Neste artigo, um protocolo simples, econômico e otimizado é descrito que usa o método de corante azul de Evans para avaliar o extravasamento de plasma nos órgãos de ratos FVBN que pode ser adaptada para uso em outras cepas, espécies e outros órgãos ou tecidos.
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Artigo de método
Um otimizado Evans Blue protocolo para avaliar vazamento Vascular no Mouse
Neste artigo
Resumo
Resumo
Vazamento vascular ou extravasamento de plasma, tem um número de causas e pode ser uma grave consequência ou sintoma de uma resposta inflamatória. Neste estudo, finalmente, pode levar a novos conhecimentos sobre as causas ou novas formas de inibir ou tratar o extravasamento de plasma. É importante que os pesquisadores tenham as ferramentas apropriadas, incluindo os melhores métodos disponíveis, para estudar o extravasamento de plasma. Neste artigo, descrevemos um protocolo, usando o método do corante azul de Evans, para avaliar o extravasamento de plasma nos órgãos de ratos FVBN. Este protocolo é intencionalmente simples, para tão grande um grau possível, mas fornece dados de alta qualidade. Corante de azul de Evans foi escolhido principalmente porque é fácil para o laboratório de médio a usar. Usamos este protocolo para fornecer provas e suporte para a hipótese de que a enzima neprilysin que proteja a vasculatura contra extravasamento de plasma. No entanto, este protocolo pode ser usado experimentalmente e facilmente adaptado para uso em outras cepas de ratos ou em outras espécies, em muitos diferentes órgãos ou tecidos, para estudos, que pode envolver outros fatores que são importantes para a compreensão, prevenção ou tratamento de extravasamento de plasma. Este protocolo foi extensivamente otimizado e modificado de protocolos existentes e combina confiabilidade, facilidade de uso, economia e disponibilidade geral de materiais e equipamentos, fazendo com que este protocolo superior pelo laboratório média para uso em quantificando o extravasamento de plasma de órgãos.
Introdução
Vazamento vascular nos órgãos refere-se ao extravasamento, ou vazamento de plasma sanguíneo através de aberturas produzido no endotélio de pós capilares vênulas nos órgãos. Este extravasamento de plasma ou aumento da permeabilidade vascular, que pode decorrer de algum tipo de reacção inflamatória, pode ter graves consequências. Assim, é importante que este fenômeno, suas causas, moduladores e consequências, são estudadas e entendidas, e da mesma forma, que os investigadores têm boas ferramentas e protocolos com os quais a estudá-los. As lacunas endoteliais podem ser produzidas através de uma série de estímulos, mas geralmente são produzidas pela ação de neurotransmissores do peptide e/ou taquininas sobre o endothelia. Um dos principais mediadores naturais deste processo, o que resulta em extravasamento de plasma aumentado, é o undecapeptide tachykinin neuropeptide, substância P1.
