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Investigação da síntese do RNA usando 5-Bromouridine rotulagem e imunoprecipitação

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DOI:

10.3791/57056

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3 de maio de 2018

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1DANDRITE - Danish Research Institute of Translational Neuroscience, Dept. of Biomedicine, Aarhus University, 2Dept. of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

Neste artigo

Resumo

Esse método pode ser usado para medir a síntese do RNA. 5-Bromouridine é adicionado às células e incorporado na RNA sintetizado. Síntese de RNA é medido pela extração do RNA imediatamente depois da rotulagem, seguido de 5-Bromouridine-alvo da imunoprecipitação de rotulados RNA e análise por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa.

Resumo

Quando os níveis de estado estacionário do RNA são comparados entre duas condições, não é possível distinguir se as alterações são causadas por alterações na produção ou degradação do RNA. Este protocolo descreve um método para a medição da produção de RNA, usando 5-Bromouridine de rotulagem do RNA seguido por imunoprecipitação, que permite a investigação do RNA sintetizado dentro de um curto espaço de tempo (por exemplo, 1 h). A vantagem de 5-Bromouridine-rotulagem e imunoprecipitação sobre o uso de inibidores de transcriptional tóxicos, tais como α-amanitin e actinomicina D, é que não há nenhum ou muito baixos efeitos na viabilidade celular durante o uso a curto prazo. No entanto, porque 5-Bromouridine-imunoprecipitação captura apenas RNA produzido dentro do tempo curto de rotulagem, lentamente produzido, bem como rapidamente degradada RNA pode ser difícil de avaliar por esse método. O RNA 5-Bromouridine-rotulados capturado por imunoprecipitação-5-Bromouridine pode ser analisado por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa na próxima geração de sequenciamento. Todos os tipos de RNA podem ser investigados, e o método não está limitado a medição do mRNA, tal como é apresentado neste exemplo.

Introdução

5-Bromouridine (BrU) imunoprecipitação (IP) permite o estudo da produção de RNA em células com n ou efeitos muito limitados na fisiologia de células durante o breve período1,2de rotulagem. O método baseia-se a incorporação do derivado sintético uridina BrU em RNA recém sintetizado seguido pelo IP do RNA rotulado usando anticorpos anti-BrU (Figura 1).

Tem sido conhecido por décadas a síntese de proteínas pode ser transcriptionally regulado, e a existência de factores de transcrição foi hipotetisada há mais de 50 anos3. Hoje, é conhecido que várias doenças são causadas pela desregulação de transcrição e a estabilidade do RNA (S1 Figura complementar em referência4), e a capacidade de medir as mudanças na produção do RNA é de grande importância na doença de compreensão desenvolvimento.

Por outro lado, ferramentas para regular a produção de RNA fornecem novas possibilidades para o tratamento de doenças causadas pela expressão de proteína muito pouco ou demais, ou acúmulo de proteína, como na doença de Parkinson (PD). A proteína predominante acumulando agregados como insolúveis em PD é α-synuclein, e o nível de α-synuclein está diretamente ligado à doença, como a multiplicação de gene do gene da α-synuclein causa familiar PD5. Além disso, α-synuclein agrega de forma dependente de concentração. Downregulation dos níveis de mRNA de α-synuclein, portanto, é uma estratégia terapêutica interessante, que tem sido conseguida com êxito usando a interferência do RNA para diminuir a perda de célula neuronal em modelos de roedores de PD6,7.

É importante ser capaz de medir as mudanças na produção de RNA causada por doença ou intervenções terapêuticas. Métodos de última geração para medição níveis de estado estacionário de RNA, como a transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR), não são capazes de distinguir entre alterações causadas por regulamento transcriptional ou alterados Estabilidade do RNA. Um método amplamente utilizado para a investigação de taxas de decaimento de RNA está bloqueando da maquinaria transcricional usando compostos tais como α-amanitin ou actinomicina D, seguido por medições de RNAs os decadentes. No entanto, existem alguns problemas associados com um bloqueio geral da transcrição em células, como a indução de apoptose8,9. Ao lado dos efeitos citotóxicos, inibidores transcriptional também apresentam vários problemas técnicos, como a lenta absorção celular de α-amanitin e falta de especificidade de actinomicina D (revisto em referência10).

Para evitar o bloqueio total da transcrição, têm sido utilizados análogos de nucleotídeos, tais como uridina 5-ethynyl (5-UE), 4-thiouridine (TU-4) e BrU. Estes são prontamente ocupados por células de mamíferos e incorporadas RNA recém sintetizado, permitindo pulso-rotulagem do RNA dentro de um intervalo de tempo específico. BrU é menos tóxico do que o 5-UE e 4-TU, tornando-se o preferido análogo escolha11,12.

