP) tem sido usadas como nanocarriers para exibir resumos estrangeiros e/ou entregar pequenas moléculas na detecção e tratamento de várias doenças. Esta aplicação baseia-se na modificação genética, auto-montagem, e conjugação de cisteína para cumprir a aplicação multiplataforma em tumor de VLPs recombinantes. comparado com genética conjugação sozinho, química de modificação dos peptides extrangeiros para VIPs oferece uma significativa vantagem, porque permite uma variedade de entidades, tais como peptídeos sintéticos ou oligossacarídeos, para ser conjugada com a superfície de VIPs de forma modulada e flexível, sem alteração da Assembleia VIP.

Aqui, demonstramos como utilizar a hepatite E vírus de nanopartículas (HEVNP), uma cápsula de theranostic modularizado, como um portador de entrega multifuncional. HEVNPs funções tecido-alvo, imagem e entrega terapêutica. Baseado na pesquisa estrutural bem estabelecida do HEVNP, os resíduos estruturalmente independentes e superfície exposta foram selecionados para substituição de cisteína como sites de conjugação para grupos químicos maleimide ligados através de ligações tiol-seletivo. Um particular cisteína-modificado HEVNP (substituto da asparagina em 573 Cys aa HEVNP - 573C) foi conjugada com um ligante de célula específica de câncer de mama, LXY30 e rotulados com tintura infravermelho próximo (NIR) fluorescência (Cy5.5), tornando o tumor-alvo HEVNPs como cápsulas de diagnósticos eficazes (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Estratégias de engenharia semelhantes podem ser empregadas com outros complexos macromoleculares com estruturas atômicas conhecidas para explorar potenciais aplicações na entrega de theranostic.

Introdução

O desenvolvimento de vetores nanométricas em entrega de diagnóstica e terapêutica, conhecida como nanotheranostics, deslocou-se muito do campo biomédico longe tratamentos generalizados no sentido de alvo entrega1. Nanotheranostic alvo entrega nanométricas vetores (nanopartículas) integra-se com moléculas de theranostic para direcionar estàvel theranostic moléculas de um determinado tecido doente ou via metabólica2,3,4 . Nanomedicina chegou para a vanguarda da entrega alvo porque otimamente tamanhos nanopartículas têm capacidade para estabilizar a circulação de moléculas de theranostic e alvejar seletivamente moléculas de superfície celular apresentadas sobre os tecidos doentes. Muitas plataformas nanotheranostic ainda sofrem absorção passiva de célula, degradação pre-maturo, toxicidade e insuficiente associação com moléculas de theranostic. Os VIPs superar muitos desses obstáculos na entrega do alvo. Eles têm sido usados como nanocarriers para exibir resumos estrangeiros e/ou entregar as moléculas pequenas: um regime que pode ser usado para combater muitas doenças1. Esta aplicação depende, principalmente, de propriedade de auto-montagem, bem como a facilidade de modificações genéticas, para cumprir o aplicativo projetado para o VIP determinado. Comparado a engenharia genética, química conjugação dos peptides extrangeiros para VIP exibe uma vantagem significativa porque permite uma grande variedade de entidades, tais como peptídeos ou oligossacarídeos, para ser conjugada com a superfície de VIPs em um modulado e forma flexível, sem alteração do conjunto de VIP.