Métodos para investigar e medir a permeabilidade vascular ou extravasamento de plasma, que usam a propriedade de ligação de albumina de corante azul de Evans, foram desenvolvidos e são geralmente conhecidos pela sua precisão, simplicidade, economia, segurança e capacidade de permitir que o determinação de extravasamento de plasma de vários tecidos ao mesmo tempo, se assim desejado2,3,4,5,6,7,,89 . Este protocolo de azul de Evans para avaliar o extravasamento de plasma nos órgãos de ratos FVBN usa todas essas, mas adiciona algumas importantes modificações que tornam geralmente útil e adaptável para futuros estudos, envolvendo o laboratório de médio que conduz ou será realizar estudos importantes de fatores associados com extravasamento de plasma ou a permeabilidade vascular. Neste protocolo, a substância P é introduzido aos ratos 1 nmol/kg, o que aumenta o extravasamento de plasma por 1.5-fold. Isto aumenta a sensibilidade do protocolo, resultando em resultados mais facilmente observáveis e alcançável. Outros fatores que afetam a permeabilidade, como vários outros peptídeos, substâncias químicas ou algumas formas de lesão tóxica, podem ser usados ou estudados por outros laboratórios, como desejado. Veia jugular injeções são utilizadas neste protocolo apresentar azul de Evans e substância P sistemicamente, que requer cirurgia terminal. No entanto, veia jugular injeções5,7,10, mesmo após a consideração das necessárias técnicas cirúrgicas terminais, são mais fáceis de dominar e levam à produção de resultados mais consistentes do que outro injeções venosas, incluindo a cauda veia injeções4,9. Embora seja possível para Evans azul ser entregue por injeções de seio venoso orbital retrô, não há referências na literatura foram encontradas que usam este método de entrega de azul de Evans. No entanto, quanto a injeções de veia da cauda, o alto grau de especialização e prática reproducibly dominar esta técnica extremamente limita seu uso para injeções bem sucedidas de azul de Evans. Em contraste, o método de injeção alternativa veia jugular, conforme descrito em nosso protocolo, oferece uma solução tecnicamente obtenível. Um procedimento crucial para perfusão das veias do rato, realizado logo após o sacrifício do rato azul-perfundidos Evans, remove o excesso corante azul de Evans e tem sido padronizado neste protocolo. Métodos anteriormente descritos de perfusão foram cuidadosamente examinados e modificados para obter o presente procedimento. Outras modificações aqui descritas são todos otimizada, simples e barato.
Existem algumas limitações importantes de método de corante azul de Evans. Por exemplo, baixa sensibilidade, às vezes associada com este método pode impedir alguns adicional bruta exame patológico e histológica de tecidos de animais injetado azul de Evans. No entanto, estas e outras limitações conduziram ao desenvolvimento de métodos alternativos e modelos que, não obstante, ainda usam azul de Evans. A medição de azul de Evans por fluorescência (em vez de alcance visual) espectroscopia pode aumentar a sensibilidade do método. Além disso, a microscopia de fluorescência dos tecidos manchadas de azul de Evans foi desenvolvida para permitir a observação de vazamento vascular nas mais distintas localidades11. Também, todo o corpo de imagem e digitalização de um animal vivo previamente injetaram com Evans azul12 permite a investigação das concentrações de azul de Evans de forma contínua, em vez de em um específico escolhido tempo momento do experimento. No entanto, este método requer a disponibilidade de instalações adequadas de imagem e pode ser muito caro. Modificações envolvendo Evans azul e executados em um tipo in vitro do modelo, como em uma célula de cultura ou garota corioalantoicas modelo13 (CAM) também foram descritos. Estes modelos são monitorados por fluorescência e microscopia intravital14 e permitam a quantificação de alterações de permeabilidade vascular ao longo do tempo, mas podem levantar questões sobre modelagem exata das condições na vivo e também podem ser caro.
Há outros métodos desenvolvidos para determinar e quantificar vazamento vascular ou permeabilidade, que não envolvem a administração de azul de Evans. Esses métodos podem empregar uma molécula fluorescente apropriada (como albumina ou fluoresceína), ou uma molécula etiquetada desvendar etiquetada ou não, de animais vivos (ou a célula cultura ou corioalantoicas (CAM) modelos13, seguido por não-invasiva Imaging (digitalização de PET, MRI, microscopia intravital, varredura de corpo inteiro) ou por invasivas de imagens (microscopia fluorescente)3,12,15. Embora essas técnicas podem oferecer um número de vantagens sobre outros Evans métodos azuis, eles também têm desvantagens, que podem incluir seus consideráveis complexidades, necessária experiência, recursos e elevados custos monetários.
Neprilysin16 (peptidase enzima NEP, também conhecido como CD10, MME ou Enkephalinase) foi sugerido para ser envolvido na inibição de extravasamento de plasma, pelo menos em parte, através do metabolismo enzimático e inactivação de p. de substância endógena Assim, nos tecidos em que ocorre o peptidase de superfície celular NEP, pode haver uma atenuação do efeito da substância P, presumivelmente pela atividade peptidase de NEP.
