Artigo de método

Um protocolo Facile para gerar proteínas Site-Specifically acetiladas em Escherichia Coli

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DOI:

10.3791/57061

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9 de dezembro de 2017

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Neste artigo

Resumo

Expansão do código genético serve como uma ferramenta poderosa para estudar uma grande variedade de processos biológicos, incluindo acetilação de proteínas. Aqui vamos demonstrar um protocolo fácil de explorar esta técnica para gerar homogeneamente acetilado proteínas em locais específicos em células de Escherichia coli .

Resumo

Modificações borne-translational que ocorrem em posições específicas das proteínas foram mostradas para desempenhar um papel importante em uma variedade de processos celulares. Entre eles, a acetilação reversível lisina é um do mais amplamente distribuído em todos os domínios da vida. Apesar de numerosos estudos de espectrometria de massa-baseado acetylome foram realizados, ainda mais, caracterização dessas metas de acetilação putativo tem sido limitada. Uma razão possível é que é difícil gerar proteínas puramente acetiladas em posições desejadas pela maioria das abordagens bioquímicas clássicas. Para superar este desafio, a técnica de expansão do código genético foi aplicada para usar o par de uma variante do engenharia pyrrolysyl-tRNA sintetase e seu tRNA cognatos de espécies de Methanosarcinaceae , para dirigir a incorporação de cotranslational de acetyllysine no site específico da proteína de interesse. Após a primeira aplicação no estudo de acetilação da histona, esta abordagem tem facilitado a estudos de acetilação em uma variedade de proteínas. Neste trabalho, temos demonstrado um protocolo facile para produzir proteínas site-specifically acetificadas usando a bactéria modelo Escherichia coli como o anfitrião. Malato desidrogenase foi usado como um exemplo de demonstração neste trabalho.

Introdução

Modificações borne-translational (PTMs) de proteínas ocorrerem após o processo de tradução e surgem de adição covalente de grupos funcionais para resíduos de aminoácidos, desempenhando papéis importantes em quase todos os processos biológicos, incluindo o gene transcrição, resposta ao estresse, diferenciação celular e metabolismo1,2,3. Até à data, cerca de 400 distintivo PTMs foram identificados4. A complexidade do genoma e a proteoma é amplificada em grande medida por PTMs de proteína, como regular a localização e atividade da proteína e afetam a interação com outras moléculas tais como proteínas, ácidos nucleicos, lipídios e cofactores5.

Acetilação de proteínas tem estado na vanguarda dos estudos PTMs nas últimas duas décadas6,7,8,9,10,11,12. Acetilação de lisina foi descoberta em histonas há mais de 50 anos13,14, tem sido bem analisadas e é conhecida por existir em mais de 80 fatores de transcrição, reguladores e várias proteínas15, 16,17. Estudos na acetilação de proteínas não apenas nos proporcionou uma compreensão mais profunda de seus mecanismos reguladores, mas também guiada tratamentos para uma série de doenças causadas por acetilação disfuncional18,19, 20 , 21 , 22 , 23. acreditava-se que a acetilação de lisina só acontece nos eucariontes, mas estudos recentes têm mostrado que acetilação de proteínas também desempenha papéis-chave na fisiologia bacteriana, incluindo a quimiotaxia, resistência ácida, ativação e estabilização do Ilhas de patogenicidade e virulência outra relacionadas com proteínas24,25,26,,27,28,29.

Um método comumente usado para caracterizar bioquimicamente acetilação de lisina é usando o mutagenesis local-dirigido. Glutamina é usada como um mímico de acetyllysine por causa de seu tamanho semelhante e polaridade. Arginina é utilizada como uma mímica de lisina não-acetilado, uma vez que preserva a sua carga positiva sob condições fisiológicas, mas não pode ser acetilado. No entanto, ambos imita não é isosteres real e não sempre produzir os resultados esperados30. A abordagem mais rigorosa é gerar proteínas homogeneamente acetiladas em resíduos de lisina específica, que é difícil ou impossível para métodos mais clássicos, devido a baixa estequiometria da acetilação de lisina na natureza7,11. Este desafio tem sido desvendado pela estratégia de expansão de código genético, que emprega uma engenharia pyrrolysyl-tRNA sintetasePyl com acetyllysine, variante de Methanosarcinaceae espécie de cobrar tRNA que utiliza o host translacional máquinas para suprimir o UAG parar códon no mRNA e direciona a incorporação de acetyllysine na posição projetada da proteína alvo31. Recentemente, otimizamos o sistema com uma melhoria de tRNA EF-Tu-ligação32 e um atualizado acetyllysyl-tRNA sintetase33. Além disso, temos aplicado este sistema de incorporação reforçada em estudos de acetilação da malato desidrogenase34 e correntes-tRNA sintetase35. Aqui, demonstramos o protocolo para gerar proteínas puramente acetiladas da clonagem molecular para identificação bioquímica usando malato desidrogenase (MDH), que temos estudado extensivamente como um exemplo demonstrativo.

