Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Resumo

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Resumo

As ilhotas pancreáticas, também chamadas de Ilhéus de Langerhans, são um aglomerado de células endócrinas que produz hormônios para a regulação da glicose e outras funções biológicas importantes. As ilhotas consistem principalmente em cinco tipos de células secreting-hormonais: células α secretam glucagon, células β secretam insulina, células δ secretam somatostatina, ε células secretam grelina, e células PP secretam polipeptídeo pancreático. 60 a 80% das células nas ilhotas são células β, que são a população celular mais importante para estudar a secreção de insulina. As ilhotas pancreáticas são um sistema de modelo crucial para estudar a secreção de insulina ex vivo. Adquirir ilhotas de alta qualidade é de grande importância para a pesquisa de diabetes. A maioria dos procedimentos de isolamento de Islet requer tecnicamente difícil de acessar o local de injeção de colagenase, procedimentos de digestão duras e complexas, e etapas de purificação de gradiente de densidade múltipla. Este papel caracteriza um método simples do isolamento do Islet do rato do rendimento elevado com descrições detalhadas e manifestações realísticas, mostrando as seguintes etapas específicas: 1) injeção do colagenase P no ampulla de Vater, uma área pequena que se juntar ao duto pancreatic e o ducto biliar comum, 2) digestão enzimática e separação mecânica do pâncreas exócrino, e 3) uma única etapa de purificação de gradiente. As vantagens deste método são a injeção da enzima digestiva usando a ampola mais acessível de Vater, digestão mais completa usando a combinação de abordagens enzimáticas e mecânicas, e um passo simples de purificação de gradiente único. Este protocolo produz aproximadamente 250 — 350 ilhotas por o rato; e ilhotas são adequados para vários estudos ex vivo. Possíveis advertências deste procedimento são ilhotas potencialmente danificadas devido à digestão enzimática e/ou incubação prolongada de gradiente, todas as quais podem ser largamente evitadas pela justificação cuidadosa do anúncio do tempo de incubação.

Introdução

Há dois métodos comuns na literatura para o isolamento da ilíte pancreática. Um exige excisão o pâncreas e o dicing em partes pequenas usando tesouras cirúrgicas, e então digerindo o em uma solução^1,2,3do colagenase^. Outro método mais preciso é usar a rede de dutos presentes no pâncreas para introduzir a enzima digestiva. Os seguintes locais foram usados para a injeção digestiva da enzima: a junção da bilis e do duto cístico, a vesícula biliar no colagogo comum, ou o colagogo comum próprio^1,4,5. Sabe-se que as ilhotas não são distribuídas uniformemente no pâncreas; a região esplênica contém a maioria das ilhotas⁶. Enquanto o segundo método usando rotas anatômicas para entregar enzimas digestivas permite uma perfusão mais completa do pâncreas, incluindo a região esplênica, este procedimento muitas vezes requer o aperto ou sutura da ampola de Vater que é tecnicamente Desafiador. Em termos de purificação de ilhós, gradientes de densidade múltipla, bem como filtros celulares e retração magnética têm sido utilizados para purificar as ilhotas^3,7. A utilização desses gradientes pode ser demorada e os gradientes de Ficoll podem resultar em dano tóxico das ilhotas⁸.

O protocolo atual é construído sobre o método descrito por Li et al.⁷, com modificações adicionais adicionadas com base na experiência de nós mesmos e de outros^1,4. As etapas mais críticas do nosso protocolo são o aperto do ducto biliar comum perto da extremidade do fígado, injetando colagenase P através da ampola de Vater para digerir o tecido exócrino e, em seguida, usando um banho de água agitando para agilizar a digestão mecanicamente^{1, 4,7}. Subseqüentemente, uma solução do "batente" é aplicada para inibir uma digestão mais adicional das ilhotas; HBSS é utilizado para lavar a solução remanescente de colagenase P e STOP. Quando o método de Ficoll foi usado para purificar as ilhotas humanas, o rendimento foi relatado para ser duas vezes as ilhotas com maior capacidade funcional (por exemplo, secreção de insulina) em comparação com o uso de gradientes de Percoll⁹. No entanto, estudos têm questionado o uso do gradiente Ficoll devido ao seu efeito tóxico nas ilhotas^1,10. Relatou-se que o gradiente histopaque fornece a cinética óptima da purificação para a isolação da ilhotas do rato, que produz o bom rendimento de ilhotas da alta qualidade com etapas mais simples e um mais baixo custo¹. Em nosso protocolo, o Histopaque-1077 é usado para purificar ilhotas de outros tecidos residuais^8,11. As ilhotas colhidas podem ser cultivadas em meios completos de RPMI-1640, ou utilizadas diretamente na quantificação de RNA/proteína.

