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Artigo de método

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

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DOI:

10.3791/57032

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19 de outubro de 2018

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1Jiangsu Key Laboratory of Neuropsychiatric Diseases and Cambridge-Suda (CAM-SU) Genome Resource Center, Soochow University, 2Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui são apresentados dois métodos para determinar a função de barreira intestinal. Um medidor epitelial (volts/ohms) é usado para a medição da resistência elétrica transepitelial de epitélios cultivadas diretamente nos poços de cultura de tecidos. Nos ratos, o método de gavage FITC-dextrano é usado para determinar a permeabilidade intestinal na vivo.

Resumo

A barreira intestinal defende contra microorganismos patogênicos e toxinas microbianas. Sua função é regulada pela célula epitelial integridade e permeabilidade da junção apertada, e perturbações da função de barreira intestinal contribuem para a progressão da doença sistêmica e gastrointestinal. Dois métodos simples são descritos aqui para medir a permeabilidade do epitélio intestinal. In vitro, células Caco-2BBe são banhadas em poços de cultura de tecidos como uma monocamada e resistência elétrica transepitelial (TER) pode ser medida por um medidor de epiteliais (volts/ohms). Este método é convincente devido à sua operação user-friendly e repetibilidade. Os ratos in vivo são gavaged com 4 kDa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano e as concentrações de FITC-dextrano são medidos em amostras de soro coletadas de ratos para determinar a permeabilidade epitelial. Gavagem oral fornece uma dose exata e, portanto, é o método preferido para medir a permeabilidade intestinal na vivo. Tomados em conjunto, estes dois métodos podem medir a permeabilidade do epitélio intestinal em vitro e em vivoe, portanto, ser usados para estudar a conexão entre as doenças e a função de barreira.

Introdução

Células epiteliais intestinais não são apenas responsáveis pela absorção de nutrientes, mas também formam uma barreira importante para a defesa contra microorganismos patogênicos e toxinas microbianas. Esta função de barreira intestinal é regulada pela junção apertada permeabilidade e células epiteliais integridade1,2,3, e disfunção da função de barreira epitelial está associada com inflamação intestinal doença (IBD). O anel de actomyosin de perijunctional (PAMR) encontra-se dentro da célula que é estreitamente contígua às junções apertadas. A contração da PAMR, que é regulada pela cadeia leve da miosina (MLC), é crucial para a regulação da junção apertada permeabilidade4,5,6,7,8, 9,10. Fator de necrose tumoral (TNF) é fundamental para a perda da barreira intestinal por estrogenos intestinal epitelial MLC quinase (houve) expressão e induzir a interiorização occludin11,12,13.

Íons como Cl– e at+ pode cruzar o espaço de paracellular pelos poros ou vazamento via14. Em um "vazamento" epitélio, alterações em TER principalmente refletem permeabilidade alterada junção apertada. Medição de TER é uma abordagem eletrofisiológica comumente usada para quantificar a permeabilidade de junção apertada, principalmente para at+ e Cl-, baseada-se a impedância de monocamadas de células. Tipos de diversas células, incluindo células epiteliais intestinais, células epiteliais pulmonares e vascular em células endoteliais, foram relatados para TER medições. As vantagens desse método são que TER medições são não-invasivo e podem ser usadas para monitorar as células vivas em tempo real. Além disso, a técnica de medição de TER é útil para de estudos de toxicidade de drogas15.

Caco-2BBe são células de adenocarcinoma colorretal epitelial humana com uma estrutura e função semelhante a pequenas células epiteliais intestinais diferenciadas: por exemplo, estas células têm microvilli e enzimas associadas com pequena escova intestinal fronteira. Portanto, monocamadas de Caco-2BBe cultivadas são utilizadas como um modelo in vitro para testar a função de barreira.

Em camundongos, uma forma de estudar a permeabilidade intestinal paracellular é medindo-se a capacidade do FITC-dextran cruzar do lúmen para o sangue. Assim, a permeabilidade intestinal pode ser avaliada por gavaging FITC-dextrano diretamente em ratos e medir a fluorescência dentro o sangue. O seguinte protocolo descreve dois métodos simples para avaliar a permeabilidade do epitélio intestinal tanto in vitro e in vivo.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo cuidado Animal e usar protocolo de Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU), Universidade de Soochow.