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Protocolo

1. site-Directed Mutagenesis do Gene alvo

Nota: O MDH é expressa sob promotor T7 no vetor com a origem de CloDF13 e um número de cópia de 20 a 4034 pCDF-1 .

  1. Introduzir o códon âmbar para na posição 140 no gene por Cartilhas (encaminhar cartilha: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG e reverter a primeira demão: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), seguindo as instruções do kit mutagenesis local-dirigido.
  2. Amplificar o plasmídeo de modelo contendo o gene de dehidratase selvagem-tipo malato e inserir a mutação de códon de parada pela reação do polymerase reação em cadeia (PCR). A mistura de reação, incluem 12,5 µ l de mistura de enzima 2 X DNA polimerase, 1,25 µ l de cartilha para a frente de 10 µM, 1,25 µ l de primer reverso de 10 µM, 1 µ l do modelo de DNA (20 ng / µ l) (pCDF-1 plasmídeo contendo o gene do selvagem-tipo MDH) e 9 µ l de água livre de nuclease.
    1. Usar parâmetros de reação de PCR como segue: inicial de desnaturação a 98 ° C por 30 s; 25 ciclos de 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C e 3 min a 72 ° C; extensão final a 72 ° C por 3 min. Após a PCR, adicione o material amplificado diretamente à mistura enzima quinase-Ligase-DpnI do kit por 1h à temperatura ambiente para a remoção de circularização e modelo.
      Nota: A mistura de reação contém 1 µ l de produto do PCR, 5 µ l de 2 X amortecedor da reação, 1 µ l do mix de enzima X quinase-Ligase-DpnI 10 e 3 µ l de água livre de nuclease.
  3. Adicionar 5 µ l da mistura de reação para o tubo de 25 µ l descongelado competentes de Escherichia coli DH5α células do kit. Cuidadosamente agite o tubo para misturar e coloque a mistura no gelo por 30 min. de choque do calor a mistura a 42 ° C por 30 s e o lugar no gelo por mais 5 min.
    1. Pipetar 600 µ l de temperatura ideal Super caldo com meios de repressão (SOC) Catabolite do kit para a mistura, incubar a 37 ° C por 60 min com agitação a 250 rpm, espalha 100 µ l de em uma placa de ágar de caldo (LB) lisogenia com o antibiótico correspondente e incubar durante uma noite a 37 ° C, com agitação a 250 rpm.
  4. Escolha colônias única de 4-6 em 6 mL frescos LB meios de comunicação com o antibiótico correspondente e incubar a 37 ° C durante a noite, com agitação a 250 rpm. Extrai o plasmídeo de cada cultura durante a noite por kit de purificação de plasmídeo, seguindo o manual do fabricante, então enviar plasmídeos para sequenciamento de DNA de acordo com o protocolo do prestador de serviços para confirmar a mutação de códon de parada em posições corretas.
  5. Armazene a tensão com a sequência correta a-80 ° C, misturando cultura durante a noite de 1 mL e 300 µ l 100% DMSO.

