Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Summary

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Abstract

Microglia, as células imunes residentes no cérebro, são as socorristas a inflamação ou lesão no sistema nervoso central. Recente pesquisa revelou microglia ser dinâmico, capaz de assumir fenótipos pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. Tanto (pró-inflamatórias) M1 e M2 peça de fenótipos (pro-reparativa) um papel importante em condições de MPTP, tais como lesão cerebral perinatal e exposição de diferentes funções em resposta a certos estímulos ambientais. A modulação da ativação microglial tem sido observada para conferem neuroproteção sugerindo microglia pode ter potencial terapêutico em lesão cerebral. No entanto, mais pesquisa é necessária para compreender melhor o papel da microglia na doença, e este protocolo facilita isso. O protocolo descrito abaixo combina um processo de centrifugação gradiente de densidade para reduzir restos celulares, com a separação magnética, produzindo uma amostra altamente pura das pilhas microglial primário que pode ser usado para a experimentação in vitro , sem a necessidade de 2-3 semanas de cultivo. Além disso, as etapas de caracterização produzem robustos dados funcionais sobre microglia, auxiliando os estudos para melhorar a nossa compreensão da polarização e injeção dessas células, que tem fortes implicações no campo da medicina regenerativa.

Introduction

Danos adquiridos durante o período perinatal da inflamação, hipóxia-isquemia e hemorragia podem ter uma matriz de sequelas de longo prazo. Teoriza-se que envolvem inflamação e isquemia com consequente morte neuronal e axonal¹complexa fisiopatologia da lesão cerebral perinatal. A resposta imune inata desempenha um papel importante na cascata de eventos levando a lesão².

Microglia, as células imunes residentes dentro do sistema nervoso central (SNC), estão as socorristas para lesão³. Microglia são tipos de células de plástico com a capacidade de ser protetora ou tóxico, d....

Protocol

Os procedimentos a seguir foram aprovados pelo Comitê de ética Animal da Universidade de Monash. Camundongos C57Bl6/J P3-6 de saudável em recém-nascidos não tratados foram usados para gerar os resultados representativos.

1. enzimática digestão

Nota: É importante considerar a esterilidade quando isolar e cultivar as células primárias. Garantindo que o ambiente é tão estéril quanto possível, ao mesmo tempo a dissecção inicial e colheita de cérebros murino podem ser concluídas fora um capuz de fluxo laminais, com todas as etapas realizadas dentro de uma capa de fluxo laminar.

1. Usando instrumentos esteriliza....

Results

Usando os métodos descritos aqui, populações puras de microglia podem ser isoladas e podem estar prontas para a caracterização de uso in vitro e análise de FACS. Para começar, até 18 animais podem ser usados por ser rejeitada, com um rendimento esperado de cerca de 450.000-600.000 células microglial. É crucial confirmar primeiro a pureza das células isoladas, e para isso a análise FACS foi realizada pela coloração para os dois marcadores CD11b. identificação da microglia e CD45 p.......

Discussion

Microglia têm a capacidade de ser pró - e anti-inflamatórias, alterada por estímulos do ambiente. Estudos anteriores mostraram que a modulação da ativação da microglia pode conferir neuroproteção. Sua capacidade de fornecer proteção aos neurônios e reparar lesões necessita de mais pesquisas para promover a compreensão atual dessas células complexas. Assim, o isolamento de alta pureza primária microglia é uma técnica importante e útil. Este é um método relativamente rápido para obtenção de altamente puro microglia primári.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, baixo teor de glicose, piruvato	Gibco	11885084
Antibiótico-Antimicótico (100X)	Gibco	15240062
DNaseI grau II de pâncreas	bovino Sigma-Aldrich	10104159001
Papaína de látex de mamão, solução aquosa tamponada	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
Soro Fetal Bovino, qualificado, inativado por calor	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Gibco	14175-103
Hank's Balanced Salt Solution (10X)	Gibco	14185052
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit	StemCell Technologies	18770	EasySep magnet variant
Ímã EasySep	StemCell Technologies	18000
EasySep Buffer	StemCell Technologies	20144
Dulbecco's Phosphate tampoed salina	Gibco	14040182
Tripsina (2.5%) (10X)	Gibco	15090-046
Purificado Rato Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD Biosciences	553141
Falcon 5mL Tubo de Teste PP de Alta Clareza de Fundo Redondo, com Tampa de Pressão, Corning Estéril		352063
175cm² Frasco de Cultura de Células de Pescoço Angular com Tampa de Ventilação	Corning	431080
Lipopolissacarídeos de Escherichia coli O127:B8	Sigma-Aldrich	L5024
96 Poços TC-Treated Microplacas tamanho 96 poços, transparente, poliestireno, fundo redondo	Corning	CLS3799
Paraformaldeído (pó, 95%)	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100
Rabbit Anti-Iba1	Wako	01919741
Cabra Anti-Coelho IgG H & L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
FACS Anticorpos	Company	Número de Catálogo
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 CD11b	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo Red E. coli BioPartículas Conjugado	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin.V_FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
Solução de Iodeto de Propodium	Miltenyi Biotech	130-093-233