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Examinando Monosynaptic conexões em drosófila usando os canais de sódio tetrodotoxina resistente

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DOI:

10.3791/57052

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14 de fevereiro de 2018

 , 
1Department of Biology, University of Maryland

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um método para testar as monosynaptic conexões entre neurônios empregando tetrodotoxina e o canal de sódio tetrodotoxina-resistente, NaChBac.

Resumo

Aqui, uma nova técnica denominada Tetrotoxin (TTX) Engenharia resistência para sondar as sinapses (TERPS) é aplicada para testar monosynaptic conexões entre os neurônios do alvo. O método baseia-se na expressão co de um ativador de transgênico com o canal de sódio tetrodotoxina-resistente, NaChBac, em um neurônio específico pré-sináptica. Conexões com parceiros pós-sináptica putativos são determinadas por gravações de células inteiras na presença de TTX, que bloqueia a atividade elétrica de neurônios que expressam não NaChBac. Esta abordagem pode ser modificada para funcionar com qualquer ativador ou imagem latente de cálcio como um repórter de conexões. TERPS adiciona o crescente conjunto de ferramentas disponíveis para determinar a conectividade em redes. No entanto, TERPS é o único que relata também confiantemente em massa ou volume transmissão e transmissão de repercussões.

Introdução

Dos principais objetivos da neurociência é mapear as conexões entre os neurônios para entender como a informação flui através de circuitos. Inúmeros recursos e abordagens tornaram-se disponíveis para testar a conectividade funcional entre os neurônios em uma variedade de sistemas de modelo1,2. Para gerar os diagramas de fiação mais precisos usando eletrofisiologia, é importante resolver se observadas as conexões entre duas células são diretos e monosynaptic versus indireta e polysynaptic. Um padrão de ouro para fazer esta distinção nos neurônios de mamíferos é medir a latência entre action potentials único nas células pré-sináptica e o aparecimento de correntes pós-sináptico excitatórios (EPSCs) no segundo neurônio. Monosynaptic conexões devem ter latências curtas de alguns milissegundos e baixa variabilidade3. Essa abordagem pode ser complicada em neurônios invertebrados porque sinapses podem ocorrer em suas dendrites, longe de ser o local de gravação somática, causando atrasos na deteção devido tempo electrotonic distâncias entre conductances pós-sinápticos e a gravação eletrodo. Esses atrasos podem introduzir ambiguidade poli-contra contribuições monosynaptic. Além disso, pequenos eventos sinápticos podem deteriorar antes de chegar ao local de gravações somática e dirigindo mais forte atividade pré-sináptica, é prováveis que recrutar polysynaptic eventos.

Várias técnicas têm sido desenvolvidas para testar conexões monosynaptic em invertebrados. Uma abordagem utiliza as soluções de alta cátion divalente (Hi-Di) contendo excesso Mg ++ e Ca ++. Esta solução bloqueia conexões polysynaptic por redução de lançamento de probabilidade e limiar de ação potencial crescente para favorecer a deteção de entrada monosynaptic4,5. Determinar a proporção precisa de Mg Ca ++ ++ necessário, no entanto, não é trivial e contribuições polysynaptic podem persistir por estimulação mesmo modesto6. Uma abordagem alternativa, chamada reconstituição GFP entre parceiros sináptica (alcance) aproveita a proximidade entre as membranas pré e pós-sinápticas encontrado em sinapses para inferir uma conexão monosynaptic 7. Aqui, um componente da proteína verde fluorescente (GFP) é expresso em um neurônio, e o fragmento complementar da molécula é expresso em um parceiro pós-sináptica putativo. A presença de fluorescência indica que os dois neurônios estão em proximidade suficiente para permitir a reconstituição da molécula GFP e implica a existência de uma sinapse. ALCANCE pode relatar sinapses falsamente, no entanto, se duas células estreitamente tem Aposto membranas, como em um nervo ou Fascículo. Variantes de alcance eliminam tais falsos positivos por amarrar o fragmento pré-sináptica de GFP diretamente para synaptobrevin da, permitindo assim a reconstituição somente às sinapses ativo8. Enquanto compreensão e suas variantes têm sido fundamentais para determinar a conectividade funcional na drosófila CNS, algumas conexões podem não ser feitas visíveis pelo alcance se as distâncias entre parceiros pré e pós-sinápticas é relativamente grande. Isto é particularmente pertinente na avaliação da transmissão de volume associado a neuromodulação9 ou de inibição GABAérgica10.