BrU-IP pode ser usado para investigar tanto a taxa de síntese de RNA e estabilidade e, portanto, distinguir entre as causas de alterações no RNA total. Este artigo incidirá sobre a medição de síntese de RNA e refere-se a referência2 para obter detalhes sobre a investigação da estabilidade do RNA. Para investigar a síntese do RNA, as células são brevemente rotuladas com BrU , por exemplo, para 1 h, seguido por BrU-IP1 (Figura 1). Isso permite que as medições do RNA sintetizado no curto prazo rotulagem e mudanças observadas dará uma melhor estimativa de regulamentos na síntese de RNA do que através da medição de alterações no RNA total por RT-qPCR. Deve ser mencionado, no entanto, que, apesar do tempo de rotulagem, por exemplo, apenas 1 h, degradação ainda pode ter uma influência sobre os níveis de RNA observada.

RNA de experimentos de BrU-IP são adequados para análise a jusante por tanto RT-qPCR1 ou próxima geração sequenciamento2,13. Outros métodos de detecção de RNA padrão, tais como a mancha do Norte ou ensaio da proteção ribonuclease, podem também ser aplicáveis para certos RNAs.

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Protocolo

Nota: Executar todas as etapas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário e manter buffers no gelo ou na geladeira (exceto a partir da eluição de buffer contendo SDS). O protocolo é dividido em 5 seções: amostras de preparação do RNA; preparação dos grânulos para IP; ligação do RNA BrU-rotulados de grânulos; eluição e purificação do RNA acoplado com rótulo BrU, pela extração de fenol-fenol/clorofórmio-clorofórmio 3 passos; análise do RNA (no exemplo usando RT-qPCR)

1. preparação de amostras do RNA

  1. HEK293T contagem de células usando uma célula automatizada counter e sementes 3.500.000 células em um prato de petri de 10 cm em meios de crescimento de 10 mL (meio modificado águia de Dulbecco suplementada com 10% de soro fetal bezerro e 50 µ g/mL penicilina/estreptomicina) para obter um total de > 40 µ g de RNA Após 48 h extração mais tarde. Manter as células em 37 ° C e 5% de CO2.
  2. 48 h após a semeadura, Aspire o meio de crescimento de 8 mL e deixar 2 mL para trás para evitar que sequem as células. Adicionar 2 mM BrU e qualquer tratamento para os 8 mL aspirado meios de crescimento e remover o resíduo 2 mL das células antes de reaplicar o 8ml BrU contendo meio de crescimento. Evite o uso de mídia fresco a pedido do BrU às células, pois isto pode induzir alterações na expressão gênica.
  3. Incube as celulas por 1h com BrU e tratamento. Lavar as células no buffer do Hank 5ml e trypsinize as células usando a tripsina 0,05% de 2 mL. Adicione mídia de crescimento de 8 mL para parar a reação, transfira as células para um tubo de 15 mL e spin para baixo as células por 2 min a x 1.000 g.
  4. Remover o sobrenadante e extrair o centrifugado usando um isolamento de RNA RNA total kit (veja a Tabela de materiais) ou qualquer outro método preferencial e eluir em livre de RNase H2O. loja o RNA a-80 ° C até que esteja pronto para prosseguir.

2. preparação dos grânulos para IP

  1. Prepare-se para o número de amostras a ser investigado mais um extra para contabilizar a perda durante a pipetagem e girar a mistura grânulos em lotes. Resuspenda grânulos magnéticos do IgG anti-rato completamente através da mistura de turbilhão e tirar 20 grânulos µ l por amostra em um tubo de 1,5 mL RNase-livre. O tubo de 1,5 mL em um carrinho magnético e deixar aproximadamente 20 s para os grânulos de lugar para recolher no lado.
  2. Remover o sobrenadante, retire o tubo do suporte magnético e Resuspenda em buffer de BrU-IP 400 µ l 1 x pipetando. Girar o tubo muito brevemente para 2 s em uma centrífuga de mesa, colocá-lo de volta no suporte magnético e remover o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem uma vez.
  3. Vinculação inespecífica de bloco para as contas usando heparina. Resuspenda as contas em 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL de tampão heparina e deixe o rotacionando para lavagem de 30 min. as contas de uma vez, como no passo 2.2.
    Nota: A heparina é um polímero carregado negativamente, que irá competir com RNAs para vinculação. tRNA ou outros RNAs irrelevantes também podem ser usados se o aplicativo a jusante não é sequenciamento.
  4. Resuspenda as contas em 1 mL 1 x buffer de BrU-IP e adicionar 1,25 µ g/amostra anticorpo anti-α-Bromodeoxyuridine, que também reconhece o BrU. Incubar os grânulos por 1h rodando, ou durante a noite em temperatura ambiente.
  5. Lave os grânulos três vezes, como no passo 2.2. Resuspend os grânulos no buffer de BrU-IP 50 µ l da amostra/1X suplementado com 1 mM BrU e deixar rotação por 30 min diminuir a sensibilidade do anticorpo ligado aos talões e por este meio o risco de ligação inespecífica durante o IP.
  6. Lave os grânulos três vezes como na etapa 2.2 e ressuspender em buffer de 50 µ l da amostra/1xBrU-IP.

