Coleção de tecido adiposo de mouse e processamento para análise de RNA

Resumo

O objetivo deste trabalho é apresentar um procedimento passo a passo para coletar os diferentes tecidos adiposo brancos de ratos, processar as amostras de gordura e extrair o RNA.

Resumo

Comparado a outros tecidos, tecido adiposo branco tem um teor consideravelmente menos RNA e proteína para aplicações a jusante, tais como a PCR em tempo real e Western Blot, desde que em sua maioria contém lipídios. Isolamento de RNA a partir de amostras de tecido adiposo é também um desafio como etapas adicionais são necessárias para evitar esses lipídios. Aqui, apresentamos um procedimento para coletar três anatomicamente diferentes brancos adiposo tecidos de ratos, para processar estas amostras e realizar o isolamento de RNA. Podemos descrever a síntese do cDNA e gene experimentos de expressão usando PCR em tempo real. O protocolo descrito por este meio permite a redução da contaminação de cabelo e sangue nas almofadas de gordura, bem como a contaminação cruzada entre diferentes almofadas de gordura durante a coleta de tecido do animal. Ele também foi otimizado para garantir adequada quantidade e qualidade do RNA extraído. Este protocolo pode ser amplamente aplicado a qualquer modelo de rato onde as amostras de tecido adiposo são necessárias para experimentos de rotina, tais como a PCR em tempo real, mas não deve ser isolada da cultura de células primárias de adipócitos.

Introdução

A obesidade é uma epidemia mundial que pode levar a complicações, tais como o tipo 2 diabetes¹. Modelos animais induzida por dieta obesos e geneticamente modificados são frequentemente usados para investigação em obesidade e suas complicações associadas. Tradicionalmente, o tecido adiposo branco é conhecido como um compartimento de armazenamento para o excesso de energia e é principalmente composto de lipídios enquanto marrom tecido adiposo converte energia em calor^2,3. Tecido adiposo é dinâmico e irá expandir e encolher dependendo de vários fatores tais como a ingestão de alimentos e a....

Protocolo

Cuidados dos ratos usados nos procedimentos respeitadas as normas para o cuidado e o uso de animais experimentais, fixado pelo Conselho canadense para a protecção dos animais. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de uso no centro de pesquisa de CHUM e cuidado do Animal de universidade.

1. necropsia e coleta de tecido adiposo de ratos masculinos

1. Fazer grupos experimentais, de acordo com os objectivos do estudo. Neste estudo, as amostras foram coletadas de dois grupos de camundongos machos em um fundo de C57Bl/6 (n = 12-14/grupo). Certifique-se que os ratos usados aqui são 12-15 semanas de idade e são mantidos no ciclo....

Resultados

Após o processo de necropsia, os três tecidos adiposo brancos foram coletados e ponderados de dois grupos de ratos (N e HF dieta-alimentou ratos). Como esperado, os ratos na dieta de HF tinham aumentado de peso final e ganho de peso em comparação com littermates dieta N (tabela 1). Estas observações foram acompanhadas por mais do que um aumento de 2 vezes no peso da PGF, PRF e SCF em ratos obesos em comparação com aqueles na dieta de N.

Discussão

Seguir HF-dieta alimentar, ratos obesos foram encontrados para ter aumentado o corpo e os pesos de tecido adiposo branco em comparação com ratos alimentados com uma dieta de N. RNA extraído usando solução de fenol rendeu amostras com boa pureza. Leptina é uma adipokine primeiramente produzido pelo tecido adiposo e é conhecida por correlacionar-se positivamente com a massa gorda¹⁶. Como esperado, a expressão de RNAm de leptina aumentou em ratos obesos em concomitância com sua massa gorda.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 mL seringes
1X TE solução (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA• Na2. pH 8.0)
Agulhas
Agulhas
Aquecedor de bloco de etanol
(banho seco)
Clorofórmio	Sigma	C2432-500mL
dATP	Thermo scientific	R0141
dCTP	Thermo scientific	R0151
dGTP	Thermo scientific	R0161
DNase I (1 U/µ l)	Thermo scientific	EN0521
dTTP	Corante	Thermo scientific R0171
Faststart SYBR green Master (Rox)	Roche	4913922001
Faststart universal SYBR green master (Rox)	Pinça de Pontas	Filtradas
	Martelo
Dieta para roedores com alto teor de gordura	Bio-Serv, Frenchtown, NJ	F3282
	Laboratoire MAT	IH-0101
Primer de PCR direto de leptina (5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') 10 uM
Primer de PCR reverso de leptina (5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 uM
Nitrogênio
Maxima Transcriptase reversa (enzima e tampão 5x)	Thermo scientific	EP0742
Água nanopura (referida como água ultrapura)
Luvas
Luvas
Dieta normal para roedores	Harlan Laboratories, Madison, WI	Harlan 2018
P1000 pipetman
P2 pipetman
P20 pipetman
P200 pipetman
Solução de fenol (TRIzol)	Ambion Life Technologies	15598018
Espectrofotômetro
pré-identificado em folha
Rack para tiras de tubo PCR
			de tubo RT-PCR
Hexâmeros aleatórios	Invitrogen	58875
		térmico Rotor-Gene RG-3000	da Corbett research
			refrigerada de bancada
RiboLock RNase Inhibitor	Thermo scientific	EO0381
Tubos eppendorf de 1,5 mL sem RNase Tubos
com tampa de rosca de 1,5 mL
tubo PCR sem RNase (0,2 mL) e tampas
sem RNase	Máquina de RT-PCR Hyclone	SH30538.02
	Qiagen	Rotor-Gene Corbett 3000
Tiras de tubo RT-PCR (0,1 mL) e tampas
Primer PCR direto S16 (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 uM
Primer PCR reverso S16 (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') Espectrofotômetro de 10 uM
	Biochrom	Ultrospec 3100 pro
Pilão
Almofadas cirúrgicas	Feita em casa uma placa de espuma envolvida em uma almofada
Tesoura cirúrgica	Intrumentarium	130.450.11
Termociclador
Termociclador Termociclador	Biometra	Thermocycler
			de vórtice
Espátula de

de 22 Gde 26 Gde 75% fluorescente universal Roche 4913914001 de Gaze Instrumentarium HB275 Isopropanol líquidode exame de nitrilode nitrilode quartzode alumínio Racks para tiras Sistema de Gene de Rotor PCR em Tempo Real Ciclador Centrífuga sem RNase Tiras de Água e almofariz de aço inoxidávelabsorvente descartávelMisturador pesagem