2. a expressão da proteína acetilada

  1. Inserir os genes de otimizado acetyllysyl-tRNA sintetase33 e otimizado tRNAPyl 32 para o plasmídeo pTech . Coloque o gene tRNA sintetase, sob o promotor constitutivo lpp . Coloque o gene tRNA sob o de promotor constitutivo proK 34.
    1. Co, transformar o vetor de expressão34 contendo o gene mutado TAG-contendo da malato desidrogenase, e o plasmídeo abrigando o acetyllysine otimizado sistema de incorporação, em 25 µ l descongelado competente Escherichia coli BL21(DE3) células por choque térmico a 42 ° C, durante 10 s e o lugar no gelo por mais 5 min.
    2. Pipetar 600 µ l da mídia SOC de temperatura para a mistura, incubar a 37 ° C por 60 min com agitação a 275 rpm, espalhar 100 µ l em um prato com 100 µ g/mL Estreptomicina e cloranfenicol 50 de µ g/mL e incubar durante uma noite a 37 ° C, com agitação a 275 rpm.
  2. Pegar uma única colônia da placa e inocular em mídia LB fresca 15ml com 100 µ g/mL Estreptomicina e cloranfenicol 50 µ g/mL em um tubo de 50 mL durante a noite a 37 ° C com agitação na velocidade de 250 rpm. Transferir a cultura durante a noite de 15 mL para mídia LB fresca 300ml com antibióticos num balão de 1L e incubar a 37 ° C com agitação a 250 rpm.
  3. Dissolver acetyllysine com água para fazer a solução estoque de 100 mM, loja a 4 ° C. Adicionar acetyllysine de 5 mM e 20 mM nicotinamida (inibidor de deacetilases) para a mídia de crescimento quando absorvência atinge 0,5 em 600 nm.
    1. Desenvolvem-se células para um adicional 1 h a 37 ° C, agitação a 250 rpm, em seguida, adicionar 0,5 mM IPTG para expressão de proteínas e desenvolvem-se células a 25 ° C durante a noite, agitando a 180 rpm.
      Nota: As condições de expressão precise de otimização para proteínas diferentes.
  4. Coletar as células por centrifugação a 3.000 x g a 4 ° C por 15 min, desprezar o sobrenadante e lavar pelotas de célula com o tampão fosfato (PBS) tampão salino (10mm Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Recolher pilhas lavadas a 10.000 x g a 4 ° C por 5 min, desprezar o sobrenadante e armazenar pelotas de célula a-80 ° C.

3. purificação da proteína acetilada

  1. Descongelar as pelotas de célula congelado no gelo e re-suspender com 15 mL de tampão de lise (50mm (hidroximetil) aminometano (Tris) pH do tris 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol 20mm e nicotinamida 20 mM), 5 µ l de β-Mercaptoetanol e 1 nuclease de Benzonase µ l (250 unidades).
  2. Quebrar as células pelo sonication 40 kHz em 70% da potência de saída com 10 ciclos de 10 rajadas de s, seguidos de intervalos de 30 s para arrefecimento de extrato bruto de formulário. Extraia o centrifugador bruto a 20.000 x g, durante 25 min a 4 ° C. Filtrar o sobrenadante com o filtro de membrana de 0,45 µm e carregar em uma coluna contendo 1 mL de resina de (Ni-NTA) ácida nitrilotriacético-níquel incubada com 20 mL de água e 20 mL de tampão de Lise.
    Nota: As células também podem ser quebradas pelo detergentes suaves, se sonication não está disponível.
  3. Lavar a coluna com 20 mL de tampão de lavagem (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol 50mm e nicotinamida 20 mM) e em seguida eluir com 2 mL de tampão de eluição (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol 150mm e nicotinamida 20 mM).
  4. Do desalt a fração de eluição com dessalinização tampão (25 mM Tris pH 7,8 e 10 mM de NaCl) pela coluna PD-10, seguindo o manual do fabricante. Medir a concentração da proteína eluted, seguindo as instruções do reagente de ensaio da proteína de Bradford. A proteína demolhada está pronta para novas experiências.
    Nota: Fazer estoque de glicerol 50% da proteína e manter-se na-80 ° C para armazenamento.