Aqui, uma técnica complementar e romance é demonstrada para testar conexões diretas de monosynaptic no CNS da drosófila . Esse método, chamado tetrodotoxina engenharia resistência para sondar as sinapses (TERPS), trabalha pela expressão co da tetrodotoxina (TTX)-canal de sódio resistente, NaChBac e um ativador de optogenetic em uma célula pré-sináptica durante a gravação de putativo parceiros pós-sináptica9. Na presença de TTX, toda a atividade mediada por potencial de ação é suprimida em células diferentes dos expressando NaChBac. O canal NaChBac restaura seletivamente excitabilidade na célula pré-sináptica alvo, permitindo a transmissão sináptica luz-evocada. Este método permite forte ativação dos neurônios pré-sináptica, tal que as conexões podem ser resolvidas pós-sinapticamente pela gravação somática, reduzindo a probabilidade de recrutamento de circuitos polysynaptic. Importante, esta técnica permite o estudo da transmissão de volume e revela a propagação do transmissor liberado de um único neurônio ao longo de um circuito. Além disso, TERPS pode revelar a natureza química da conexão através de farmacologia convencional. TERPS é adequado para uso em qualquer modelo de sistema que permite a expressão transgênica da diferenciação de TTX canais de sódio.

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Protocolo

1. prepare a moscas e GAL4 identificar linhas de promotor

  1. Selecione uma linha de promotor GAL4 e cruzá-la com moscas carregando tanto o transgene UAS-NaChBac e um optogenetic transgene para ativação.
    Nota: UAS-CsChrimson11 é selecionado devido a sua alta condutância e a facilidade com a qual ele ativa de potenciais de ação mediada por NaChBac. Tanto UAS-NaChBac e CsChrimson-UAS estão disponíveis no repositório de estoques de Bloomington.
  2. Prepare-se como uma solução em etanol (35mm) all-trans retinal e armazenar a solução em congelador a-20 ° C.
  3. Mix 28 µ l desta unidade populacional em cerca de 5 mL de batata rehidratada flake comida e adicione esta mistura na parte superior de um frasco de meio de Drosophila convencional.
  4. Levante o adultas moscas expressando csChrimson em alimentos contendo 0,2 mM todo-trans-retinal para 1 a 3 dias,11.

2. prepare o estoque TTX

  1. Crie uma solução stock de 1mm TTX em água destilada ou desionizada. Guarde esta solução em um frigorífico de laboratório durante vários meses. Verificar as instituições políticas a respeito do armazenamento de TTX como muitas instituições classificam TTX como uma substância perigosa ou controlada.

3. prepare moscas para eletrofisiologia

  1. Colete 1 – 3 dias velho adulto voa que são gerados na comida com all-trans-retinal.
    Nota: Consulte Murthy e Turner em 2013 para uma descrição detalhada do patch aperto Drosophila neurônios12,13.
  2. Coloque as moscas em um frasco de cintilação. Coloque o frasco em gelo por 1 min imobilizar as moscas.
  3. Use pinça grossa para inserir uma mosca em uma câmara de gravação sob medida. A câmara consiste de um 3 ½" círculo cortado a laser de acrílico 1/16". Corte um buraco ¾" é para o centro onde uma folha personalizada é fixada com cola epoxy de 2 partes. A folha contém um triangular em forma de esperança que a mosca é inserida.
  4. Aplica cera ou UV curável epóxi em torno do animal para fixá-lo firmemente dentro da câmara de gravação.
  5. Ilumine a preparação com um pescoço de cisne de fibra ótica para visualização sob um estereomicroscópio. Defina as fibras de pescoço de cisne para iluminação oblíqua, ajustando-os para que eles iluminam a voar directamente do lado.
  6. Ajuste o nível de luz a mais baixa possível que ainda permite a visualização clara de uma mosca. Esta intensidade de luz irá variar através de experiências individuais.
    Nota: Este protocolo pode ser adaptado usando um em situ cérebro explant método14.
  7. Recupere a solução salina de gravação externa. O soro contém em mM: NaCl 103, 3 KCl, 5 N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoethane-sulfônico, 8 trealose, glicose 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1.5 CaCl2e 4 de MgCl2 (ajustada para mΩ 270-275). A solução salina é alternassem com 95% O25% CO2 (carbogênio) e tem um pH ajustado a 7.315.
  8. Coloque 4 a 6 gotas de solução salina de gravação extracelular sobre a preparação de voar. Neste ponto, aumente o nível de luz para o microscópio de dissecação para melhor visibilidade.
  9. Afie um fio de tungstênio usando eletrólise. Para fazer o fio, preparar uma solução saturada de KNO3 e aplique aproximadamente 20 V de AC corrente enquanto mergulhando a ponta do fio na solução de 20 vezes para 100 ms cada, até que a ponta é afiada. Use o fio de tungstênio afiada para remover a cutícula na cabeça de mosca e, portanto, expondo o cérebro.
  10. Ainda mais expor o cérebro removendo a traqueia e os corpos de gordura que o rodeiam. Se acessando os lóbulos da antena, use um fio de tungstênio tortos ou ferramenta semelhante aconchegar-se suavemente antenas debaixo da folha câmara para aumentar a visibilidade de gravação. Use o fórceps afiado a rasgar o invólucro glia cobrindo a área de interesse, onde as gravações serão feitas suavemente.
  11. Transferi a câmara de gravação para o equipamento de eletrofisiologia. Imediatamente iniciar perfusão com solução salina de gravação externa borbulhava com carbogênio para preservar o cérebro. O reservatório de solução salina é colocado acima do palco do microscópio e gravidade-alimentado à preparação. Use uma linha de vácuo e um frasco de Erlenmeyer de 2L para recolher a resíduos salina.

