Artigo de método

Uma lapso de tempo, livre de rótulo, quantitativa fase estudo de células cancerosas humanas latentes e ativos de imagem

DOI:

10.3791/57035

⸱

16 de fevereiro de 2018

 ,  , 
1Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School and Boston Children's Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Fenótipos de célula dormente e ativo câncer foram caracterizados utilizando imagens de fase quantitativa. Ensaios de proliferação, migração e morfologia celular foram integrados e analisados em um método simples.

Resumo

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A aquisição do fenótipo angiogênico é um componente essencial da fuga da letargia do tumor. Embora vários clássicos em vitro ensaios (por exemplo, proliferação, migração e outros) e na vivo modelos foram desenvolvidos para investigar e caracterizar angiogênico e não-angiogênico fenótipos de célula, estes métodos são tempo trabalho intensivo e muitas vezes requerem reagentes caros e instrumentos, bem como competências significativas. Em um estudo recente, costumávamos uma novela fase quantitativa de imagem técnica (QPI) para realizar caracterizações de lapso de tempo e sem rotulagem de células KHOS humana osteossarcoma angiogênico e não-angiogênico. Um painel de parâmetros celulares, incluindo a morfologia celular, proliferação e motilidade, quantitativamente foram medidos e analisados usando QPI. Este romance e abordagem quantitativa fornece a oportunidade estudar continuamente e de forma não-invasiva relevantes processos celulares, comportamentos e características das células cancerosas e outros tipos de células de uma forma simples e integrada. Este relatório descreve nosso protocolo experimental, incluindo a preparação da pilha, QPI aquisição e análise de dados.

Introdução

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Um dos primeiros postos de controlo no desenvolvimento e progressão de um tumor sólido é a aquisição do fenótipo angiogênico, marca registrada do câncer. Esta progressão envolve uma variedade de processos bioquímicos e moleculares1,2,3. Um desafio técnico no estudo desta etapa chave na progressão do tumor é a falta de ferramentas de forma contínua e quantitativamente caracterizar e diferenciar entre fenótipos angiogênico e não-angiogênico das células de câncer ao vivo de forma imparcial. Os ensaios tradicionais sendo usados para investigar os comportamentos celulares das células angiogênico e não-angiogênico geralmente exigem instrumentos e reagentes caros, por exemplo, os ensaios de proliferação/migração celular4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14 ou complementares na vivo avaliações4,5,6,8,15,16, bem como exigindo intensiva e competências significativas consumo de tempo e mão de obra.

Recentemente, a fase quantitativa de imagem (QPI) surgiu como uma nova técnica que permite a avaliação de lapso de tempo e sem rotulagem de uma variedade de celular morfologia e comportamento parâmetros17,18,19, 20 , 21 , 22. ao contrário de microscopia óptica convencional, QPI quantifica o variações de mudança de fase pixel por pixel depois a luz passa através de um objeto óptico e reconstrói um holograma com espessura ótica convertida e volume, possibilitando assim o direto análise de células vivas e as seguintes características: (1) quantitativa de imagem, imagem (2) não-invasiva e lapso de tempo, (3) livre de etiqueta de imagem e (4) simultânea de imagem multi-parâmetros. Estas características fazem QPI uma ferramenta poderosa para avaliar e compreender os processos patológicos em nível celular.

Em um recente estudo, utilizamos o QPI para quantitativamente caracterizar e diferenciar entre angiogênico KHOS-A e fenótipos de KHOS-N não-angiogênico das células de osteossarcoma humana de forma sistemática e quantitativa, combinando análises da morfologia celular, proliferação e motilidade23. Usando software de análise de imagem, um painel de células morfológica e comportamento parâmetros quantitativamente foram comparados entre as células de osteossarcoma humana angiogênico e não-angiogênico e identificaram-se cinco características diferenças entre estes dois fenótipos. Esta nova abordagem fornece uma plataforma integrada e quantitativa para avaliar uma variedade de características celulares biologicamente relevantes.

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Protocolo

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Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela Comissão de biossegurança institucional Hospital infantil de Boston.

