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Artigo de método

Visualizando a actina e microtúbulos citoesqueleto na célula B sinapse imune usando microscopia de depleção (STED) emissão estimulada

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DOI:

10.3791/57028

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9 de abril de 2018

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo para o uso de microscopia STED simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule plus-final em células B que se espalharam em lamelas revestidas com anticorpos contra o receptor de células B, um modelo para a fase inicial de formação de sinapse imunológica.

Resumo

Células B que se ligam aos antígenos de membrana-limite (por exemplo, na superfície de uma célula apresentadora de antígeno) formam uma sinapse imunológica, uma estrutura celular especializada que otimiza a sinalização da B-pilha do receptor (BCR) e aquisição de antígeno BCR-mediada. A remodelação do citoesqueleto de actina e a reorientação da rede microtubule em direcção ao local de contato do antígeno são essenciais para a formação de sinapse imunológica. Remodelação do citoesqueleto de actina, em um anel periférico denso de F-Actina é acompanhada de polarização do centro em direção a sinapse imunológica microtubule-organizadora. Proteínas microtubule plus-final, bem como proteínas cortical plus-final captura mediam interações físicas entre o citoesqueleto de actina e microtúbulos, que lhes permite a ser reorganizado de forma coordenada. Elucidação dos mecanismos que controle Esta reorganização do citoesqueleto, bem como a compreensão de como essas estruturas do citoesqueleto forma formação sinapse imunológica e BCR sinalização, pode fornecer novos insights sobre a ativação de células B. Isto tem sido ajudado pelo desenvolvimento de abordagens de microscopia de super-resolução que revelam novos detalhes de organização da rede do citoesqueleto. Descrevemos aqui um método para usar microscopia de depleção (STED) emissão estimulada simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule GFP-etiquetado transfectadas plus-final nas células B. Para modelar os eventos iniciais na formação de sinapse imunológica, podemos permitir que as células B espalhar em lamelas revestidas com anti-imunoglobulina (anti-Ig) anticorpos, que iniciam a remodelação do citoesqueleto e sinalização de BCR. Nós fornecemos protocolos passo a passo para expressar proteínas da fusão de GFP nas células A20 B-linfoma de célula anti Ig-induzida por espalhamento e para fixação da pilha subsequentes, imunocoloração, aquisição de imagem e imagem deconvolução etapas. As imagens de alta resolução obtidas usando estes procedimentos permitem visualizar simultaneamente estruturas de actina, os microtúbulos e as proteínas de ligação plus-final microtubule que podem unir essas duas redes do citoesqueleto.

Introdução

Quando as células B vincular a polarizada matrizes de antígenos (por exemplo, exibido na superfície do antígeno-apresentando células (APCs)), o resultante receptor de células B (BCR) sinalização drives a formação de uma estrutura clássica sinapse imunológica, que foi primeira descrita em T células1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inicialmente, microclusters de antígeno-limite BCRs verbo na periferia da célula B: APC contato local. Estes microclusters, em seguida, mover em direção ao centro do site contato antígeno, onde se fundirem em um cluster de activação supramolecular central (cSMAC) que forma o núcleo da sinapse imunológica. Formação de sinapse imunológica otimiza BCR sinalização e facilita a extração de BCR-mediada do antígeno de membrana APC14. Esta aquisição do antígeno, que é seguida por internalização mediada por BCR antígeno e processamento do antígeno subsequentes, permite que as células B apresentar peptídeo: MHC complexos II para células T e obter ajuda de células T14. Porque a formação de imune sinapse promove a ativação de células B, elucidar os mecanismos que estabelecem que este padrão funcional da organização do receptor pode fornecer novos insights sobre como humorais respostas imunes são iniciadas e regulamentadas.