4. obter gravação de células inteiras

  1. Puxe um extrator comercial pipeta pipetas de remendo. Consulte o manual de configurações alcançar uma pipeta apropriada com uma resistência de ponta perto de 7 mΩ.
  2. Adicione 4 µ l da solução de gravação interna para uma pipeta de remendo. O soro fisiológico interno consiste de aspartato de potássio 140, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA e 1 KCl em mM.
  3. Configure o amplificador de braçadeira do remendo para gravação de células inteiras. Zero offsets do amplificador e definir o amplificador para fornecer pulsos de teste. Aqui, um amplificador de braçadeira de Patch de sistemas AM 2.400 é usado.
  4. Aplicar pressão positiva através da pipeta e abordagem da célula. Use um micromanipulador para direcionar a pipeta e entre em contato com a célula. Liberar a pressão positiva. Conjunto o potencial de exploração da membrana de -60 mV. A pipeta deve formar um gigaohm selo com a membrana da célula, como evidenciado por um sub-picoamp baixo segurando atual.
    Nota: Se usar GFP guiado a célula alvo, tente minimizar o uso de luz epifluorescente para impedir ativação ChR2 e potencial depressão sináptica. Também aguarde alguns minutos antes de aplicar o passo 5.
  5. Definir o amplificador para entregar o teste pulsos de -50 mV a -60 mV. Essa configuração é padrão nos amplificadores da remendo-braçadeira. Pulsos de teste irão revelar um grande transiente capacitiva que representa a corrente necessária para carregar a pipeta de remendo. Remova capacitiva transientes ajustando os botões de compensação de capacidade na AM 2400 ou amplificador semelhante.
  6. Aplica breves pulsos de pressão negativa para a ruptura da membrana celular e obter configuração de células inteiras.
    Nota: Uma configuração de celular é observada quando há um grande aumento da capacitiva transientes mostrando a capacitância do neurônio. Um pequeno aumento na exploração atual (linha de base) provavelmente será também observado. Definir o amplificador para o atual modo de grampo e ajustar o potencial da célula de -50 a -60 mV.