1. preparação da pilha

  1. Thawing KHOS-A e células -N
    1. Aquecer o meio de cultura, ou seja, Dulbecco modificado suplementado águia com 10% de soro fetal bezerro (vol/vol) (FBS) e 1% (vol/vol) penicilina/estreptomicina.
    2. Levar os frascos criogênicos de células do tanque de nitrogênio líquido, o fundo dos frascos o mergulhe em água morna em banho maria a 37 ° C e agite-os frascos criogênicos para acelerar o processo de descongelação. Manter a tampa dos frascos criogênicos de entrar em contato com a água para evitar a contaminação. Assim que as células são descongeladas, esterilize o frasco criogênico pulverizar solução de etanol 70% e limpando o frasco.
    3. Em uma capa de fluxo laminar, aspirar imediatamente a suspensão de eritrócitos do frasco criogênico e suspender suavemente em meio de cultura de 10ml aquecido (descrito em 1.1.1). Centrifugue suspensões celulares em aproximadamente 200 x g, durante 5-7 min.
    4. Ressuspender as células com meio de cultura de 10ml aquecido e transferir para um balão de T75. Pipete suavemente várias vezes para suspender células uniformemente com uma pipeta de 10 mL.
    5. Coloque o frasco em uma incubadora de 37 ° C com 5% (vol/vol) CO2 e ambiente umidificado. Permitir que as células anexar pelo menos 12 h.
    6. Incube as células por aproximadamente 3-7 dias até 80-100% de Confluencia. Altere o meio de cultura a cada 2-3 dias.
  2. Divisão KHOS-A e células -N
    1. Retire o balão, os meios de cultura.
    2. Lavar as células com 5 mL de PBS estéril (1x) sem cálcio e magnésio, para remover as células não aderentes ou fração.
    3. Adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA 0,05% para o balão, e brevemente, agite o frasco para assegurar que a tripsina-EDTA é dispersa uniformemente.
    4. Incube o frasco para 2-3 min em uma incubadora de 37 ° C ou 3-5 min à temperatura ambiente. Verifique as células sob um microscópio ampliação de aproximadamente 400 x para certificar-se que as células são arredondadas e desanexadas.
    5. Uma vez que as células são desanexadas, adicionar 10 mL de meio de cultura e pipetar suavemente o meio subindo e descendo várias vezes para quebrar agregados de células em uma suspensão de célula única usando uma pipeta de 10 mL.
    6. Contar as células usando um contador de célula. As sementes da suspensão celular novo T75 balões em uma densidade de 2 × 106 células ou um rácio de 1:4.
    7. Permitir que as células a crescer a confluência de 80-100% antes da semeadura para o experimento QPI.
  3. Células -N para QPI e semeadura KHOS-A
    1. Sementes KHOS-A e -N células em placas de 6-poços na densidade de 50.000-300.000 células/poço com 5 mL de meio de cultura depois de contar com um contador de célula.
      Nota: A densidade de semeadura é dependente da taxa de proliferação celular e o período de tempo a imagem para ter < confluência de 100% durante a aquisição de imagem.
    2. Incube as células pelo menos 12 h permitir a fixação.
    3. Mude o meio com mídia fresco antes de conduzir QPI.

2. QPI aquisição

  1. Lamínula, configurar
    1. Limpe a lamínula enxaguando-se várias vezes com água desionizada e esterilizar com solução de etanol 75% por imersão durante 15 min. colocar a lamínula em uma capa de fluxo de laminar estéril para secar.
    2. Coloque cuidadosamente o deslizamento da tampa em uma placa de 6-bem para evitar bolhas de óbvias. Certifique-se de que a parte inferior da lamínula está imerso nos meios de cultura (mínimo de 5 mL/poço).
    3. Coloque a placa em incubadora (37 ° C, 5% de CO2e umidificada atmosfera) para equilibrar pelo menos 15 min. Se formas de nevoeiro na lamínula, use um cotonete estéril para limpar.
  2. Imagem de células com um microscópio
    1. Abra o software para inicializar o sistema, incluindo auto calibração de tempo de exposição e contraste padrão ruído de holograma. Certifique-se que os valores são aceitáveis (mostrado na faixa verde ou amarela).
    2. Coloque a placa de 6 para o palco do microscópio QPI.
    3. Clique em "Captura dinâmica" e selecione "Manual" em "Foco Software." Grosseiramente, focar as imagens de fase de células, ajustando a distância de trabalho em "Configuração de microscópio" obter contornos para células em imagens de fase. Mudar para "Automático" em "Foco Software."
    4. Clique em "Nova experiência" para criar uma nova experiência. Começa com a seleção das posições de aquisição de imagem usando o mouse ou as teclas de seta no teclado numérico. Clique em "Remember" depois de cada seleção. Normalmente 3-5 locais para cada amostra são selecionados.
    5. Configurar os intervalos de imagem e o período de tempo na seção "Timelapse".
      Nota: Para rastrear as células cancerosas, claramente, os intervalos devem ser menores do que 5 min. 48 horas é definido como o período de tempo para a combinação de análise QPI.
    6. Inicie o experimento, clicando em "Capturar", que automaticamente irá concentrar-se e adquirir as imagens nos pontos de tempo de ajuste.