HEVNPs, derivados da proteína do capsídeo HEV recombinante, 2nd aberto lendo quadro (ORF2), são não-infecciosas, montagem auto capsids capazes de ligação de celular e entrada. Porque HEV evoluiu para a transmissão da mucosa, a proteína de capsídeo montado é da mesma forma estável em condições da mucosa proteolíticas e ácida5. HEVNPs formam uma cavidade, T = 1 capsídeo icosaédrica, composto de 60 unidades idênticas6,7 de ORF2, tornando-o altamente estável tanto em armazenamento e em duras condições fisiológicas. Faltando alguma elementos genéticos virais, a rendimento eficiente, de alta produção é conseguida com baculovirus sistema de expressão em células de inseto. Por causa de sua estabilidade proteolítica, Self montados HEVNPs são extraídos e purificados do sobrenadante de célula, reduzindo substancialmente as etapas de purificação necessário. Além disso, HEVNPs possuem um superfície exposta protrusão domínio (P) conectado através de uma articulação flexível para uma base estável icosaédrica. O domínio P forma picos de superfície exposta no topo da base icosahedral enquanto a dobradiça flexível torna possível modificar significativamente o domínio P sem comprometer a estrutura icosaédrica base. Com 60 unidades repetidas, única site-specific modificação resulta em 60 locais simétricas para modulação de química. Recentemente, propusemos uma nano-plataforma usando o HEVNP que pode conjugado quimicamente ligantes ou pequenas moléculas para aplicações theranostic. Isto foi conseguido substituindo um único aminoácido cisteína no domínio de protrusão de HEV-VIP como um site de reação com maleimide-lig peptídeos ou moléculas. Com base na anterior análise estrutural de HEV-VIP e bem estudado epitopos imunogénicos8,9, os seguintes cinco HEV-VIP aminoácidos foram substituídos com cisteína como potenciais candidatos: Y485C, T489C, S533C, N573C e T586C ( Figura 1). Depois da expressão e purificação de células de inseto, suas formações VIP foram confirmadas pela observação de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão (Figura 2), e os sites de cisteína expostos foram analisados por Western blot após biotina maleimide-lig conjugação (Figura 2). Entre os cinco mutantes, HEVNP - 573C exibido o sinal mais forte da conjugação maleimide-biotina (Figura 2) e foi usado para acompanhamento demonstração como o nanocarreador para célula de câncer de mama visando4 (Figura 3).

Este protocolo descreve métodos de conjugação química para anexar moléculas tumor-direcionamento para HEVNPs através da conjugação de superfície cisteína. Detalhamos a conjugação das moléculas de direcionamento e deteção de tumor para entrega do tumor com HEVNPs recombinantes contendo uma cisteína em N573 (HEVNP - 573C). Focamos em um processo de conjugação de química clique duas etapas para vincular um tumor de câncer de mama direcionamento do peptide, LXY3010 de HEVNPs de forma LXY30-HEVNP (Figura 4). Posteriormente, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 foram conjugados para o site de Lys separado na HEVNPs para construir LXY30-HEVNP-Cy5.5 para a deteção fluorescente, tanto em vitro (Figura 5) e em vivo4.

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Protocolo

1. HEVNP produção em células de inseto

Nota: Todas as etapas a seguir devem ser executadas em um capuz de cultura de células. Consulte a nossa publicação anterior para mais detalhadas HEVNP produção procedimentos11.

  1. Células de cultura Sf9 no inseto pilha media (ver Tabela de materiais) para confluência de 50-75% em placas de 6-poços.
  2. Utilizando reagentes de transfecção celular inseto de acordo com os protocolos do fabricante, transfect Bacmids contendo HEVNP - 573 C ORF2 em células Sf99 para produzir baculovirus recombinante. Incube as células transfectadas a 27 ° C durante 3 a 6 dias, dependendo da viabilidade das células.
  3. Recolha o sobrenadante a pós-infecção 3-6 dias (após as células transfectadas lysed devido à infecção de baculovirus) como estoque de baculovirus P0.
  4. Remova o meio de cultura antes de aplicar a 200 µ l de estoque P0 para 50-75% Sf9 confluentes num balão de monocamada 25 cm2 . Agitar o frasco a cada 15 min para garantir a cobertura completa do inóculo. Repita 4 vezes, para um total de 60 min.
  5. Adicionar 2 mL de meio de cultura de células de inseto no balão e manter a 27 ° C, por 3-6 dias, dependendo da viabilidade das células, para amplificar o baculovirus para um título mais elevado.
  6. Realize ensaios de placa para obter o título de baculovirus lendo12.
  7. Cultura de suspensão Tn5 insetos células (Tabela de materiais) com 100 mL de meio de inseto celular em balão de 250 mL e agitar em 27 ° C a 150 rpm para uma concentração de 0,5 x 105 - 1 x 106 para inoculação.
  8. Adicione baculovirus em uma multiplicidade de infecção (MOI) de células de Tn5 5-10 a 100 mL num balão de 250 mL. Após a inoculação, agite em 27 ° C a 150 rpm durante 5-7 dias.
  9. Uma vez que a maioria das células parecem ter vesículas e 70-90% das células são mortas sob observação do microscópio óptico, coletar as células Tn5 e transferir para tubos de se 33 mL. Lugar se os tubos em balançando balde rotores, equilíbrio e spin-down a detritos celulares e baculoviruses recombinante em 10.000 x g, durante 90 min a 25 ° C.
  10. Manter o sobrenadante que contém os HEVNPs lançados a 4 ° C, durante mais de purificação. Para armazenamento prolongado de baculovirus sobrenadante, adicione inibidores de protease.