Nosso protocolo, usando uma combinação de digestão do colagenase P e uma única etapa da purificação do inclinação, é mais simples do que outros protocolos publicados. Nosso método não exige procedimentos cirúrgicos exigentes e tem apenas alguns passos simples. Mais importante, este protocolo consistentemente produz um bom rendimento de ilhotas funcionais de alta qualidade (250-350/mouse) como nós relatado¹².

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais (ACUC) da Universidade do Texas A & M. A necessidade de ferramentas cirúrgicas é mostrada na Figura 1 e o diagrama esquemático do procedimento é mostrado na Figura 2.

1. soluções

1. Prepare a solução de sal equilibrado de Hank (HBSS) adicionando 100 mL de 10X HBSS (do estoque) a 900 mL da água destilada para fazer 1 L HBSS (1X).
2. Prepare a solução STOP (deve ser feita fresca e deve ser usada dentro de 1 h) adicionando 50 mL de soro bovino fetal 100X (FBS) a 450 mL de gelo frio 1X HBSS; Isto faz 500 mL de solução STOP. Mantenha a solução STOP a 4 ° c.
3. Prepare a solução de colagenase p (deve ser feita fresca dentro de 1 h de ser usado) adicionando 1 mg/ml de colagenase p ao gelo frio 1x HBSS; Use 6 mL/mouse.
   1. Adicionar 0, 5% (w/v) albumina sérica bovina (BSA) à solução de colagenase P (isto fornece nutrientes para as ilhotas isoladas). Por exemplo, use 3 mg de BSA em 6 ml de solução de colagenase P. Continue no gelo.
   2. Calcule e prepare a quantidade de colagenase P necessária para todos os camundongos em 1 50 mL de tubo.
4. Prepare o meio completo de RPMI 1640 adicionando 10% FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, suplemento de células INS-1 (10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio e 0, 5 mM 2-Mercaptoetanol) para 500 mL RPMI 1640 mídia contendo 5,5 mM de glicose para a cultura e incubação durante a noite.

2. preparação

1. Encha 3 50 tubos de mL de solução inibidora de 25 mL de RNase, 70% de etanol ou H₂O destilado. Estas soluções serão utilizadas para a limpeza de ferramentas cirúrgicas antes e durante o procedimento.
2. Mergulhe as pontas das ferramentas na solução de inibição de RNase por 30 minutos antes de começar o protocolo; Isso elimina qualquer potencial RNase nas ferramentas.
3. Pré-corte almofadas absorventes para 6 em x 6 em tamanho para uso durante a cirurgia.
4. Prepare a solução 1X HBSS com antecedência e armazene a 4 ° c. Prepare a solução STOP antes da cirurgia. Conservar a 4 ° c.
5. Prepare a solução de colagenase P imediatamente antes da cirurgia e armazene no gelo.
   Nota: este deve ser usado dentro de 2 h de preparação.
6. Rótulo 50 mL tubos para digestão e purificação; Prepare 2 tubos para cada rato, um para a digestão e o outro para a purificação do Islet. Assegure-se de que a identificação animal esteja em ambos os tubos.
7. Adicionar 3 ml de solução de colagenase P no primeiro tubo de 50 ml. Os restantes 3 mL de colagenase P serão injetados.
8. Desenhe os restantes 3 mL de solução de colagenases numa seringa de 3 mL montada com 30 G 1/2 na agulha. Coloque a seringa no gelo.