3. ligação do RNA BrU-rotulados de grânulos

  1. Medida de concentrações de RNA nos extratos do RNA da etapa 1.3 utilizando espectrofotometria ultravioleta-visível e diluir a 40 µ g/ml RNA de cada amostra livre de RNase H2O para um volume total de 200 µ l.
  2. Calor de amostras do RNA por 2 min a 80 ° C para desnaturar o RNA e spin brevemente em uma centrífuga do tabletop. Adicione 200 µ l 2 x inibidor de RNAse/BrU-IP + BSA.
  3. Adicione 50 µ l resuspended e preparado grânulos da etapa 2.6 para cada amostra e deixar a rotação lavagem de 1 h. os grânulos quatro vezes como no passo 2.2.

4. eluição e purificação de RNA pela extração de fenol-fenol/clorofórmio-clorofórmio 3 passos

  1. Eluir RNA e realizar a extração do fenol
    1. Resuspend os grânulos no tampão de eluição 200 µ l para Eluir o RNA e rapidamente posteriormente adicionar 200 fenol µ l, pH 6,6 (cuidado: tóxica, ver nota abaixo passo 4.1.2) para remover todas as moléculas de RNA não-da amostra.
    2. Giro mix a amostra e rotação 3 min a 25.000 x g em uma centrífuga do tabletop.
      Nota: O fenol é tóxico e deve ser tratada em uma coifa usando a proteção da pele. O pH ligeiramente ácido garante que apenas RNA e não o DNA, é extraído. O RNA permanecerá na fase aquosa superior devido à natureza hidrofílica das acusações. Os núcleos hidrofóbicos das proteínas irão Vincular de fenol e mover-se para a fase orgânica fenol inferior.
  2. Realizar a extração do fenol-clorofórmio
    1. Aspirar o máximo superior-fase quanto possível (aproximadamente 190 µ l de 200 µ l, dependendo da experiência na manipulação) e movê-lo para um tubo com 200 µ l fenol/clorofórmio, pH 6,6 (cuidado: tóxica, ver nota). Certifique-se de aspirar a mesma quantidade através de amostras.
    2. Giro misturar a amostra e rotação por 3 min a 25.000 x g.
      Nota: Clorofórmio é tóxico e deve ser tratado em uma coifa usando a proteção da pele. Clorofórmio é adicionado para remover o fenol, que pode afetar a análise a jusante do RNA inibindo a transcrição reversa14 e polymerase de reacções em cadeia15.
  3. Realizar a extração de clorofórmio aspirando a fase aquosa superior como antes (agora aproximadamente 180 µ l) e transferir para um tubo contendo 200 clorofórmio µ l. Redemoinho misturar a amostra e girar 3 min a 25.000 x g.
  4. Aspire a fase aquosa superior como antes (agora aproximadamente 170 µ l) e transferir para um tubo contendo 17 µ l (volume de 1/10) M 3 CH3COONa, pH 6.0. Para neutralizar e precipitar o RNA a partir da solução aquosa, adicione 2 µ l o glicogénio (20 mg/mL), que precipita juntamente com RNA e torna mais visível, a pelota do RNA.
  5. Adicione etanol a 96% 500 µ l para aumentar a ligação entre os íons de sal e RNA e misture por inversão do tubo algumas vezes. Deixe o tubo durante a noite a-20 ° C ou 15 min no gelo seco.
  6. Girar a amostra a 25.000 x g, 4 ° C por 30 min. Discard sobrenadante sem perturbar o sedimento e lave o pellet em 185 µ l 75% de etanol para remover qualquer sal residual. Girar a 25.000 x g, 4 ° C por 5 min.
  7. Descartar o sobrenadante completamente sem perturbar o sedimento e deixar a pelota para secar 5-10 min com uma tampa aberta. Resuspenda em 10 µ l livre de RNase H2O aplicado na lateral do tubo para evitar perturbar a pelota.