2. HEVNP purificação

  1. De pelotas e isolar os HEVNPs usando separação gradiente de césio (CsCl) de cloreto:
    1. Transferir o sobrenadante coletado (da etapa 1.10) e adicionar 20% em cada tubo, tornar-se uma concentração final de 0,5% da NP-40 NP-40 para dissolver qualquer restantes da membrana celular. Delicadamente misture pipetando e incube durante pelo menos 30 min a 25 ° C.
    2. Se o HEVNPs a 112.400 x g em balançando balde rotores para 2 h a 4 ° C para baixo os HEVNPs do líquido sobrenadante de Pelotas. Descartar o sobrenadante após centrifugação e suavemente Ressuspender o sedimento bruto em 200 µ l de tampão pH 6.2 do MES 10 mM em cada tubo durante a noite (O/N) a 4 ° C. Execute SDS-PAGE (passo 3.1) para confirmar a presença de ORF2 HEVNP na pelota crua como 52 kDa banda.
    3. Prepare um gradiente de CsCl 38,5% (p/v) por mistura 1,96 g CsCl, a re-suspensão da pelota crua e ~ 4 mL de 0,01 M MES pH 6.2 um tubo se de 5 mL. Equilibrar os tubos e colocar em um rotor de balde oscilante. Se a 147.000 x g, durante 16 h a 4 ° C.
  2. Recolha as frações após gradiente de CsCl:
    1. Descarte o top 500 µ l fração, que é principalmente os restos da membrana celular de pouco peso. Coleta 500 µ l frações, começando da parte superior do tubo e trocar dicas entre cada fração. Coloque cada fração em tubos numerados/rotulado 1,5 mL.
      Nota: A presença de HEVNP ORF2 em frações separadas de CsCl gradiente não pode ser detectado pela execução SDS PAGE gel devido a alta concentração de CsCl. A CsCl em cada fração pode ser removido ou diluído, seguindo um procedimento de limpeza de CsCl. Alternativamente, o gradiente de CsCl pode ser substituído por um 10-40% de sacarose gradiente13 para evitar CsCl residual.
    2. Transferir cada fração para um tubo de se de 5 mL e diluir o CsCl com 4,5 mL de 10mm MES, pH 6.2. Equilibrar os tubos e colocar em um rotor de balde oscilante. Se a 147.000 x g, durante 2 h a 4 ° C, a pelota para os HEVNPs.
    3. Desprezar o sobrenadante e suavemente Ressuspender os HEVNPs em 100 µ l de 10mm MES pH 6.2 cada tubo. Cobrir os tubos para evitar a evaporação e incubar O/N a 4 ° C.
    4. Registre a leitura A280 e relação de A260/A280 nm utilizando um espectrofotômetro. Determine a concentração aproximada de ORF2 como:
      figure-protocol-1
      Cada ORF2 conterá 1 site de Cys e 1 site de Lys para conjugação química.
      Nota: O coeficiente de extinção molar de ORF2 HEVNP 60.280, que é equivalente a 1,019 mg/mL × A280. Isto está tão perto de 1:1 que a concentração de HEVNPs (em mg/mL) pode ser aproximada pela A280 e, portanto, a concentração de ORF2 pela equação acima. Por exemplo, um HEVNP com uma leitura A280 de 1 terá uma concentração de 1 mg/mL, que equivale a 18,8 µM ORF2.
    5. Prepare um SDS-PAGE. Use uma amostra de cada fração 6 µ l para determinar as frações que contêm proteína de kDa HEVNP ORF2 53,3 (passo 3.1). Os HEVNPs devem ser encontrados em frações de 3-5, com uma densidade de ~1.25 g/mL.
    6. Confirme a presença e a pureza da HEVNPs pela observação TEM. Prepare-se ou diluir as amostras HEVNP a 0,5 - 2,0 mg/mL para o TEM. Os HEVNPs aparecem na TEM como proteínas icosahedral vazias, ~ 27 nm de diâmetro (Figura 2). Alguns contaminantes de proteína podem permanecer nas fracções e observar-se-irão sob temperatura (passo 3.2).
  3. No caso que as impurezas estão presentes sob temperatura, repita a etapa 2.1.3 - 2.2.6 para melhor pureza dos HEVNPs.
    Nota: A purificação Extra através de gradiente de CsCl pode causar perda de rendimento de HEVNPs. Alternativamente, a purificação de gradiente de CsCl pode ser substituída por um gradiente de sacarose 10-40% para evitar residual CsCl13.