1. chapeamento e manutenção de Caco-2bbe na membrana porosa de policarbonato

  1. Desenvolvem-se células em balão T75 mídia (DMEM contendo 10% FBS). Frascos devem ser alimentados regularmente, dependendo da densidade da célula.
    Nota: Para o chapeamento ideal, células devem dividir rapidamente e têm uma forma plana "frito-ovo", que indica que as células estão em fase de crescimento.
  2. Uma vez que as células são 80% de confluencia, pegue o frasco fora da incubadora e remova a mídia. Enxague qualquer mídia residual com 1 a 2 mL de PBS estéril (sem o Ca2 +). Pipetar 1,5 mL do Trypsin-EDTA para o balão e suavemente agitar o frasco; em seguida, coloque o frasco na incubadora 37 ° C por 20 min sem balanço.
  3. Enquanto as células são trypsinizing, lugar insere contendo membranas porosas policarbonato (tamanho do pore, 0,4 µm; área de superfície, 0,33 cm2; ver Tabela de materiais) em placas de 24 poços. Adicione 1,0 mL de meio de cultura na câmara basal (o espaço inferior da membrana).
  4. Pipetar 5 mL de mídia para o balão e vigorosamente Pipetar as células contra o lado do balão de 5 - 10 vezes atingir células individuais, soltas ou 2-3 célula agrupa.
  5. Placa de 0,166 mL de células (alcançar uma diluição de 1:8) na câmara apical (o espaço superior da membrana). Incube a 37 ° C por até 3 semanas.
    1. Alimente as células três vezes semanalmente aspirando cuidadosamente a mídia do compartimento basal de cada poço usando uma bomba de pressão. Delicadamente, gotejamento 1ml de mídia na câmara apical de cada inserção.

2. uso de medidor epitelial (volts/ohms) para medir a TER

Nota: Após cerca de 3 semanas de cultura nas membranas de policarbonato, células Caco-2BBe estão prontas para TER medição.

  1. Para estudos de citocina, um dia antes da medição, substitua a mídia basal com mídia contendo 10 ng/mL de relato. No dia do experimento, substitua a mídia com HBSS contendo 2,5 ou 7,5 ng/mL de TNF.
    Nota: Tratamento de relato aumenta a expressão de receptores TNF 2 (TNFR2)16.
  2. Para corrigir o medidor, insira o eléctrodo de correção na porta de entrada e escolher o modo "Ohm". Ajuste o parafuso Adj R com uma chave de fenda até que o medidor mostra uma leitura de 1.000 Ω.
  3. Esterilizar os eléctrodos, colocando-os em etanol a 70% por 15-30 min e depois deixe-os secar ao ar para 15 s. Enxágue o eléctrodo em meios de cultura a célula experimental.
  4. Ligue a alimentação e escolher o modo "Ohm". Coloque cuidadosamente as extremidades longas das pontes eletrodo na câmara de basal e as extremidades curtas na câmara apical. Certifique-se de que os eléctrodos mais tocarem no fundo do prato, mantendo-se os eléctrodos menores abaixo da superfície da mídia mas acima as inserções de cultura de tecidos. Manter os eletrodos verticais.
  5. Medir a resistência da amostra inserções e inserções em branco (ou seja, a cultura insere sem células mas com HBSS) em 0, 1, 2, 3, 4 h após o tratamento de citocina. Registro da resistência.
  6. Para obter consistência em formatos diferentes de placa, calcule o produto da resistência e da área de membrana eficaz:
    figure-protocol-1
    Para inserções de 24-bem, a área de membrana eficaz é 0,33 cm2.

3. modelo murino de dextrano sulfato de sódio (DSS)-induzida colite

  1. Adicione DSS para água esterilizada para uma concentração final de 3,5% (wt/vol).
  2. Administrar 3,5% DSS para camundongos C57BL/6 machos de 8 semanas para um total de 7 dias. Dar água potável normal sem DSS aos ratos controle.
    1. Mude a água contendo DSS para regular de água potável após dia 7.
  3. Pesar de ratos e avaliar resultados clínicos de cada mouse todos os dias. Normalize o peso corporal de cada rato para seu peso corporal inicial. Pontuações são definidas de acordo com a severidade da doença por quatro parâmetros: prolapso retal (0-2), consistência de fezes (0-2), hemorragia (0-2) e atividade (0-2)5. Soma as pontuações desses parâmetros para um escore clínico final.
  4. Para analisar a condição histopatológica do tecido do cólon, eutanásia em ratos pela injeção intraperitoneal (i.p.), com 1,2% (vol/vol) tratamento do Avertin (0,6 mL/10 g de massa corporal) 7 dias post-DSS. Para preparar um estoque de 100% avertin, misture 10 g de 2, 2,2-tribromoetanol com 10 ml de álcool terc-Amil.  Armazenar no escuro a 4° C. Para usar, dilua o estoque de 100% para 2% em água.
  5. Isolar o cólon e o ceco e meça o comprimento do cólon5.
  6. Corte segmentos de 0,5 cm do cólon distal e correção em um tubo falcon de 15 mL contendo 10 mL de formol a 10% durante a noite. Lavar os tecidos fixos com classificados etanol (75, 95 e 100%) e xileno. Incorporar os tecidos em parafina e cortar seções de 6 mm para a hematoxilina & eosina coloração8.