Reorganização do citoesqueleto de actina e microtúbulos é essencial para a formação de sinapse imunológica. BCR localizada sinalização estimulados por uma matriz espacialmente polarizado de antígenos induz rápida e dramática que remodela o citoesqueleto de actina1,15. A formação de estruturas dendríticas actina na periferia da célula B exerce forças empurra na membrana plasmática e promove a disseminação de células B. Isto permite que a célula B para fazer a varredura de uma área maior da superfície do antígeno-rolamento e aumenta o número de BCRs que ligam o antígeno e ativar BCR vias de sinalização. Ao mesmo tempo, o MTOC e a rede de microtúbulos são reorientados para o local de contato do antígeno. Como o MTOC aproxima-se o local de contato do antígeno, microtúbulos emana o MTOC se estendem ao longo da face interna da membrana plasmática na interface entre a célula B e a superfície do antígeno-rolamento16,17. Estes microtúbulos juxtamembrane podem então agir como faixas para o movimento centrípeto mediada por Dineína de antígeno-limite BCR microclusters18, levando à formação de um cSMAC.

A reorientação e a polarização do MTOC no sentido da sinapse imunológica requer actina intacta e citoesqueleto do microtúbulo e muitas vezes depende de interações entre o actin cortical rede e microtúbulos16,17, 19,20. Proteínas de ligação de actina corticais, como IQGAP1, podem capturar os microtúbulos interagindo com complexos de proteína que decoram o microtubule mais fins-de-21. Estes dinâmicos complexos de proteínas plus-final incluem EB1 e CLIP-170, que são coletivamente referidos como microtubule plus-final rastreamento proteínas (+ dicas)21,22. + Dicas nas extremidades dos microtúbulos podem ligar às proteínas que estão associadas com a membrana plasmática ou o citoesqueleto de actina cortical. Isso permite que os mecanismos de geração de força (por exemplo, o subtração-final dirigido movimento de Dineína corticalmente ancorada ao longo de microtúbulos) exercer forças de tração sobre os microtúbulos, e desse modo reposicionar o MTOC. CLIP-170 pode ligar à proteína associada a actina andaimes IQGAP123, e mostramos que ambos destas proteínas são necessários para a polarização induzida por BCR MTOC em direção a sinapse imunológica17. Essa interação IQGAP1-clipe-170 pode desempenhar um papel fundamental na coordenação a remodelação do citoesqueleto de actina com o reposicionamento da rede microtubule a sinapse imunológica célula B.

Microscopia de fluorescência convencional revelou a reorganização dramática do citoesqueleto de actina e microtúbulos durante a célula B sinapse imune formação2. No entanto, esta abordagem não pode resolver pequenas estruturas celulares em detalhe devido o limite de difração de luz, que, de acordo com a lei do Abbe, depende do comprimento de onda de luz que serve para iluminar a amostra e a abertura do objetiva24. Este limite de difração restringe a resolução dos microscópios de luz convencionais para 200-300 nm no sentido lateral e 500-700 nm na direção axial25. Portanto, menores estruturas subcelulares, bem como os detalhes do citoesqueleto de actina e microtúbulos, poderiam apenas ser observados usando microscopia eletrônica. Imagem de microscopia eletrônica do citoesqueleto é demorada, exige protocolos de fixação e preparação amostra dura que podem alterar estruturas biológicas e é limitado à detecção do anticorpo-negociada. A capacidade de delgados e simultaneamente várias proteínas de imagem ou estruturas celulares é uma vantagem substancial de microscopia de fluorescência. Além disso, expressar proteínas da fusão fluorescente em células permite a geração de imagens em tempo real e é útil quando não existem anticorpos eficazes para immunostaining da proteína de interesse.