5. testar a conectividade sináptica

  1. Configure o sistema de aquisição (DAQ) dados para acionar um driver de LED para gerar pulsos de luz. Aqui, um sistema DAQ de instrumentos nacionais é usado com Matlab para entregar um sinal analógico para um driver de LED. A intensidade do LED é ajustada através do sinal analógico para o motorista. O LED é um comprimento de onda 620-630 nm LED.
  2. Posicione o alta potência LED vermelho diretamente debaixo de preparação. Ajuste a intensidade da luz para que 0.238 mW/mm2 atinge a mosca.
  3. Ative os neurônios pré-sináptica durante a gravação da célula pós-sináptica de interesse. Atingir a célula ativação optogenetically, pharmacogentically, ou através da estimulação do nervo. Aqui, breves pulsos de luz vermelha e csChrimson são aplicados.
    Nota: Conexões sinápticas podem ser monitoradas em braçadeira atual como EPSPs ou grampo de tensão como EPSCs. Uma conexão sináptica deve ser visível antes de aplicar a TTX em resposta a um pulso de luz de 40 ms. Se nenhuma conexão é observado, é improvável que os neurônios estão synaptically ligados ou mono - ou polysynaptically. A potencial de exploração pode ser ajustada para enfatizar conexões excitatórias ou inibitórias em conformidade.
  4. Se uma conexão é observado em solução salina normal, adicionar TTX no sistema de perfusão para obter uma concentração final de 1 µM. usar uma bomba de recirculação para capturar e reutilizar o soro fisiológico para conservar TTX. A bomba peristáltica irá desenhar a solução salina do banho e devolvê-lo para o reservatório de solução salino.
  5. Ajuste a velocidade da bomba para fornecer um forte vácuo constante que não permite esse nível salino no banho para subir e descer.
    Nota: A aplicação da TTX deve resultar na cessação da actividade no neurônio que está sendo monitorado em células inteiras de cravação. Isto confirma que suficiente TTX foi adicionado para o soro.
  6. Aplica breves pulsos de luz vermelha (40 ms para cada pulso) novamente. Neste ponto, qualquer conexão sináptica que permanece é provável monosynaptic. Adicione antagonistas farmacológicas para testar a natureza química das ligações sinápticas que permanecem em TTX, solução salina a recirculação.
    Nota: Quando a combinação de optogenetics e direcionamento fluorescente de neurônios, pode ser importante para não ativar persistentemente a população pré-sináptica dos neurônios ao tentar obter uma gravação. Isto pode conduzir à depressão sináptica e torna difícil ver conexões. Porque csChrimson tem uma faixa de excitação longo que se estende amplamente para a gama de proteína verde fluorescente, um fluoróforo vermelho pode ser usado para visualizar os neurônios e channel2rhodopsin (Ch2R) pode ser usado para excitar a populações de células. Fazer isso requer genética específica e um cubo de filtro personalizado. Para gerar moscas adequadas, fazer moscas que expressam o fluoróforo vermelho (RFP ou mCherry) sob os sistemas de expressão binário sistema LexA ou Q. Estas precisará ser cruzados com moscas expressando um promotor Gal4 e UAS-Ch2R e UAS-NaChBac genes efetores. O cubo do filtro ideal para epifluorescência terá uma escala estreita da excitação para excitar o fluoróforo vermelho, mas não excita a Ch2R... Além disso, o conjunto de filtro deve incluir um filtro de emissão de passe longo para coletar tanta luz emitida. Nós usamos um filtro personalizado definido de Chroma que incluía parte números et580/25 x e t600lpxr (do conjunto 49306), mas com um filtro de barreira/emissão de et610lp.

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Resultados

TERPS é usado para distinguir entre mono e polysynaptic contribuições em conexões sinápticas entre os neurônios. Enquanto fraca estimulação de uma célula pode ser usada para testar conexões diretas, dirigindo a maior atividade pré-sináptica frequentemente recruta polysynaptic conexões (figura 1A). TERPS funciona co, expressando o diferenciação de TTX canal de sódio NaChBac e um ativador de optogenetic e testes de conexões na presença de TTX para eliminar liga...