4. medir a permeabilidade de barreira epitelial em camundongos colite induzida por DSS

  1. Medir a permeabilidade de barreira 7 dias após o início da administração de DSS.
  2. No dia do ensaio, rápido ratos para 3h.
  3. Autoclave a gavagem agulha para garantir a esterilidade, então gavage ratos com 150 µ l 80 mg/mL 4 kDa FITC-dextran em água estéril e manter o FITC-dextran não utilizado para medir a curva padrão após a coleta de soro. Pese os ratos para o cálculo da permeabilidade.
    Nota: A solução de dextran-FITC deve ser feita em água.
  4. Usando um par de tesouras, cortar um pedaço de 1 cm da cauda e coletar 100 µ l de sangue da cauda em tubos de colheita de soro. Gire o sangue coletado a 10.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  5. Dilua o soro 1:4 em água. Tornar-se um padrão curva, diluir FITC-dextran não utilizada com água a 1: 300, 1:1, 000, 1:3, 000, 01:10, 000, 01:30, 000, 1: 100, 000, 1: 300, 000, 1:1, 000, 000 e 1:3, 000, 000. Adicione 100 µ l/poço de soro e as amostras de curva padrão em placas de 96 poços.
  6. Lê a fluorescência em um leitor de placas com emissão de excitação/528 485. Calcular os valores de permeabilidade com base na curva padrão e multiplicar por 4 para corrigir a diluição.
  7. Divida a concentração de FITC-dextrano pelo peso para normalizar os valores (isso ajuda a normalizar a diferença na entrega FITC-dextran se ratos estão doentes e tem perdido peso).

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Resultados

Na cultura, células Caco-2BBe crescem como uma monocamada em lentamente se diferenciar em enterócitos absorção maduros que têm fronteiras de escova. Neste protocolo, células Caco-2BBe foram revestidas com uma alta densidade nas membranas de policarbonato, e células alcançou a confluência de 100% um dia após a semeadura. No entanto, as células são indiferenciadas nesta fase: para diferenciar totalmente as células, a mídia é alterada a cada 2-3 dias por 3 semanas. As células foram coradas c...

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Discussão

Existem vários passos críticos no protocolo. Células caco-2BBe (fronteira de escova-expressando) sempre são utilizadas para medição de TER, seleccionada a partir da linhagem de células Caco-2 para expressão de proteínas de escova-fronteira. Caco-2BBe células têm um fenótipo de absorção das vilosidades quando totalmente diferenciadas (após cerca de 3 semanas de pós-confluência cultura)17. É necessário para evitar a contaminação durante a medição e para esterilizar o eletrodo. Porque o procedimento ...

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Divulgações

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Agradecimentos

Agradecemos o Dr. Jerrold R. Turner, do Hospital Brigham e feminino, Harvard Medical School, por sua generosa ajuda na conclusão deste estudo. Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (número de concessão 81470804, 31401229 e 81200620), a ciência Natural Fundação da província de Jiangsu (número de concessão BK20180838 e BK20140319), o programa de inovação de pesquisa para Graduados faculdade da província de Jiangsu (número de concessão KYLX16-0116), avançada pesquisa projetos de Soochow University (número de concessão SDY2015_06) e Crohn e colite Foundation Research Fellowship Award (conceder número 310801).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha de gavagem de 22 GVWR20068-608
4 kDa FITC-dextranSigma46944
AvertinSigmaT48402
Placas pretas de 96 poços para fluorescênciaFisher14-245-197A
C57 / B6 camundongosNanjing Biomedical Research Institute da Universidade
Células Caco-2BBeATCCCRL-2102
Sulfato de dextrano de sódioMP Biomedicals2160110
DMED com alto teor de glicose e piruvato de sódioHycloneSH30243.01B
Medidor Epitelial (Volt/Ohm)Millicell-ERSMERS00002
EtanolSinopharm ChemicalReagent10009218
Falcon tube (15 mL)Corning
FBSGibco10437-028
Microscópio de fluorescênciaOlympusFV1000
FluorômetroBiotekSynergy 2
HBSS138 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 0,4 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 5,0 mM KCl, 0,3 mM KH2PO4, 15,0 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 25 mM de glicose 
IFNgPeproTech315-05-20
Centro de Incorporação de Tecidos ModularesLeicaEG1150H
Tubos de coleta de soroSarstedt41.1378.005
Frasco T75corning430641
TNFPeproTech315-01A
ParraffinSigmaA6330-1CS
Membranas de policarbonato (Transwell)Costar3413
Bomba de pressãoAUTOSCIENCEAP-9925
Microtomia rotativaLeicaRM2235
Tripsina-EDTAGibco25200-056
XilenoSinopharm ChemicalReagent10023418
de Nanjing430791

Referências

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