Inicialmente, nós testamos para extravasamento de plasma induzido por substância P, utilizando este protocolo modificado de azul de Evans, com FVBN selvagem tipo (WT) e ratos de NEP nocaute (KO). Envolvimento do NEP no extravasamento de plasma aumentada de substância P suspeitou-se destes estudos iniciais, e nós descrever estas experiências ainda mais o papel do NEP envolvendo em extravasamento de plasma. No entanto, não é o foco deste manuscrito NEP ou seu papel no extravasamento de plasma, mas prefiro o extravasamento de plasma experimentos próprios. Os resultados do NEP são representativos do tipo de resultados que podem ser obtidos através do uso do presente protocolo modificado. O método de azul de Evans para medir o extravasamento de plasma foi otimizado e modificado, conforme descrito em detalhe abaixo para os ratos FVBN.
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Protocolo
Todas as orientações aplicáveis internacionais, nacionais e/ou institucionais para o cuidado e o uso de animais (ratos) foram seguidas nos experimentos descritos neste manuscrito.
Esse método usa ratos adultos FVBN, com idades entre 16-20 semanas, encontrado para ser o ideal para os fins deste estudo. Dia 1 inclui as etapas 1 a 5 e dia 2 inclui as etapas de 6-7 (Figura 1).
1. preparação do material
- Assegurar um fornecimento adequado de seringas descartáveis, esterilizadas e agulhas, se xilazina/cetamina é usada como anestésico (como recomendado). Se isoflurano é usado como anestésico, verifique se o tanque de oxigênio e o nível do líquido de isoflurano para certificar-se de que há um fornecimento adequado para o experimento antes de começar. Também, montar o cone do nariz respirando circuitos e anexá-los à caixa de indução; Anexe novos cilindros de carvão para os circuitos de respiração. Prepare a caixa de indução ligando o oxigênio e verificar que a segunda fase lê aproximadamente 50 psi.
- Ligue o aquecimento pad a 37 ° C.
- Prepare a sonda de temperatura retal para a cirurgia.
2. Mouse preparação
Esta etapa inclui anestesia, depilação e posicionamento (FVBN ratos-idade adulta 16-20 semanas).
- Pesar os ratos e registar os pesos.
- Anestesia os ratos.
- Administrar IP ketamina e xilazina (80-100 mg/kg e 7,5-16 mg/kg, respectivamente). No entanto, recomenda-se começar com doses menores de ketamina e xilazina (sobre 30 mg/kg e 6 mg/kg, respectivamente).
- Manter a anestesia com cerca de 0,1 - 0,25 vezes inicial doses de cetamina/xilazina durante a cirurgia. Ketamina e xilazina foram o agente anestésico (s) de escolha neste estudo específico, como observaram-se mais a reprodutibilidade e a capacidade de sobrevivência. O agente anestésico (s) de escolha em outros estudos pode ser encontradas para ser diferente. Se o isoflurano é usado, coloque o mouse em uma câmara de indução e ligue isoflurano para 5% até o mouse perde a consciência plena. Em seguida, use um cone de nariz nasal de isoflurano 1,5-2,5% no restante do processo.
- Monitore os ratos cada 2-3 min pitada de dedo do pé para verificar se há profundidade apropriada da anestesia.
- Raspe a região do pescoço ventral do mouse.
- Posicione o mouse na posição supina sobre a almofada pré-aquecido. Prenda as patas e pés do mouse à superfície com fita cirúrgica.
- Coloque a pomada de lágrima artificial para os olhos para evitar que sequem durante a cirurgia.
3. detalhes cirúrgicas
- Faça uma incisão de 1 cm no pescoço bem ventral sobre a veia jugular.
- Aplica uma ou duas gotas de lidocaína (1-2%) para a área de incisão para tratamento da dor e promover a vasodilatação. Espere 2 min. para a lidocaína seja efetivada.
- Expor e isolar a veia jugular interna direita através de dissecção romba. Amarrar a veia com sutura de 4-0 e gentilmente retrair extremidade rostral do navio com uma pinça hemostática. Corte um buraco, usando a tesoura bem, cerca de 3 mm abaixo ou caudal para a gravata, aproximadamente na metade do diâmetro da veia.