3. procedimento

1. Remova todas as ferramentas da solução de inibição de RNase, a seguir mergulha-as primeiramente no tubo com o etanol 70%, então no tubo que contem H₂o destilado, a seguir ar-seque na toalha de papel limpa.
2. Coloque o rato numa câmara contendo 0,5 mL de isoflurano até que o rato esteja profundamente anestesiado.
3. Retire o mouse da câmara e verificar o estado de anestesia por beliscar uma almofada de pé com fórceps. A anestesia profunda baseia-se na observação de que a respiração se torna progressivamente lenta e o rato não é reactivo a beliscar o pé. Depois de confirmar que o mouse está profundamente anestesiado, eutanizar o mouse com luxação cervical e, em seguida, coloque o mouse sobre a almofada absorvente.
   1. Coloc o rato anestesiados em seu estômago, aplicando a pressão à garganta e deslocando a coluna espinal do cérebro puxando a cauda.
4. Tape os membros do mouse em posição supina para a almofada absorvente, pulverizar o corpo com etanol 70%, e limpe o excesso de etanol em excesso.
5. Use fórceps de vidro da tampa e tesouras cirúrgicas curvadas para fazer incisões. Primeiramente faça uma incisão horizontal na pele da área abdominal (~ 3 cm), puxe a pele largamente aberta para expor a parede abdominal. Em seguida, faça uma incisão vertical (~ 3 – 4cm) no peritônio abdominal para expor totalmente o pâncreas na cavidade abdominal (Figura 3).
6. Empurre os lóbulos do fígado superiormente para expor o ducto biliar, ele aparecerá como um tubo rosa pálido (Figura 3).
7. Mova cuidadosamente os intestinos da região lombar/ilíaca direita da cavidade abdominal para a direita, expondo o ducto biliar e a artéria hepática (Figura 3).
8. Aperte cuidadosamente o ducto biliar comum usando os micro serrefes de Schwartz (Figura 1) o mais próximo possível do fígado.
9. Identifique a ampola de Vater, que está localizada na papila duodenal, formada pela União do ducto pancreático e do ducto biliar comum. O ampulla de Vater aparece inchado quando visto um microscópio de dissecção que é o ponto de entrada para o ducto biliar comum (Figura 4).
   Nota: ajustar a intensidade/ângulo de luz do microscópio de dissecção pode torná-lo mais fácil de localizar.
10. Insira a seringa com 3 mL da solução de colagenase P na ampola de Vater. Empurre a agulha para dentro do duto por cerca de 1/4 do comprimento do ducto biliar comum (ampulla conduz ao duto) como mostrado na Figura 5.
11. Uma vez que a agulha está na ampola, assegure-se de que a orientação da agulha seja tal que é paralela com o duto.
12. Estabilize a agulha apertando com o micro fórceps de Adson para impedi-lo de perfurar o duto (Figura 5).
13. Injete lentamente e firmemente 3 mL da solução de colagenase P da seringa para o ducto biliar comum (o suficiente para sentir resistência), como mostrado na Figura 6. O objetivo é criar pressão de refluxo para forçar a colagenase a entrar no duto pancreático. A injeção é considerada bem sucedida se a cabeça, a garganta, o corpo e a região da cauda do pâncreas forem inflados inteiramente.
    Nota: a produção de Islet será baixa se o pâncreas não estiver totalmente inflado, ou se a área esplênica não estiver totalmente inflada. A área esplênica contém o maior número de ilhotas⁶. A inflação pode ser confirmada pelo aparecimento de espaços abertos entre o tecido pancreático que são preenchidos com solução.
14. Dissecar cuidadosamente o pâncreas inflado e colocá-lo em um tubo de digestão de 50 mL contendo 3 mL de solução de colagenase P gelada.
    1. Retire o pâncreas usando 2 fórceps (curvo e micro Adson; Veja a Figura 1): (partindo do baço, puxe o pâncreas para longe do baço e continue removendo do estômago e ao longo do duodeno.
       Nota: não são necessárias incisões.
    2. Pique o pâncreas para 3 – 5 s no tubo de digestão com 3 mL de solução de colagenase de gelo fria usando uma tesoura cirúrgica fina (Figura 7a).
15. Fixe o tubo a uma cremalheira no banho de água do ° c 37 e agitar em 100 – 120 rpm por aproximadamente 12 – 13 minutos.
16. Após a incubação, agitar suavemente os tubos à mão para interromper o tecido até que a solução de digestão da colagenase P se torne homogênea (Figura 7B). A homogeneidade é confirmada por uma aparência semelhante à areia de partículas finas de pâncreas. Cerca de 30 s de aperto de mão suave é geralmente suficiente. Segure o tubo até a luz para examinar se o tecido está bem homogeneizado; agitar para outro ~ 15 s, se necessário.
17. Depois de digerido, coloque imediatamente os tubos no gelo e adicione 40 mL de solução STOP gelada para encerrar a digestão enzimática.
    Nota: neste ponto os tubos da digestão podem ser deixados no gelo até 2 h, se trabalhando em ratos múltiplos.
18. Centrifugue o tubo em um centrifugador da balanç-cubeta em 300 x g para 30 s (a temperatura do centrifugador é flexível).
    Nota: Use um centrifugador do balanç-cubeta de modo que o pellet do tecido esteja dado forma na parte inferior do tubo 50 mL e não na parede do tubo; Isto é crítico para o melhor rendimento da Illet.
19. Decantar e repetir a centrifugação com a solução STOP mais 2 vezes, decantando a solução após cada giro. Utilize 20 mL de solução STOP para cada lavagem subsequente.