Recentes avanços tecnológicos em microscopia de super-resolução superaram os limites de difração de luz e permitiu a visualização de estruturas celulares de nanoescala24. Uma tal técnica de microscopia de super-resolução chama-se microscopia de depleção (STED) emissão estimulada. STED emprega dois lasers, onde um laser excita o fluoróforo e um segundo laser com um padrão em forma de donut seletivamente suprime a emissão de fluorescência em torno do fluoróforo. Isto reduz a função de ponto-propagação (área aparente) de uma única partícula fluorescente e fornece um sub difração limite imagem fluorescente25,26. Microscopia de esgotamento do solo-estado também emprega técnicas baseadas em fluorescência para adquirir imagens de super-resolução. No entanto, os tempos de aquisição e reconstrução de imagem são longos, há apenas um número limitado de fluorophores que pode ser usado, e a imagem de alta resolução simultânea de vários componentes do citoesqueleto é tecnicamente desafiador porque manter estruturas de actina e microtúbulos requer procedimentos de fixação diferentes. Portanto, STED tem várias vantagens sobre microscopia eletrônica e outra microscopia de super-resolução se aproxima em que oferece aquisição de imagem rápida, tem requisitos mínimos de pós-processamento e emprega a mesma fluorophores e técnicas de coloração que são utilizados para microscopia de fluorescência convencional de amostras fixas26.

Microscopia de super-resolução agora tem sido utilizada para visualizar estruturas de actina na sinapse imunológica em assassino naturais (NK) células e T células26,,27,28,29,30, 31. no entanto, imagem de super-resolução de citoesqueleto do microtúbulo, bem como a reorganização coordenada do citoesqueleto de actina e microtúbulos durante a formação da sinapse imunológica, só foi recentemente relatado17. Nós costumávamos microscopia STED células de imagem B que tinham sido autorizadas a espalhar em lamelas revestidas com anti-imunoglobulina (anti-Ig) anticorpos que estimulam a BCR sinalização e iniciar a reorganização do citoesqueleto. Quando banhado em imobilizado anticorpos anti-Ig, células B submeter-se dramática dependente de actina se espalhando, que recapitula os eventos iniciais durante a formação da sinapse imunológica. Importante, microscopia STED revelou os detalhes do anel dendrítica de F-Actina que formulários na periferia de imune a sinapse e mostraram que o MTOC, bem como os microtúbulos ligados a ela, havia se mudado perto o antígeno contato local17. Estes microtúbulos estendido para fora para o anel periférico de F-Actina. Além disso, imagens de STED multi cor de várias combinações de F-Actina, tubulina, IQGAP1 e GFP-etiquetado CLIP-170 + dicas mostraram que microtubule mais fins-de-marcados pelo CLIP-170-GFP eram intimamente associados com a malha de actina periférica e com IQGAP1, um proteína de captura cortical17.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o citoesqueleto de actina e microtúbulos na sinapse imune usando microscopia STED de imagem. Esses métodos foram otimizados usando a linha de murino B célula A20, que tem sido amplamente utilizada para estudar a sinalização BCR e sinapse imune formação17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. porque anticorpos comerciais para CLIP-170 não funcionou bem para immunostaining em experiências anteriores, descrevemos em detalhe a expressão de GFP-etiquetado CLIP-170 nas células A20, juntamente com protocolos para a visualização em simultâneo de até de coloração três componentes do citoesqueleto ou proteínas de citoesqueleto associadas. Métodos para usando microscopia STED actina imagem em sinapses imunes do NK células têm sido descritos anteriormente40. Aqui, podemos estender esta para aquisição de imagens de resolução super multi cor do citoesqueleto de actina e microtúbulos nas células B.