- Marcar um cateter de polivinil PV-1 1,5 cm da extremidade e inseri-lo na veia jugular no orifício, usando um dilatador de vaso e passe o cateter no caudal final do navio, cerca de 1,5 cm.
- Amarre o cateter firmemente dentro da parte caudal do navio (abaixo do corte), com seda 4-0. Amarre a parte rostral do navio à parte externa do cateter, com as pontas soltas da sutura que foi usado para amarrar a veia jugular rostral, na etapa 3.3.
- Aderência a pele frouxamente de volta ao redor do cateter com seda 4-0 para ajudar a prevenir a perda de calor do corpo e desidratação dos tecidos.
- Conectar o cateter a uma seringa contendo soro fisiológico heparinizado (10 U/mL) e irrigue o cateter.
4. injeções
- Injete a solução de azul de Evans (50 μL de solução 30 mg/mL em soro fisiológico a 0,9% normal, unheparinized, ou aproximadamente 50 mg/kg) o cateter da veia jugular, seguido por um pequeno volume de solução salina heparinizada para liberar a linha.
- 2 min depois, injetar substância P (100 μL de solução 0,3 mm em soro fisiológico a 0,9% normal, unheparinized, ou 1 nmol/kg), seguido por um pequeno volume de solução salina heparinizada para liberar a linha. Substância P aumenta o extravasamento de proteínas do plasma através da camada endotelial; neste protocolo, rotineiramente induz um aumento dos valores de extravasamento de plasma de aproximadamente 1.5-fold, facilitando a plasma valores de extravasamento medir.
- Espere 18 min depois que a substância P é injetado. Durante este tempo, o corante azul de Evans vai equilibrar e fazer circular.
- Encerrar o experimento 18 min após a injeção da substância P (20 min após a injeção de azul de Evans), sacrificando o mouse com deslocamento cervical. É provável que o mouse pode ser diretamente cervically deslocado, sem primeiro dar uma overdose de anestésico, como o mouse é provavelmente ainda bem anestesiado da cirurgia. No entanto, se for necessário, uma overdose de anestésico cetamina/xilazina, isoflurano, o pentobarbital pode ser dadas, seguido por deslocamento cervical.
5. isolamento dos órgãos
- Abrir a cavidade do peito do rato e gravidade-perfundir (de uma altura de cerca de 51 cm ou 20") o coração e os vasos sanguíneos com 50 mL de citrato de sódio de 50 mM, pH 3,5. pH 3.5 presumivelmente preserva a ligação azul de Evans a albumina.
- 1-5 órgãos pertinentes (tecidos) com um bisturi de dissecação (por exemplo, a bexiga urinária, rim, estômago, fígado, pâncreas, proximal ou distal do cólon, íleo, duodeno, flanco pele, orelhas, cauda, coração, e/ou pulmões) impostos especiais de consumo e remover qualquer conteúdo residual, se presente.
- Lave os órgãos em temperatura ambiente (RT) fosfato salino (PBS; 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 8,0 g de NaCl e 0,20 g de KCl em 1 L, pH 7,4).
- Blot-os órgãos com tecido, corte cada órgão ao meio, e pesar cada metade (molhado pesos, em g).
- Secar uma metade do tecido em um forno de secagem a 150 ° C, na folha, por 48 h.
- Coloque o metade em um volume consistente (até 200 µ l) de formamida em uma microcentrífuga tubo para 48 h (e até 72 h) outros tecidos para extrair o azul de Evans.
6. medição de tecido OD
- Retire 50 µ l de Evans azul-infundido formamida (após incubação de 48-72 h RT) do tubo de microcentrífuga e lugar para um poço de uma placa de poliestireno de 96 poços. Tenha cuidado para não transferir partes de tecido junto com o formamide.
- Colocar 50 µ l de formamida nova, pura, em cada um dos dois poços vazios da placa de 96 poços para os espaços em branco.
- Medir e registrar o OD620 de cada poço da placa de 96 poços em um leitor de placa de absorvância. 620 nm é a absorbância máxima de azul de Evans.