3. caracterização de HEVNP

  1. Prepare SDS PAGE Bis-Tris 4-12% proteína coagula, 1.0 mm, 17-wells (ver Tabela de materiais) de acordo com o manual do usuário14:
    1. Adicione 2 µ l de 4x carregando buffer para 6 µ l da amostra de proteína. Incube a mistura de amostra em um bloco de calor durante 10 minutos a 100 ° C, a desnaturar a proteína. Carrega as amostras da proteína para o gel.
    2. Execute o SDS-PAGE, definindo a fonte de alimentação de DC a 100 V por 10 min, depois 150 V por 45 min até as amostras de correr a cerca de 1 cm acima do fundo do gel.
    3. Mancha do gel de SDS PAGE com azul de Coomassie (0.25% (p/v) Coomassie brilhante R250 azul, 30% (v/v) de metanol, ácido acético a 10% (v/v)), por 1h.
    4. Após o procedimento de coloração, remover a mancha azul de Coomassie e aplicar o tampão de coloração (30% (v/v) de metanol, ácido acético a 10% (v/v)) para o gel de proteína para > 12 h à temperatura ambiente.
    5. Documente o gel sob luz branca para confirmar a presença de ORF2 HEVNP para a banda de 52 kDa.
  2. Observe os HEVNPs usando o TEM.
    1. Prepare-se ou diluir as amostras HEVNP de 0,5 - 2 mg/mL com pH MES de 10mm 6.2 para a imagem latente TEM.
    2. Ionizar as grades de carbono revestido com 40 brilho da descarga mA por 30 s para produzir uma superfície hidrofílica carbono. O equipamento de descarga do fulgor é descrito na Tabela de materiais.
      Nota: A superfície hidrofílica carbono das grades pode apenas última para 30 min depois brilho descarga tratamento.
    3. Segurar na pinça e adicionar 2 µ l da amostra HEVNP para a grade, espere por 15-30 s e borre com papel de filtro.
    4. Lave imediatamente a grade com o ddH20 e blot com papel de filtro.
    5. Imediatamente adicione 2 µ l de acetato de uranilo 2% para a grade, espere 15 s, então blot com papel de filtro. Seca as grades de amostra, colocando-os em uma eletrônica desumidificar armário seco para O/s.
    6. Transferi a grade para uma temperatura e imagem na ampliação de 10-80k. HEVNPs aparecem na TEM como vazias icosahedral proteínas que são ~ 27 nm de diâmetro, devido à ausência de RNA viral.