5. análise do RNA

  1. Preparar o cDNA usando uma transcrição reversa do cDNA kit (veja a Tabela de materiais) ou qualquer outro preferido método usando 2 µ l da amostra do RNA e RNA total de 1 µ g fermento como portador do RNA para a reação de síntese de cDNA (não é usada se o cDNA é usado para sequenciamento de próxima geração). Use 1 µ g RNA sem fermento do RNA para a preparação de cDNA de entrada correspondente.
  2. CDNA diluído 01:25 e mistura 9 µ l diluída cDNA com 10 µ l de qPCR mestre mistura e 1 µ l da sonda fluorogenic, ambos especificados na Tabela de materiais.
    Nota: A diluição do cDNA depende da preparação do cDNA e qPCR método usado.
  3. Execute o seguinte programa de qPCR (por exemplo, em um sistema rápido de real-time PCR 7500 ou equivalente): 2 min a 50 ° C, 20 s a 95 ° C, 40 ciclos de 3 s a 95 ° C e 30 s a 60 ° C.

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Resultados

Nossos testes iniciais de tempo BrU-rotulagem foram realizados em células AsPC-1. As células foram tratadas com BrU para 0, 1, 2 e 4,5 h, seguido por extração de RNA total e BrU-IP. GAS5 e GAPDH foram medidos em BrU-IP do RNA, que demonstrou que a rotulagem de 1h foi suficiente para atingir uma aproximadamente 9 - e 44 vezes mudança em relação ao fundo (h 0) GAPDH e GAS5, respectivamente.

BrU-IP e a análise descrita acima foram ...

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Discussão

Este protocolo descreve o uso de BrU-IP para determinação da produção de RNA pela rotulagem dos recém produzido RNA 1 h com BrU, seguido pela extração de RNA imediata e imunoprecipitação de RNA com rótulo BrU. Este método tem sido descrito anteriormente na referência16, e este artigo inclui algumas etapas adicionais para aumentar a especificidade do IP e pureza de RNA, por grânulos de pré-tratamento com baixas concentrações de BrU, bem como uma etapa de purificação de fenol-clorofórmio para Aument...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

A Fundação Lundbeck, Universidade de Aarhus, Dandrite e Lundbeck a/s com suporte a este trabalho.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ribolock Rnase inibidorThermoFisherEO0381
Dynabeads M-280 Ovelha anti-rato IgGLife Technologies11202D
α-Bromodeoxiuridina anticorpo de camundongoBD Bioscience555627
Nanodrop 1000Thermo FisherEspectrofotometria ultravioleta-visível
Fenol saturado de água pH 6,6ThermoFisherAM9712
Fenol:Clorofórmio:IAA 25:24:1 pH 6,6ThermoFisherAM9732
Kit de isolamento de RNA de alta purezaRoche11828665001
Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidadeThermoFisher4368814
Taqman Fast Advanced Master MixThermoFisher4444557qPCR Master Mix
Sondas de RNA TaqmanThermoFisherSNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1Sondas flurogênicas
7500 Sistema de PCR rápido em tempo realApplied Biosystems
ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's MediumLonzaBE12-604F
Soro fetal de bezerroBiochromS0115
Penicilina/EstreptomicinaBiochromA2213
Tampão5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,2 mM Na2HPO4 e 136,8 mM NaCl pH 6,77, autoclavado.
DEPC-H2O0,1% de dietilpirocarbonato tratado com H2
O 2xBrU-IP Tampão40 mM Tris-HCl pH 7,5 e 500 mM NaCl em DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse inibidor2xBrU-IP tampão suplementado com 1 μ g/μ L BSA e 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL de heparina2xBrU-IP tampão diluído 1:1 DEPC-H2O e suplementado com 1mg/mL de heparina
1xBrU-IP2xBrU-IP tampão diluído 1:1 em DEPC-H2O e suplementado com 0,5 μ g/μ L BSA e 20 U/mL Ribolock
Tampão0,1% SDS em H2O livre de RNAse
Linha celular de HEK293T da de Hank de eluição

Referências

  1. Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
  2. Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
  3. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
  5. Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
  6. Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
  7. Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
  8. Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
  9. Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
  10. Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription. 2, 103-108 (2011).
  11. Tani, H., et al. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
  12. Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
  13. Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
  14. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
  15. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
  16. Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
  17. Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
  18. Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
  19. Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
  20. Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).

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