Uma consideração crítica para microscopia de super-resolução é usando os procedimentos de fixação adequadas para a manutenção de estruturas celulares e prevenção de danos às proteínas fluorescentes. A fixação e coloração métodos aqui apresentados foram otimizados para reter a fluorescência de GFP e fornecer imagens de alta resolução das redes de actina e microtúbulos. Quando expressar proteínas fluorescentes, deve notar-se que as células B são geralmente difíceis de transfect. Usando este protocolo, 20-50% de A20 células geralmente expressam a proteína de fusão de GFP transfectada, e entre esta população, os níveis de expressão da proteína são variáveis. Não obstante, imagem latente de super-resolução de actina e microtúbulos usando os procedimentos que descrevemos é bastante robusto e imagens de alta qualidade são facilmente obtidas. Apesar de seu tamanho pequeno em relação as células A20, mostramos que esses procedimentos também podem ser usados para a rede de microtúbulos na primárias células B que foram ativados brevemente com lipopolissacarídeo (LPS) de imagem. Temos demonstrado que as células B primárias LPS-ativado podem ser transfected com siRNAs com eficiência relativamente alta (ou seja, tal que a depleção de proteína pode ser detectada pelo immunoblotting), tornando-os uma boa alternativa para o uso de linhas de células B para alguns estudos 17.

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Protocolo

Todos os procedimentos de animais foram aprovados pela Universidade de British Columbia Animal conta Comité.

1. expressar proteínas GFP-fusão células A20 B-linfoma

  1. Células de cultura A20 em completar meio RPMI (RPMI-1640 suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS), 50 µM 2-Mercaptoetanol, glutamina 2mm, piruvato de 1 mM, 50 penicilina U/mL e 50 µ g/mL Estreptomicina) a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos com 5 % CO2.
  2. Preparar o reagente de transfeccao (consulte a Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
    Nota: Este protocolo foi otimizado para os reagentes específicos e protocolo do transfection descrito na Tabela de materiais. Outros reagentes de transfecção que tentamos não deram suficiente eficiência do transfection.
  3. Conte as células usando um hemocytometer. Centrífuga de 2.5 x 106 A20 células (para cada transfeccao) durante 5 min à x 525 g. Ressuspender as células em 100 µ l de reagente de transfeccao contendo de 1 a 2,5 µ g do ADN do plasmídeo. Para DNA codificação CLIP-170-GFP23, use 2,5 µ g por transfecção. Misture suavemente.
  4. As células de transferência de um bem de uma placa de 6 e ajustar o volume de 2 mL com o meio RPMI pré-aquecido completo. Cultura de células para 18 h a 37 ° C, para permitir a expressão da proteína.

2. isolar células primárias do B e ativando-os com LPS

  1. Use esterilização de instrumentos cirúrgicos para remover o baço de um rato, seguindo o protocolo aprovado pelo Comitê de cuidado Animal da instituição.
  2. O capuz de cultura de tecidos, coloque um coador de pilha de estéril 70-µm em um prato de cultura de tecidos de 35mm contendo 3 mL de PBS estéril de temperatura. Use a parte de borracha do êmbolo de uma seringa de 5 ml para esmagar o baço através do filtro de célula.
  3. Pipetar a suspensão única célula de splenoctyes em um tubo estéril 15 mL e centrifugar 525 x g por 5 min.
  4. Uso um isolamento magnético baseado em grânulo de células B kit (veja a Tabela de materiais) para obter uma população altamente enriquecida de células B.
  5. Ressuspender as células B de 3 x 106/mL em meio RPMI completo suplementado com 2,5 µ g/mL LPS mais 5 ng/mL B célula ativando o fator (BAFF; uma citocina de sobrevivência).
  6. Cultura de células para hr 6 a 37 ° C.