7. cálculo de extravasamento de Plasma
- Pesar o tecido seco metade que foi ao forno por 48 h.
- Calcule a relação de peso de peso molhado/seco para o órgão específico de interesse de cada mouse individual, começando com o peso molhado deste tecido metade (obtidos no passo 5.4), dividido pelo peso seco do tecido mesmo metade (obtidos no passo 7.1).
- Calcular o peso seco do tecido (em g) metade em formamida, dividindo o peso úmido do tecido metade antes que ele foi colocado em formamida (obtida na etapa 5.4) pelo molhado: relação de peso seco para o órgão específico de juros (calculados na etapa 7.2).
- Calcule os valores corrigidos de620 OD. Começando com o OD620 o valor de cada poço experimental da placa de 96 poços (contendo Evans azul-infundido formamide de cada tecido, obtido na etapa 6.3), subtrair o valor em branco bem OD620 (o OD620 valor médio de os dois poços que contêm o formamide puro, preparado na etapa 6.2, OD620 valores obtidos na etapa 6.3) de cada valor experimental.
- Calcule o valor de extravasamento de plasma dividindo o OD corrigido620 (calculado na etapa 7,4) por peso seco do tecido metade em formamida (calculado no passo 7.3). As unidades de extravasamento de plasma será o peso seco da OD620/g.
- Analisar dados e expresso como a média ± SEM. estatisticamente comparar grupos pelo teste t ou unidirecional análise de variância e teste de comparação múltipla de Scheffé (lycofs01.lycoming.edu), conforme o caso.
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Resultados
Na Figura 1, um esquema do procedimento é mostrado, que foi encontrado para resultar nos valores de extravasamento plasma induzido por substância P mais confiável e consistente de órgãos de ratos FVBN. Este procedimento geralmente leva dois dias de trabalho, separados pelo menos 48 h de tempo de espera. É possível para espalhá-lo ainda mais, se isso for feito consistentemente para todos os experimentos a serem comparadas. Por exemplo, depois que os órgãos são...
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Discussão
Como discutido acima, o estudo de extravasamento de plasma em última análise, pode levar a novos conhecimentos sobre as causas ou novas formas de inibir ou tratar o extravasamento de plasma. O uso bem sucedido do protocolo de extravasamento de plasma (acima), usando o corante azul de Evans, foi demonstrado no manuscrito atual. Embora os dados mostrados volta a hipótese que a NEP pode proteger a vasculatura contra extravasamento de plasma, este é um objetivo secundário atualmente, com o objetivo primário de apresentar um ...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores desejam agradecer a Andy Poczobutt e Dr. Jori Leszczynski pela valiosa ajuda e edições para este manuscrito. Apoiado por subvenções recebidas do coração nacional, pulmão e sangue Institute (NHLBI RO1 HL078929, HL014985 de PPG e RO3 HL095439) e assuntos do departamento de veteranos (revisão de mérito).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| isoflurano | Vet One | 200-070 | cetamina anestésica inalada |
| Vet One | 200-055 | xilazina anestésica injetável | |
| Lloyd Laboratories | 139-236 | anestésicas injetáveis | |
| (10,3 e 1 cc) | Agulhas Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| (20G1,23G1 e 26G1/2) | Becton Câmara | 305178, 305193, 305111 | |
| VetEquip | 941443 | ||
| circuitos respiratórios de nariz de 1 litro | VetEquip | RC2 | Controlador de Circuito de Roedores 2 |
| tanque de oxigênio | Airgas | UN 1072 | 100% almofada de |
| aquecimento | CWE Inc. | controlador de temperatura | TC-1000 |
| CWE Inc. | 10-09012 | equilíbrio de mouse | |
| (para roedores) | Ohaus | CS 2000-tesoura | |
| Ferramentas Fine Science | 15000-00 | Tesoura de mola Vannas lâmina reta de 3mm (vasos de corte) | |
| ferramentas cirúrgicas-fórceps | Ferramentas Fine Science | 11151-10 | Pinça extra fina Graefe (isolando vasos de camundongo) |