3. análise de dados

  1. Análise de morfologia celular
    1. Clique em "Identificar células." Ajuste a configuração numérica para "Limiar de fundo", para que áreas de célula são separadas bem do ruído de fundo. Ajustar o número de configuração para o "Tamanho do objeto" para certificar-se de que cada célula tem um núcleo. Manter parâmetros consistentes para amostras que precisam ser comparados, como estas podem afetar as medidas de área e volume finais. Modificar manualmente os segmentos de pilha usando "Alterações manuais", se necessário.
    2. Use a função "Analisar os dados" no software para analisar as células. Começar uma nova análise de dados, clicando em "Nova análise". Arraste imagens selecionadas para os "Quadros de fonte" guia e célula morfologia parâmetros incluindo área celular (µm2) espessura ótica (µm) e volume (µm3) para cada célula individual. Escolha dispersão enredo ou histograma modo e exportar dados como tabelas ou figuras.
  2. Análise da proliferação de células
    1. Selecione pelo menos 5 imagens para os tempo diferentes pontos de interesse (por exemplo, inicial, 12h, 24h, 36h e 48 h). Número de células de registro que é fornecido pelo software.
    2. Para estimar o tempo de duplicação, plotar o número de células após normalizar com os números iniciais e se encaixam com as curvas de crescimento exponencial.
  3. Análise de movimento de célula
    1. Use a função "Localizar células" no software. Clique em "Nova análise" para iniciar uma nova análise de dados. Série de arraste de imagens por um período de tempo selecionado (por exemplo, 4 h após incubação de 24h) na guia "Quadros de fonte" escolhe aleatoriamente 10-30 células clicando em células sob o modo de seleção "Adicionar células". Exclua as células com as bordas e os mover-se fora do campo de visão.
    2. Verifique cuidadosamente o acompanhamento de uma série de imagens. No caso em que o sistema perde o controle de uma célula ou faixas na cela errada, ajuste manualmente a célula de controle clicando em "Identificar" para identificar células ou clicando em "Modificar localização" sob a modalidade "Select" para modificar a localização da célula.
    3. Escolha rosa trama de trajetórias de célula em "Movimento de trama" ou trama para os outros parâmetros relacionados ao movimento em "Recursos de plotagem," como velocidade de motilidade (µm/h), motilidade (µm), migração (µm) e franqueza de migração. Exporte dados como tabelas ou figuras.

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Resultados

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A Figura 1 retrata uma caracterização da morfologia típica célula. Imagens são apresentadas como holografias (figura 1A-B) e imagens 2D (Figura 1-D). Espessuras de célula óptica (calculadas a partir do índice de refração e comprimento do percurso óptico) são quantificadas através do perfil de linha ou uma medição de célula inteira. Dispersão plota da área e espessura...

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Discussão

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Neste estudo, descrevemos um em vitro, não-invasivo e sem rótulo método usando QPI para caracterizar quantitativamente os fenótipos angiogênico e não-angiogênico das células humanas de osteossarcoma. Vários parâmetros celulares foram analisados simultaneamente por esse método integrado de alta produtividade, incluindo área de célula, espessura de célula, volume das células, taxa de proliferação, dobrando o tempo, franqueza de migração, velocidade de motilidade, migração e mobilidade.

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Os autores reconhecem com gratidão o apoio da Fundação de pesquisa do câncer de mama e a Advanced Medical Research Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Frasco T75Corning, NY, EUA353136
placas de 6 poços Corning, NY, EUA3506
Dulbecco' s meio de águia modificado (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, EUA11965092
Soro fetal bovino (FBS)Atlanta Biologicals, GA, EUAS11550
Penicilina EstreptomicinaThermo Fisher Scientific, MA, EUA15140122
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, EUA10010023
Contador Beckman Z1 CoulterBeckman Coulter, IN, EUAZ1 
HoloMonitor M4Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SuéciaM4Microscópio
HololidPhase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SuéciaPHI 8020
HStudioM4Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SuéciaHStudioM4Software

Referências

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