Visualizando a actina e microtúbulos citoesqueleto na célula B sinapse imune usando microscopia de depleção (STED) emissão estimulada

Jia C. Wang; Madison Bolger-Munro; Michael R. Gold

doi:10.3791/57028

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Visualizando a actina e microtúbulos citoesqueleto na célula B sinapse imune usando microscopia de depleção (STED) emissão estimulada

13.3K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/57028

⸱

9 de abril de 2018

Jia C. Wang¹ , Madison Bolger-Munro¹ , Michael R. Gold¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo para o uso de microscopia STED simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule plus-final em células B que se espalharam em lamelas revestidas com anticorpos contra o receptor de células B, um modelo para a fase inicial de formação de sinapse imunológica.

Resumo

Células B que se ligam aos antígenos de membrana-limite (por exemplo, na superfície de uma célula apresentadora de antígeno) formam uma sinapse imunológica, uma estrutura celular especializada que otimiza a sinalização da B-pilha do receptor (BCR) e aquisição de antígeno BCR-mediada. A remodelação do citoesqueleto de actina e a reorientação da rede microtubule em direcção ao local de contato do antígeno são essenciais para a formação de sinapse imunológica. Remodelação do citoesqueleto de actina, em um anel periférico denso de F-Actina é acompanhada de polarização do centro em direção a sinapse imunológica microtubule-organizadora. Proteínas microtubule plus-final, bem como proteínas cortical plus-final captura mediam interações físicas entre o citoesqueleto de actina e microtúbulos, que lhes permite a ser reorganizado de forma coordenada. Elucidação dos mecanismos que controle Esta reorganização do citoesqueleto, bem como a compreensão de como essas estruturas do citoesqueleto forma formação sinapse imunológica e BCR sinalização, pode fornecer novos insights sobre a ativação de células B. Isto tem sido ajudado pelo desenvolvimento de abordagens de microscopia de super-resolução que revelam novos detalhes de organização da rede do citoesqueleto. Descrevemos aqui um método para usar microscopia de depleção (STED) emissão estimulada simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule GFP-etiquetado transfectadas plus-final nas células B. Para modelar os eventos iniciais na formação de sinapse imunológica, podemos permitir que as células B espalhar em lamelas revestidas com anti-imunoglobulina (anti-Ig) anticorpos, que iniciam a remodelação do citoesqueleto e sinalização de BCR. Nós fornecemos protocolos passo a passo para expressar proteínas da fusão de GFP nas células A20 B-linfoma de célula anti Ig-induzida por espalhamento e para fixação da pilha subsequentes, imunocoloração, aquisição de imagem e imagem deconvolução etapas. As imagens de alta resolução obtidas usando estes procedimentos permitem visualizar simultaneamente estruturas de actina, os microtúbulos e as proteínas de ligação plus-final microtubule que podem unir essas duas redes do citoesqueleto.

Introdução

Quando as células B vincular a polarizada matrizes de antígenos (por exemplo, exibido na superfície do antígeno-apresentando células (APCs)), o resultante receptor de células B (BCR) sinalização drives a formação de uma estrutura clássica sinapse imunológica, que foi primeira descrita em T células¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,