| ferramentas cirúrgicas-hemostáticos | Ferramentas Fine Science | 13009-12 | Hemostáticos Halstead-mosquito (dissecar sem corte, segurar tecido) |
| ferramentas cirúrgicas -drivers de sutura | Ferramentas Fine Science | 12502-12 | Drivers de sutura Olsen-Hegar (sutura) |
| ferramentas cirúrgicas-fórceps | Fine Ferramentas científicas | 11627-12 | Pinça jacaré Adson-Brown (preensão de tecido, sutura, rato) |
| ferramentas cirúrgicas-tesoura | Ferramentas de ciências finas | 14110-15 | Tesoura de corte duro Mayo 15 cm (cirurgia, dissecação, ossos, rato) |
| ferramentas cirúrgicas-fórceps | Ferramentas de ciências finas | 18025-10 | pinça de amarração de sutura (usada para cateterismo Millar) |
| ferramentas cirúrgicas-tesoura | Ferramentas de ciências finas | 14078-10 | Lexer Baby tesoura reta (cirurgia, mouse) |
| ferramentas cirúrgicas-fórceps | Ferramentas Fine Science | 11254-20 | Dumont # 5 pinça de ponta fina (vasos de rato, dissecação) |
| ferramentas cirúrgicas-tesoura | Ferramentas Fine Science | 14082-09 | Tesoura de dissecção 12 mm (cirurgia, rato rato) |
| ferramentas cirúrgicas-fórceps | Ferramentas Fine Science | 11051-10 | 10 cm Graefe fórceps (preensão de tecido, rato rato) |
| ferramentas cirúrgicas-fórceps | Ferramentas Fine Science | 11251-35 | Dumont 5/45 fórceps (introdutor para vasos) |
| ferramentas cirúrgicas-afastadores | Ferramentas Fine Science | 17012-11 | Afastadores Weitlaner 2/3 dente (rato cirúrgico) |
| ferramentas cirúrgicas-fórceps | Ferramentas Fine Science | 11294-00 | Dumont #4 fórceps (isolamento de vasos ratos, camundongos) |
| ferramentas cirúrgicas-fórceps | Fine Ferramentas científicas | 11297-00 | Fórceps Dumont # 7 (preensão de tecido, dissecação) |
| ferramentas cirúrgicas-tesoura | Ferramentas de ciências finas | 14058-11 | tesoura de íris de corte resistente (dissecção de camundongo, ossos) |
| ferramentas cirúrgicas - fórceps | Ferramentas de ciências finas | 11009-13 | fórceps Semken serrilhado e curvo (preensão de tecido, rato de camundongo) |
| ferramentas cirúrgicas - hemostáticos | Ferramentas de ciências finas | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| ferramentas cirúrgicas-fórceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrilhado fórceps (agarramento de tecido) |
| clippers | Oster | A5 | |
| fita | Fisherbrand | 159015G | |
| pomada de lágrima artificial | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaína | Hospira | 0409-4277-01 | |
| Cateteres de polivinil | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substância P | Bachem | H-1890 | |
| heparina | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| solução salina | Hospira | 0409-7138-09 | 0,9% cloreto de sódio |
| fenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| Fisher Scientific | BP327-1 | ||
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes para borrar | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamida | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalança | Denver Instrument | APX-60 | |
| tubos de microfífuga | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| placa de poliestireno de 96 poços | Becton Dickenson | placa de | |
| absorbância leitor | BioTek | Synergy 2 | |
| géis de poliacrilamida | Bio-Rad | 3450014 | |
| padrão de peso molecular de proteína | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran suportado nitrocelulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| caixa de gel | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| cloreto de sódio | Fisher Anticorpo | Scientific S271-1 | |
| R & D Systems | AF1182 | ||
| doxiciclina chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB / NJ camundongos do tipo selvagem | Jackson | 001800 | |
| anticorpo secundário (cabra anti-coelho) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solução-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| filme | Pierce | 34091 |
Referências
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