3. revestimento as lamelas de vidro com anticorpos Anti-Ig

  1. Prepare a solução de anticorpo para revestir as lamelas. Diluir a solução-mãe de anticorpos Ig de cabra anti-mouse em PBS estéril de temperatura ambiente para fazer uma solução de 12,5 µ g/mL; 400 µ l de solução de anticorpo é necessária para cada lamela.
    Nota: Use o cabra anti-mouse IgG para células A20; Use o cabra anti-mouse IgM para primário de células B. Anticorpos IgG cabra não se ligam bem a receptores de Fc de rato. No entanto, para evitar qualquer potencial ligação ao receptor Fc, um pode usar F(ab) ou F(ab')2 fragmentos do anti-mouse IgG ou anticorpos de IgM antirato.
  2. Mergulhe uma lamela de vidro redondo-18mm #1.5 em metanol 100% e deixe secar completamente (~ 10 min).
  3. Usando a pinça, coloca a lamela seca para uma cultura de tecidos de 12 poços placa e pipetar 400 µ l da 12,5 µ g/mL anticorpo solução (5 µ g total; 2 µ g/cm2) no sentido da lamela para que forma uma bolha no centro da lamela e se espalha para as bordas.
  4. Tenha cuidado para cobrir a lamela toda, mas não permitem a solução de anticorpo para ultrapassar a borda da lamela de vidro e em plástico a cultura de tecidos. Incube a temperatura ambiente por 30 min.
  5. Lave as lamínulas por pipetagem 1 mL de PBS estéril para o bem e, posteriormente, aspirar a solução. Repita mais duas vezes para remover anticorpos não acoplados.
  6. Adicione 1 mL de PBS estéril para o bem que contém a lamela de anticorpo-revestido até células estão prontas para serem adicionados.
    Nota: As lamelas podem ser mantidas em temperatura ambiente, coberta com PBS, para uso no mesmo dia.

4. as células B se espalhando em lamelas Anti-Ig-revestido

  1. Prepare-se modificado tampão HEPES salina (mHBS): 25mm HEPES, pH 7.2, 125 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1mm Na2HPO4, 0,5 mM de MgSO4, glicose de 1 mg/mL, glutamina 2mm, piruvato de sódio de 1 mM e 50 µM 2-Mercaptoetanol). Filtro de esterilizar esta solução e armazenar a 4 ° C.
  2. No dia do experimento, fazer 50 mL de mHBS com 2% FBS (mHBS-FBS), adicionando 1 mL de FBS inactivadas pelo calor para 50 mL mHBS. Aquecer as mHBS-FBS a 37 ° C antes do uso.
  3. Centrifugar as células A20 transfectadas ou as células B primárias que tinham sido cultivadas com BAFF além de LPS em 525 x g durante 5 min.
  4. Ressuspender as células em 1 mL de mHBS-FBS, contar as células usando um hemocytometer e diluir as células de 2 x 105 células/mL em mHBS-FBS.
  5. Usando fórceps, transferi a lamela da placa de cultura de tecido para um pedaço de filme de parafina.
  6. Adicione 250 µ l de células B (5 x 104 células) para cada lamela.
  7. Incube as lamelas a 37 ° C por 15 min no escuro para permitir que as células B espalhar sobre a superfície anti-IgG-revestido.