    1. Antes de cada centrifugação, interrompa o pellet agitando suavemente a pelota do tecido no tubo de 50 mL em 20 mL de solução STOP.
20. Re-suspender a pelota do tecido com 40 mL de gelo frio HBSS e centrifugar a 300 x g por 30 s.
21. Decantar e repetir a centrifugação usando um centrifugador da balanç-cubeta com solução de HBSS mais duas vezes, decantação a solução após cada rotação. Use 20 mL de HBSS para cada lavagem.
    1. Antes de cada centrifugação, interrompa o pellet, para o separar da parte inferior do tubo, agitando suavemente o tubo contendo 20 mL de solução HBSS.
22. Após a última centrifugação, retire todos os HBSS.
23. Em seguida, adicione 5 mL de gradiente de densidade de temperatura ambiente ao tubo de 50 mL contendo o pellet. Vortex brevemente em baixa velocidade até homogeneizado.
24. Adicione mais 5 mL do gradiente de densidade da temperatura ambiente ao tubo de 50 mL. Não vórtice/misturar.
    Nota: é crítico para permanecer estável e ainda assim para permitir melhor gradiente de forma sem interrupção.
25. Pipete 10 mL de temperatura ambiente HBSS tampão no tubo (contendo o gradiente de densidade), drop-by-gota suavemente e lentamente para permitir que um gradiente de forma. Use uma pistola de pipeta com uma pipeta de 10 mL para adicionar o HBSS Dropwise.
26. Usando um centrifugador do balanç-cubeta, os tubos da rotação em 1700 x g por 15 minutos. Certifique-se de mudar a velocidade de aceleração/desaceleração para a configuração mais baixa para manter o gradiente (Figura 7C).
27. Após a rotação, Retire cuidadosamente os tubos sem perturbar o gradiente. Usando uma pistola de pipeta pré-molhada com HBSS frio (pipeta HBSS para cima e para baixo), pipetar a camada de ilhotas (5 – 10 mL) formada entre o gradiente de densidade e HBSS no novo tubo de coleta de ilhotas de 50 mL.
    Nota: é útil molhar a pipeta com HBSS frio antes de Pipetar as ilhotas para evitar que as ilhotas aderindo às paredes internas da pipeta.
    1. No caso de a separação estar incompleta, as ilhotas seriam visíveis na camada de gradiente de densidade, pipetando para fora todo o 10 mL do gradiente de densidade (camada inferior) junto com a camada de ilhós formada na interface (apenas para deixar cerca de 8 – 10 mL da camada superior de HBSS atrás).
       Nota: a coleta da camada de Illet e da camada de gradiente de densidade (camada inferior) pode resultar na coleta de detritos que podem alondar o tempo de picking da Ilina, mas nenhuma outra ação será alterada. A coleta de ambas as camadas não é necessária quando a camada de Illet é bem formada.
28. Adicionar 20 mL de gelo frio HBSS para o novo 50 mL tubo contendo ilhotas, em seguida, centrifugar a 350 x g por 3 min em um balanço-balde centrífuga.
29. Após a rotação, cuidadosamente pipeta (nãodecantar) para fora do sobrenadante (deixar ~ 3 ml na parte inferior) sem perturbar o pellet contendo as ilhotas na parte inferior. Descarte o sobrenadante.
30. Repita a lavagem e centrifugação pelo menos 3 vezes. Adicione 20 mL de HBSS cada vez, e seja certo suspender a pelota antes de cada rotação.
31. Aqueça a garrafa de mídia completa RPMI-1640 em um banho de água a 37 ° c antes de usar. Após a última centrifugação, retire todos os HBSS e adicione 4 mL de meios de comunicação RPMI-1640 completos previamente preparados (contendo FBS, suplemento de células INS-1 e penicilina/estreptomicina) ao pellet.
32. Desalojar a pelota delicadamente girando o tubo e despeje imediatamente a mídia RPMI-1640 em um prato de Petri de 100 mm. Adicione outro 5 mL de mídia RPMI-1640 ao tubo e gire-o suavemente para lavar as ilhotas remanescentes, então também despeje a mídia na mesma placa de Petri.
    1. um microscópio de dissecção, escolha ilhotas saudáveis da placa de Petri usando uma pipeta de 20 μL, e põr as em um prato de Petri novo que contem 10 mL de meios completos de RPMI 1640. Quando visto um microscópio de dissecção, as ilhotas devem aparecer cor esférica/oblonga e dourado-marrom com uma superfície lisa comparada ao tecido exócrina relativamente transparente, wispy.
       Nota: a ampliação do microscópio da dissecção é ajustada geralmente em 12.5-16x. O rendimento da Islet variará dependendo de vários fatores, incluindo tensão, idade e sexo do mouse. Este protocolo geralmente produz 250 – 350 ilhotas saudáveis de idade do mouse C57BL/6J saudável 4 – 10 meses de idade.
33. Incubar as ilhotas em uma incubadora estéril em 37 ° c com infusão de 5% CO₂ e 95% de ar humidificado durante a noite para experimentos no dia seguinte, ou congelar as ilhotas para a análise desejada em um momento posterior.
    1. Uma vez que as ilhotas são congeladas, elas não podem ser usadas para ensaios de secreção, apenas para quantificação de RNA ou proteína. Para recolher as células para congelar, coloque-as no tampão HBSS, colete todas as ilhotas em 200 – 500 μL de tampão, transfira para 1,5 mL de tubo, centrifugador 350 x g durante 1 – 2 min, retire o sobrenadante não deixando mais de 30 – 40 μL de solução, coloque em-20 ° c para armazenamento de curto prazo ( vários dias) ou-80 ° c para o armazenamento a longo prazo.