4. bioquímica caracterização da proteína acetilada

  1. Análises de espectrometria de SDS-PAGE e massa.
    1. Denaturação de proteínas com o sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS) amortecedor da amostra (5 µ l proteínas da amostra com 2 µ l 4 X tampão de amostra SDS) em um tubo de 2 mL a 105 ° C por 5 min, centrifugar a mistura a 2000 x g por 10 s, carga para o 4-20% de sódio Dodecil sulfato do gel de polyacrylamide electroph gel de oresis (SDS-PAGE) e executar a 200 V por 30 min.
    2. Lave o gel com água destilada e agitar suavemente durante 5 min, repetir o processo 3 vezes. Descartar a água e manchar o gel com azul de Coomassie mancha para 1 h com agitação suave. De manchar o gel com água destilada, agitar suavemente durante 30 min e repetir esta mancha de 3 vezes.
    3. Cortar a banda em kDa 33 sobre o gel de SDS-PAGE de manchadas de azul de Coomassie e enviá-lo para instalações de espectrometria de massa ou empresas para confirmar que o acetyllysine foi incorporada na posição projetada.
      Nota: O protocolo de análise de espectrometria de massa seguiu o experimento anterior34.
  2. Mancha ocidental
    1. Execute o gel de SDS-PAGE com o mesmo protocolo na etapa 4.1. Depois o gel executar, mergulhe o gel com o buffer de transferência (25 mM Tris glicina 192 mM, pH 8.3 e 20% metanol) por 15 min.
    2. Ativar um 0,2 µm, membrana de difluoreto (PVDF) de polivinilideno 7 x 8,5 cm com metanol por 1 min e enxágue com buffer de transferência antes de preparar o sanduíche de transferência.
      Nota: O metanol é perigoso em caso de contacto com a pele, olhos, ingestão ou inalação. Excesso de exposição severo pode resultar em morte.
    3. Fazer o sanduíche de transferência do cátodo para o ânodo (esponja, papel de filtro, SDS-PAGE gel, PVDF membrana, papel de filtro e esponja). Colocar a pilha no tanque de transferência, execute em uma corrente constante de 350 mA por 45 min.
      Nota: Tempo de transferência pode precisar de otimização.
    4. Lavar a membrana PVDF com 25 mL solução tampão salino, 0.1% Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween-20, pH 7,6) buffer para 5 min com agitação suave. Bloquear a membrana com 5% albumina de soro bovino (BSA) no buffer TBST por 1h à temperatura ambiente.
    5. Incube a membrana com acetyllysine-anticorpo conjugado HRP com uma concentração final de 1 µ g/mL diluido com 5% BSA em TBST em 4 ° C durante a noite com agitação suave.
      Nota: Para resultados mais rápidos, esta etapa pode ser executada em temperatura ambiente por 1 h. A diluição de anticorpo pode precisar de otimização.
    6. Lave a membrana com 20 mL de tampão TBST por 5 min com agitação suave, repetindo o passo 4 vezes. Aplica o substrato de quimioluminescência para a membrana, seguindo as instruções do fabricante. Captar o sinal com um dispositivo de carga acoplada (CCD) baseado em câmera câmera.

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Resultados

O rendimento de proteína MDH acetilado foi 15 mg por cultura de 1 L, enquanto que do selvagem-tipo MDH foi 31 mg / cultura de 1 L. Proteínas purificadas foram analisadas por SDS-PAGE, conforme mostrado na Figura 1. O selvagem-tipo MDH foi usado como um controle positivo34. A proteína purificada de células de abrigar o sistema de incorporação de acetyllysine (AcK) e o gene mutante mdh , mas sem AcK em meios de crescimento, foi ...

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Discussão

A incorporação genética de aminoácidos não-canônico (ncAAs) baseia-se a supressão de um codão atribuído, principalmente o âmbar stop códon UAG36,37,38,39, pelo tRNA ncAA-carregada contendo o anticodão correspondente. Como é sabido, o códon UAG é reconhecido pelo lançamento factor-1 (RF1) em bactérias, e isso pode também ser suprimido por perto os tRNAs cognata de hosts cobrados pela canonical a...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH (AI119813), o arranque da Universidade de Arkansas e o prêmio do Instituto de Biociências de Arkansas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ensaio de proteína de BradfordBio-Rad5000006Concentração de proteína
4x Tampão de amostra Laemmli Tampãode amostra Bio-Rad1610747SDS
Coloração Coomassie G-250 ColoraçãoBio-Rad1610786SDS-PAGE
4-20% Gel pronto para SDS-PAGEBio-Rad4561093Determinação de proteínas
Ac-K-100 (Conjugado HRP)Célula Sinalização6952Anticorpo
IPTGCHEM-IMPEX194Indutor de expressão
Nε -Acetil-L-lisinaCHEM-IMPEX5364Aminoácido não canônico
PD-10 coluna de dessalinizaçãoGE Healthcare17085101Dessalinização
Q5 Kit de Mutagênese Dirigida ao LocalNEBE0554Apresentando as células do códon de parada
BL21 (DE3)NEBC2527Expressando a cepa
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27106Extraindo plasmídeos
Resina Ni-NTAQIAGEN30210Resina de purificação de afinidade
nicotinamidaSigma-AldrichN3376Inibidor de desacetilase
β-MercaptoetanolSigma-AldrichM6250Agente redutor
Reagente de extração de proteína BugBusterSigma-Aldrich70584Quebrando células
Benzonase nucleaseSigma-AldrichE1014DNase
ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher32106Quimioluminescência
Pré-misturada LB CaldoVWR97064Meio de crescimento celular
Albumina de soro bovinoVWR97061-416bloqueio de western blots
em gel

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