5. fixação e Immunostaining as células

  1. Prepare a solução de fixação diluindo a solução estoque de paraformaldeído 16% e a solução de reserva de 50% de glutaraldeído em água à temperatura água destilada para produzir concentrações finais de 3% paraformaldeído e 0,1% de glutaraldeído. Prepare a solução de fixação no dia é para ser usado e descartar qualquer excesso.
    Atenção: As soluções estoque paraformaldeído e glutaraldeído só devem ser usadas em uma coifa de química. Siga as instruções na folha de dados de segurança material (MSDS).
  2. Preparar o buffer de permeabilização/bloqueio (BSA 3% e 0,1% Triton X-100 diluído em PBS). Filtro de esterilizar esta solução e armazenar a 4 ° C. No dia do experimento, aquecer a quantidade necessária à temperatura ambiente.
  3. Prepare o buffer de coloração (1% BSA e 0,1% saponina em PBS). Esterilizar esta solução usando um filtro de 0,2 µm e armazenar a 4 ° C. No dia do experimento, aquecer a quantidade necessária à temperatura ambiente.
  4. Pipeta 350 µ l da solução de fixação no sentido cada lamela, garantindo que a superfície está completamente coberta. Incube a temperatura ambiente por 10 min no escuro.
  5. Remova a solução de fixação de lamela aspirando cuidadosamente da borda da lamela usando uma micropipetas.
    Atenção: A solução de fixação deve ser eliminada como resíduos químicos perigosos.
  6. Lave as lamínulas uma vez com 500 µ l de tampão de permeabilização/bloqueio. Pipetar o líquido.
  7. Permeabilize e bloquear as células adicionando 250 µ l de tampão de permeabilização/bloqueio para cada lamela, e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro.
  8. Dilua a 1: 100 do anticorpo antitubulina coelho de coloração, o tampão.
  9. Aspire o buffer permeabilização/bloqueio das lamelas e adicionar 50 µ l da solução diluída anticorpo antitubulina para cada lamela. Incube a temperatura ambiente por 30 min no escuro.
  10. Prepare a solução de mancha do anticorpo secundário/actina diluindo o anticorpo secundário da Alexa Fluor 532-conjugados cabra anti-coelho IgG e Alexa Fluor 568-conjugados faloidina 1: 100 de coloração, o tampão.
  11. Lave as lamelas 3 vezes para remover o excesso anticorpo primário adicionando 500 µ l de tampão de coloração e em seguida por aspiração.
  12. Adicionar 50 µ l de solução de mancha do anticorpo secundário/actina para cada lamela e incube por 30 min à temperatura ambiente no escuro.
  13. Lave as lamelas 3 vezes para remover o excesso anticorpo secundário adicionando 500 µ l de tampão de coloração e em seguida por aspiração.
  14. Adicione 10 µ l de reagente de montagem para uma lâmina de microscópio. Monte a lamela sobre a lâmina de microscópio com o lado da célula para baixo.
    Nota: Um meio de montagem de "anti-fade" (ver Tabela de materiais) é altamente recomendável para preservar a intensidade da fluorescência das proteínas da fusão de GFP. Evite o uso de reagentes contendo DAPI, que pode interferir com a imagem do fluorophores quando usando o laser STED de montagem.
  15. Permitir que os slides para secar durante a noite no escuro. Os slides da imagem no dia seguinte.
    Nota: Os slides de imagem, tão logo a lamela é seca é altamente recomendável, como a fluorescência de GFP irá diminuir ao longo do tempo.

6. geração de imagens usando o microscópio STED

Nota: Por favor, note que todos os passos de software descritos abaixo são específicos para o microscópio e o software utilizados (consulte a Tabela de materiais). Os passos e configurações precisará ser ajustado se a imagem é executada usando um microscópio/software diferente.