Resultados

A conclusão apropriada deste procedimento exige alguma compreensão da anatomia do rato na cavidade abdominal. Isto permite a identificação apropriada do ampulla de Vater e do aperto do colagogo comum. Todo o procedimento normalmente leva 1 – 2 h. É mais eficiente isolar ilhotas de 4 a 6 camundongos ao mesmo tempo, para que várias amostras possam ser centrifugadas juntas. O tempo para a Islet-colheita varia, dependendo do número de ilhotas e da eficiência da digestão; pode demorar cerca de uma hora para escolher 250-350 i...

Discussão

Este protocolo inclui perfusão de colagenases e digestão, seguida de purificação de ilhotas. As etapas mais críticas deste protocolo são a injeção efetiva e a perfusão completa do pâncreas^1,4,7. O método de parto deste protocolo permite que a enzima atravesse as vias anatômicas para melhor digerir o tecido exócrino que circunda as ilhotas¹. Além disso, esta técnica é bem adequada para a digestão completa ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 3 mL	BD	309657	Hoding colagenase P
Pinça de lamínula	VWR	82027-396	Segurar a pele do rato para auxiliar no procedimento de incisão
Pinça curva	Sigma-Aldrich	Z168696	Segurar os tecidos durante a remoção do pâncreas
Isoflurano	Piramal	B13B16A	Para anestesiar ratinhos antes da cirurgia
Placas de Petri de 100 mm	VWR	30-2041	Utilizado para cultura de ilhéus
30 G. ½ agulha de polegada	BD	305106	Para penetração de ampola de vater para fornecer colagenase P - este calibre é utilizado porque se adapta bem à maioria dos tubos de 50 ml de CBD
	VWR	89039-658	Segurando tecido pancreático digerido, colagenase P e ilhotas purificadas
Almofadas absorventes com barreira de humidade à prova de água	VWR	82020-845	Para absorver o sangue dos processos sirúrgicos
Centrífuga 5810R com balde oscilante e capacidade de desaceleração	Eppendorf	5811FJ478114	Uso para peletização de tecidos, o pellet é formado na parte inferior do tubo cônico - é necessária uma centrífuga de balde oscilante. Além disso, o recurso de desaceleração é importante para formar as camadas de gradiente.
Collagenase P- 1g	Roche Diagnostics	11249002001	Para digestão do pâncreas exócrino
Tesoura cirúrgica curva	Fisher-Scientific	13-804-21	Para cortar abdômen de camundongo aberto
Microscópio de dissecção	Olympus	SZX16	Usado para identificação de estruturas anatômicas chave para entregar com precisão colagenase no pâncreas
Solução salina balanceada de Hank 10x	Corning	20-023-CV	Células de lavagem
Histopaque-1077	Sigma	RNBF5100	Para formação de gradiente
Fonte de luz	Leeds	LR92240	Melhorando a visibilidade do microscópio
RNaseZap	Fisher-Scientific	AM9780	Para remover RNase
RPMI-1640 Mídia sem L-Glutamina	Corning	15-040-CV	Ilhotas de Cultura
Schwartz micro serrefines (grampo microvascular)	Fine Science Tools	18052-01	Fixação do ducto biliar comum e da artéria hepática
Banho-maria agitado	Boekel/Grant	8R0534008	Importante para a digestão mecânica do tecido exócrino
Tesoura cirúrgica pequena	VWR	82027-578	Tecido de corte que se prendeu ao pâncreas