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Discussão

Análise TERPS elogios atuais técnicas usadas para circuito rachando, permitindo a detecção de sinapses entre os neurônios identificados. Especificamente, a abordagem revela conexões monosynaptic por silenciar amplamente os potenciais de ação com TTX enquanto restaura a excitabilidade numa população de neurônios com o canal de sódio TTX diferenciação NaChBac selecione. Liberação sináptica é provocada pela estimulação optogenetic enquanto eventos pós-sinápticos são monitorados com gravações de células inteiras. TERPS disti...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer Joshua Singer, Jonathan Schenk, bem como os revisores pensativos para comentários sobre o manuscrito. Também gostaríamos de agradecer a Ben White e Harold Zakon para discussões sobre a técnica. Jonathan Schenk forneceu os dados para a Figura 3A. Este trabalho foi financiado por um subsídio da Fundação Whitehall e um R21 NIH ao QG.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
UAS-csChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55135Usado como ativador neural
UAS-NaChBacBloomington Drosophila Stock Center9466Excitabilidade dos resotores em células em TTX
TetrodotoxinaTochris1078Pode ser necessária permissão especial para comprar TTX, pois é uma substância controlada
todos os trans-RetinalSigma-Aldrichall trans-RetinalR2500Requer co-fator para channelrhodopsin
Aço Inoxidável 321 Soldável  Folha,  0,002"  Grosso,  10"  LargoMcMaster Carr3254K7Usado para fazer porta-moscas personalizado. A folha personalizada pode ser cortada a laser a pololu.com a partir do arquivo PDF fornecido
Microscópio de DissecçãoZeissStemi 2000-CUsado para dissecação de preparação
WaxerAlmoreEectra Waxer 66000Usado durante a dissecção para fixar a mosca na folha
Cera de ParafinaJoann4917217Usado com encerador
Número 5 fórcepsFine Science Tools#5COUsado para dissecação e desmontagem
Tesoura de dissecaçãoFerramentas de ciência fina15001-08Usado para remover partes da cutícula durante a dissecação
Fio de tungstênioA-M Systems797500Use com eletrólise para fazer agulhas afiadas para dissecação
Bomba peristáltica reciculanteSimplesmente bombas (Amazon)PM200Spara recirculação
Controlador de velocidade TTX para bomba peristálticaZitrades (Amazon)N/APWM Dimming Controller Para Luzes LED ou Fita, 12 Volt 8 Amp,Controlador de Luz de Luz Ajustável DC12V 8A 96W para Led Strip Light B
Versa-Mount  Regulador de Ar Comprimido de PrecisãoMcMaster Carr1804T1Para aplicar pressão positiva durante o patching
Vidro capilariesWorld Precision InstrumentsTW150F-3Para pipetas de patch
Medidor MultiusoMcMaster Carr3846K431Medidor para regulador de pressão
Câmera de EletrofisiologiaDage MTI IR-1000Qualquer câmera que funcione na faixa de infravermelho (850 nm) funcionará. Você não quer usar iluminação vermelha, pois isso pode ativar os LEDs IR da csChrimson
Thorlabs M850F2Para iluminação oblíqua
fibra óptica para IR LEDThorlabsM89L01Acopla a
lente objetiva IR LED Olympus 40XLUMPlanFLNIsso pode ser usado na maioria dos microscipes e funciona bem para visualizar neurônios de moscas.
LED âmbarThorlabsM590L3dPara visualizar RFP e mCherry
Blue LEDThorlabsM470L3dPara visualizar GFP
Conjunto de filtros GFPChroma49011Para visualizar GFP ou estimular channel2rhodopsin
Conjunto de filtros mCherry personalizadosChroma  et580/25x e t600lpxr (do conjunto 49306), mas com uma barreira et610lp/óptica de emissãoUse apenas se desejar corrigir neurônios identificados com channel2rhodopsin
Dichroic para combinar Thorlabs de LED âmbar e azulDMLP550RUse apenas patch sob mCherry e excite channel2rhodopsin com luz azul.
LED LED vermelhoFornecidoCree XPE 620 - 630 nmUsado para acionar o driver de LED csChrimson
LEDSupply3021-D-E-1000Usado para acionar LEDs para estimulação optogenética
ManipuladorSutter InstrumentsMP-225Usado para posicionar a pipeta durante as gravações
Amplificador Patchclamp A-MSystemsModelo 2400Um amplificador equivalente é adequado
Filtro BesselWarner Instruments LPF 202AFiltro auxiliar usado para filtrar o traço de corrente para o osciloscópio durante o patching.
Sistema de Aquisição de Dados National InstrumentsNI PCIe-6321            781044-01Usado para gravar dados do amplificador para o computador Bloco de
conectores - Terminal BNC BNC-2090ANational Instruments779556-01Usado para conectar o amplificador ao cartão DAQ.
Folha de aço McMaster Carr3254K7Folha de aço para câmara de gravação personalizada
ÍmãsK & J MagneticsD42Para fixar a câmara de gravação ao suporte de anel
1/16" Célula Cast Acrílico TransparentePololuUsado para fazer câmara de gravação personalizada. O acrílico pode ser cortado a laser a pololu.com a partir do arquivo PDF fornecido
por

Referências

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