  1. Ligue o microscópio STED, ativar o laser e a lâmpada de iluminação de epifluorescência e iniciar o software do microscópio.
  2. Defina os parâmetros para os lasers de depleção STED.
    Nota: Isso vai depender o microscópio específico a ser usado e os lasers que é dotado. Algumas recomendadas configurações são a luz branca (WLL) 70%; 592 nm laser 80%; 660 nm laser 80%.
  3. Activar as definições de STED e alinhar os raios de laser STED usando o objectivo X 100.
  4. Usando a ocular, concentrar a amostra e selecionar uma célula com expressão moderada de GFP.
    Nota: A expressão baixa GFP não será visível porque STED reduz a intensidade de emissão. Por outro lado, alta expressão de CLIP-170-GFP induz a formação espontânea de grandes aglomerados, que não reflete o normal microtubule plus-final proteína complexa morfologia e distribuição. Selecionando uma célula com expressão moderada de GFP é essencial para imagens com precisão as estruturas do citoesqueleto no local de contato do antígeno.
  5. Zoom em célula selecionada e escolha a região de interesse para ser fotografada. Ajuste o foco para que no plano x-y da célula B que está mais próximo da lamela está em foco.
    1. Para fazer isso, mova o objectivo progressivamente mais perto para a lamela para que as estruturas do citoesqueleto da célula B entram em foco e depois ir fora de foco. Então gradualmente mover o objetivo na direção oposta, até as estruturas do citoesqueleto da célula B primeiro voltar em foco.
  6. Otimize as configurações, incluindo o poder do laser, feixe de excitação e gama do detector. Iniciar com as configurações recomendadas pelo fabricante. Fazendo ajustes necessários para otimizar o sinal para as amostras. Todas as amostras para ser comparado com os outros com as mesmas configurações da imagem.
  7. Sob a aba "adquirir" do software, como a aquisição de imagem aquisição sequencial de quadro no painel do canto inferior esquerdo "Varredura sequencial" marcando a opção "entre quadros".
  8. Defina a sequência de aquisição.
    Nota: Adquirimos a fluorescência de GFP primeiro para evitar a degradação do sinal de GFP.
    Dependendo da combinação de fluorophores usados além de GFP, imagem do sinal de fluorescência de comprimento de onda mais primeiro pode produzir melhores resultados. No entanto, a ordem em que os fluorophores ou proteínas fluorescentes são sujeitos ao esgotamento de emissão estimulada e fotografadas deve ser otimizada para obter os sinais de fluorescência mais fortes e melhor resolução.
  9. Selecionar e definir a potência do laser STED para cada fluoróforo sob a aba "Acquire" do software e use a barra deslizante para o 592-nm ou o laser STED 660 nm para ajustar a potência do laser. Ajuste a potência para o esgotamento de 592-nm laser para as boas práticas agrícolas e Alexa Fluor 532. Ajuste a potência do laser de 660 nm esgotamento para Alexa Fluor 568.
  10. Para aumentar a resolução e reduzir o sinal de fundo, vá para as configurações de "Aquisição" sob a aba "Acquire" do software, aumentar a linha e/ou quadro, em média, selecionando um valor maior que 1, usando o menu suspenso para cada opção.
  11. Também, adquirir o sinal fluorescente usando STED dependentes de tempo, verificando a opção associada para o fluoróforo sob a aba "Adquirir" e especificando valores para retenção de tempo (ver nota abaixo). Aumente a potência do laser STED para melhorar a resolução, embora isso também aumentará fotobranqueamento do fluorophores.
    Nota: O tempo associado precisará ser otimizado para o microscópio, amostra e fluorophores sendo usado. Um tempo de retenção de 0,3 a 6 ns é recomendado. Após a fixação, a GFP é particularmente sensível ao poder do laser de alta. Para reduzir o fotobranqueamento de GFP, tempo de retenção deve ser aplicada e a potência do laser STED deve ser reduzida.
  12. Para capturar imagens STED 3D, use o controle deslizante para alterar o ponto de espalhar função (PSF) para "STED 3D".
  13. Manualmente adquira várias imagens para garantir a reprodutibilidade. Deconvolve as imagens (ver Figura 1) usando um software de deconvolução pacote41(ver Tabela de materiais).

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Resultados

Para as pilhas de B se espalhando em imobilizado anti-Ig, microscopia STED usada em conjunto com software de deconvolução fornece imagens de alta resolução de estruturas do citoesqueleto de microscopia confocal. Isto é evidente na Figura 1, onde a rede de F-Actina foi visualizada usando o protocolo descrito acima. Uma comparação de confocal e imagens de super-resolução STED da mesma amostra mostra que as imagens STED são de resolução mais alta e revelam mais ...

