Aqui são apresentados dois métodos para determinar a função de barreira intestinal. Um medidor epitelial (volts/ohms) é usado para a medição da resistência elétrica transepitelial de epitélios cultivadas diretamente nos poços de cultura de tecidos. Nos ratos, o método de gavage FITC-dextrano é usado para determinar a permeabilidade intestinal na vivo.
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Artigo de método
In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A barreira intestinal defende contra microorganismos patogênicos e toxinas microbianas. Sua função é regulada pela célula epitelial integridade e permeabilidade da junção apertada, e perturbações da função de barreira intestinal contribuem para a progressão da doença sistêmica e gastrointestinal. Dois métodos simples são descritos aqui para medir a permeabilidade do epitélio intestinal. In vitro, células Caco-2BBe são banhadas em poços de cultura de tecidos como uma monocamada e resistência elétrica transepitelial (TER) pode ser medida por um medidor de epiteliais (volts/ohms). Este método é convincente devido à sua operação user-friendly e repetibilidade. Os ratos in vivo são gavaged com 4 kDa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano e as concentrações de FITC-dextrano são medidos em amostras de soro coletadas de ratos para determinar a permeabilidade epitelial. Gavagem oral fornece uma dose exata e, portanto, é o método preferido para medir a permeabilidade intestinal na vivo. Tomados em conjunto, estes dois métodos podem medir a permeabilidade do epitélio intestinal em vitro e em vivoe, portanto, ser usados para estudar a conexão entre as doenças e a função de barreira.
Introdução
Células epiteliais intestinais não são apenas responsáveis pela absorção de nutrientes, mas também formam uma barreira importante para a defesa contra microorganismos patogênicos e toxinas microbianas. Esta função de barreira intestinal é regulada pela junção apertada permeabilidade e células epiteliais integridade1,2,3, e disfunção da função de barreira epitelial está associada com inflamação intestinal doença (IBD). O anel de actomyosin de perijunctional (PAMR) encontra-se dentro da célula que é estreitamente contígua às junções apertadas. A contração da PAMR, que é regulad....
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Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo cuidado Animal e usar protocolo de Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU), Universidade de Soochow.
1. chapeamento e manutenção de Caco-2bbe na membrana porosa de policarbonato
- Desenvolvem-se células em balão T75 mídia (DMEM contendo 10% FBS). Frascos devem ser alimentados regularmente, dependendo da densidade da célula.
Nota: Para o chapeamento ideal, células devem dividir rapidamente e têm uma forma plana "frito-ovo", que indica que as células estão em fase de crescimento. - Uma vez que as células são 80% de confluencia, pegue o frasco fora da incubadora e remova a mídia. Enxague....
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Resultados
Na cultura, células Caco-2BBe crescem como uma monocamada em lentamente se diferenciar em enterócitos absorção maduros que têm fronteiras de escova. Neste protocolo, células Caco-2BBe foram revestidas com uma alta densidade nas membranas de policarbonato, e células alcançou a confluência de 100% um dia após a semeadura. No entanto, as células são indiferenciadas nesta fase: para diferenciar totalmente as células, a mídia é alterada a cada 2-3 dias por 3 semanas. As células foram coradas c.......
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Discussão
Existem vários passos críticos no protocolo. Células caco-2BBe (fronteira de escova-expressando) sempre são utilizadas para medição de TER, seleccionada a partir da linhagem de células Caco-2 para expressão de proteínas de escova-fronteira. Caco-2BBe células têm um fenótipo de absorção das vilosidades quando totalmente diferenciadas (após cerca de 3 semanas de pós-confluência cultura)17. É necessário para evitar a contaminação durante a medição e para esterilizar o eletrodo. Porque o procedimento .......
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Divulgações
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. Jerrold R. Turner, do Hospital Brigham e feminino, Harvard Medical School, por sua generosa ajuda na conclusão deste estudo. Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (número de concessão 81470804, 31401229 e 81200620), a ciência Natural Fundação da província de Jiangsu (número de concessão BK20180838 e BK20140319), o programa de inovação de pesquisa para Graduados faculdade da província de Jiangsu (número de concessão KYLX16-0116), avançada pesquisa projetos de Soochow University (número de concessão SDY2015_06) e Crohn e colite Foundation Research Fellowship Award (conceder número 310801).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulha de gavagem de 22 G | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Placas pretas de 96 poços para fluorescência | Fisher | 14-245-197A | |
| C57 / B6 camundongos | Nanjing Biomedical Research Institute da Universidade | ||
| Células Caco-2BBe | ATCC | CRL-2102 | |
| Sulfato de dextrano de sódio | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED com alto teor de glicose e piruvato de sódio | Hyclone | SH30243.01B | |
| Medidor Epitelial (Volt/Ohm) | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Etanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | ||
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Microscópio de fluorescência | Olympus | FV1000 | |
| Fluorômetro | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 0,4 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 5,0 mM KCl, 0,3 mM KH2PO4, 15,0 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 25 mM de glicose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Centro de Incorporação de Tecidos Modulares | Leica | EG1150H | |
| Tubos de coleta de soro | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| Frasco T75 | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Membranas de policarbonato (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Bomba de pressão | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Microtomia rotativa | Leica | RM2235 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xileno | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
Referências
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nature reviews. Gastroenterology & ....
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Reimpressões e permissões