4. química conjugação de HEVNPs com biotina, ligante de direcionamento de câncer e Fluorophores

  1. Execute uma conjugação de passo de HEVNPs e maleimide ligado a biotina.
    1. Mudança de buffer: aplicar os HEVNPs em unidades de diálise mini e Dialize contra 0,01 M pH de PBS 7,4 à temperatura ambiente durante 1 h, de acordo com o protocolo do fabricante (Tabela de materiais). Transferir os HEVNPs para tubos de 1,5 mL e medir a concentração de proteína em 280 nm, utilizando um espectrofotômetro.
    2. Misture o HEVNP a 1 mg/mL, que equivale a 18,8 µM de Cys reação sites (ver detalhes na etapa 2.2.4), com uma quantidade igual de maleimide-biotina (100 µM) em PBS 0,01 M, pH 7,4, tornar-se uma relação molar de 1:5; reagir O/N a 4 ° C. Remova maleimide-biotina desacoplado com um procedimento de coluna MWCO Spin Desalting 40k de acordo com o protocolo do fabricante (Tabela de materiais).
    3. Analise as amostras através de um padrão reduzindo SDS-PAGE (passo 3.1).
    4. Procedimentos padrão, prepare um quimioluminescente Western Blot usando Streptavidin HRP-lig. Capture o sinal quimioluminescente pela película de raio X (Figura 2).
  2. Execute dois passos LXY30 conjugação de cisteína superfície exposta na HEV NPs (Figura 5).
    1. Troca de buffer: aplicar HEVNPs em unidades de diálise mini e Dialize contra 0,01 M pH PBS 7,4 à temperatura ambiente por 1 h. transferência de HEVNPs para tubos de 1,5 mL e medir a concentração de proteína em 280 nm, utilizando um espectrofotômetro.
    2. Adicionar 650 µM maleimide-azida e 650 µM alquino-LXY3010 em 0,01 M PBS com pH de 7,4 200 µM CuSO4 e 1 mM de ácido ascórbico para formar maleimide-lig LXY30 (Mal-LXY30) em 650 µM. Incubar a mistura a 4 ° C para O/s.
    3. Misture o HEVNP de 1 mg/mL, que equivale a 18,8 µM do sítio de reação Cys (ver detalhes na etapa 2.2.4), com cerca de 10% volume de Mal-LXY30 (650 µM) em 0,01 M pH de PBS 7.4, tornar-se uma relação molar de 1:3; reagir O/N a 4 ° C.
      Nota: Devido à concentração relativamente elevada de Mal-LXY30, as concentrações finais dos reagentes, tais como CuSO4, são reduzidas cerca de 10 vezes após a mistura, para evitar os danos HEVNPs. Outra opção é o Cu-free conjugação método15.
    4. Remover desassociada clique-maleimide-LXY30 com uma coluna 40 K MWCO Spin dessalinização de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de materiais). Manter os HEVNPs LXY30-lig (LXY30-HEVNPs) a 4 ° C.
  3. Executar uma conjugação de passo do éster Cy5.5 do NHS (NHS-Cy5.5) e LXY30-HEVNPs
    1. Misture os HEVNPs LXY30-lig (LXY30-HEVNPs) a 1 mg/mL, que equivale a 18,8 µM do site reação Cys (ver detalhes na etapa 2.2.4), com igual volume de NHS-Cy5.5 (100 µM) em 0,01 M pH de PBS 7.4 tornar-se uma relação molar de 1:5; reagir O/N a 4 ° C.
    2. Remover Cy5.5-NHS sem uma ligação com um procedimento 40k MWCO Spin Desalting coluna de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de materiais). Fica com o LXY30, HEVNPs Cy5.5-lig (LXY30-HEVNP-Cy5.5) a 4 ° C.