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Discussão

Imagens detalhadas das estruturas do citoesqueleto podem ser obtidas usando microscopia de super-resolução STED, que teoricamente pode alcançar uma resolução de 50 nm, em comparação com microscopia confocal convencional, para os quais a resolução de difração limitada é ~ 200 nm 24. a capacidade de resolver estruturas mais finas é reforçada por usando deconvolução software para calcular a posição mais provável da fonte de luz original do sinal de fluorescência "turva" observados. Este protocolo des...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos o Instituto de ciências biomédicas da UBC (LSI) Imaging Facility para apoiar e manter o microscópio STED. Este trabalho foi financiado por grant #68865 dos institutos canadenses de pesquisa em saúde (M.R.G.). Agradecemos o Dr. Kozo Kaibuchi (Universidade de Nagoya, Nagoya, Japão) para o plasmídeo CLIP-170-GFP.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cultura de células
A20 células de linfoma B de camundongoATCCTIB-208Linfoma murino de células B de origem Balb/c que expressa um BCR contendo IgG em sua superfície
RPMI-1640Thermo Fisher Scientific  R0883
Soro bovino fetalThermo Fisher Scientific12483020Inativar o calor a 56 oC por 30 min
2-mercaptoetanolMillipore SigmaM3148
GlutaminaMilliporeSigma G5763
Piruvato de sódioMillipore SigmaP5280
Penicilina-estreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122Liquid, 10.000 unidades
Materiais adicionais para células B primárias
70-µ filtro de células mCorning352350
Kit de isolamento de células B baseado em esferas magnéticasStemcell Technologies19854EasySep Kit de isolamento de células B de camundongo
Lipopolissacarídeo (LPS)Millipore SigmaL4391LPS de E. coli 0111:
Fator de ativação de células B B4 (BAFF)R& D Systems2106-BF-010
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
TransfecçãoCodificação de
plasmídeo CLIP-170-GFPPresente do Dr. Kozo Kaibuchi (Universidade de Nagoya, Nagoya, Japão); descrito em Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002
Reagentes e equipamentos de transfecção recomendados
Amaxa Kit de nucleofecção VLonzaVCA-1003Siga as instruções do fabricante para misturar os reagentes de transfecção com o DNA
Amaxa Nucleofector modelo 2bLonzaAAB-1001Programa L-013 usado
Placas Falcon de 6 poços, tratadas com TC, estéreisCorning353046
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cobertura de lamínulas
18 mm de diâmetro redonda #1.5 óculos de cobertura ThomasScientific1217N81Produto similar: Catálogo Marienfield-Superior #117580
FórcepsFisher Scientific1381242Pinça de lasca extra fina
Falcon Placa de cultura de tecido estéril de poliestireno de 12 poçosCorning353043
100% metanolFisher ScientificA412-4
Solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) sem cálcio ou magnésioThermo Fisher Scientific10010049
anticorpo IgG anti-rato de cabraJackson ImmunoResearch115-005-008Para células A20
Anticorpo IgM anti-rato de cabraJackson ImmunoResearch115-005-020Para células B primárias de camundongo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Coloração
Paraformaldeído (solução estoque a 16%)Microscopia Eletrônica Ciências15710Diluir com PBS até a concentração
de trabalho Glutaraldeído (solução estoque a 50%)Millipore Sigma340855Diluir com PBS até a concentração de trabalho
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
SaponinaMillipore SigmaS2149
Albumina de soro bovino (BSA), Fração VMillipore Sigma10735094001
Anticorpo anti-tubulina de coelhoAbcamab52866Diluição de 1:250 recomendada, mas deve ser otimizada
Alexa Fluor 532-conjugado cabra anti-coelho IgG ThermoFisher ScientificA11009Diluição 1:100 recomendada, mas deve ser otimizada
Alexa Fluor 568-conjugada faloidinaThermo Fisher ScientificA12380Diluição 1:100 recomendada, mas deve ser otimizada
Prolongar Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970Sem DAPI
Lâminas de Microscópio Fisherbrand Superfrost Plus FisherScientific12-550-15
Nome<strong>EmpresaNúmero de CatálogoComentários
Materiais
ParafilmVWRP1150-2
HEPESMillipore SigmaH3375
NaClFisher ScientificBP358
KClMillipore SigmaP9333
CaCl2Millipore SigmaC1016
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500
MgSO4Fisher ScientificM63
DextroseFisher ScientificD16-500
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscopia
Leica SP8 TCS STED microscópioLeica
Huygens software de deconvoluçãoScientific Voume ImagingVeja https://svi.nl/HuygensProducts

Referências

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