5. HEVNP ligação para e internalização em células de câncer de mama MDA-MB231

  1. Células de câncer de mama semente MDA-MB231 em um vidro de 35mm fundo de pratos (5 x 104 por prato) O/N em uma cultura de células de mamíferos do armário.
  2. Para o experimento de ligação de celular, prepare-se LXY30-HEVNP-Cy5.5 pelos seguintes passos 4.2-4.3. Diluir o LXY30-HEVNP-Cy5.5 para 0,01 mg/mL, que equivale a 0.188 µM de ORF2 HEVNP (consulte a etapa 2.2.4), em 250 µ l de 0 - 1% FBS/DMEM.
    1. Prepare a amostra de controlo negativo a 0,01 mg/mL HEVNP-Cy5.5 a passo a seguir 4.3 mas conjugados com tintura de NHS-Cy5.5 apenas, (HEV-Cy5.5). Diluir o HEVNP-Cy5.5 para 0,01 mg/mL, que equivale a 0.188 µM de ORF2 HEVNP (consulte a etapa 2.2.4), em 250 µ l de 10% FBS suplementado com DMEM.
  3. Lave as células uma vez aplicando 250 µ l de tampão PBS de 1 M, pH 7,4. Retire o tampão PBS após a lavagem, mantendo algum buffer da placa de cultura de células.
  4. Aplica 250 µ l de LXY30-HEVNP-Cy5.5 em 10% FBS suplementado com DMEM ou HEVNP-Cy5.5, em 10% FBS suplementado com DMEM para as células de câncer de mama MDA-MB231 culturas. Escudo da célula cultivadas pratos da luz com papel alumínio.
  5. Mantenha os pratos de células cultivadas em uma cultura de células de 37 ° C do armário por 1h para internalização.
  6. Lave as células cultivadas no gelo 3 vezes, 5 min por lavagem, com 250 µ l de PBS de 1 M, pH 7,4.
  7. Consertar as células em 4% PFA em 1m PBS, pH 7,4 por 20 min e depois lave uma vez com 250 µ l de PBS de 1 M, pH 7,4.
    Nota: As células agora estão prontas para ser fotografada por microscópio confocal. Dados representativos são mostrados na Figura 5.

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Resultados

Semelhante de HEV-VIPs, Cys todos modificado HEVNPs formados solúvel icosahedral capsids e não agregam em solução durante a produção ou purificação. Antes e depois de conjugação de etapa única maleimide-biotina, cada uma a Cys modificado HEVNPs eram indistinguíveis de HEV-VIPs na mancha negativa EM (Figura 2). Eficiência da conjugação maleimide-biotina para Cys modificados HEVNPs primeiro foi testado com mancha ocidental através da ligação streptavidin quimio...

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Discussão

Em contraste com o procedimento demorado a engenharia genética, que normalmente leva semanas, aqui podemos demonstrar duas etapas simples e procedimentos de conjugação química uma etapa, que podem ser concluídos no prazo de 3 dias, adicionando o câncer visando ligante e/ou tintura de deteção de fluorescência para os sites de Cys/Lys de HEVNPs. A técnica pode ser usada a tela para o melhor destino de ligante de um pool de candidatos e assim, aproveita-se dos serviços disponíveis do peptide/pequena molécula síntese em um t...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses concorrente.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o patrocínio do financiamento a RHC pelo NIH conceder #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Instituto Nacional de alimentação e agricultura, bem como o programa distinto Professor Finlândia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Unidades de Diálise MINI, 10K MWCOThermo Fisher Scientific69572unidade de diálise
mini High Five CellsThermo Fisher ScientificB85502Tn5 células
SF9 Cells Thermo Fisher Scientific11496015Células Sf9
Sistema de Expressão de Baculovírus Bac-to-BacThermo Fisher ScientificA11101, A11100Sistema de Expressão de Baculovírus
Bac-to-Bac Sistema de Expressão de BaculovírusLife Technologies10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024Bacmid
ESF921 Insect Cell MediaExpression Systems LLC96-001-01inseto meio celular
Cy5.5 NHS éster, 5mgLumiprobe Corp27020Cy5.5 NHS éster
Zeba Spin Dessalinização Colunas, 40K MWCO, 0,5 mLThermo Scientific87766coluna de dessalinização por rotação
MES HydrateSigma-Aldrich Chemical CoM8250-250GMES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes BeckmanCoulter, IncDepende do Rotortubo de ultracentrífuga
NuPage 4-12% Bis-Tris Géis de ProteínaThermo Fisher ScientificNPO321BOXSDS gel de proteína
Cellfectin IIReagente Thermo Fisher Scientific10362100reagente de transfecção
EMS Descarregador de brilhoMicroscopia Eletrônica Ciênciadescarregador de brilho

Referências

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Reimpressões e permissões

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