Neste artigo nós fornecemos detalhes para os métodos de produção e controle de qualidade de uma proteína de fusão recombinante IL4-10. Também mostramos como testar a eficácia desta proteína para resolver a dor em um modelo do rato da dor inflamatória.
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Artigo de método
Desenvolvimento de proteínas recombinantes para tratar a dor crônica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Dor crônica é difícil de tratar e novas abordagens para resolver a dor persistente são urgentemente necessárias. Citocinas anti-inflamatórias são candidatos promissores para tratar condições de dor debilitante devido à sua capacidade de regular as interações de neuro-imune aberrantes. No entanto, fisiologicamente, eles trabalham em uma rede de várias citocinas, e consequentemente o seu efeito terapêutico não pode ser ideal quando usado como stand-alone drogas. Para superar esta limitação, nós desenvolvemos uma proteína de fusão das citocinas anti-inflamatórias, IL4 e IL10. Aqui, descrevemos os métodos de produção e controle de qualidade da proteína de fusão recombinante IL4-10 e testamos a eficácia da proteína de fusão do IL4-10, para resolver a dor em um modelo do rato da dor inflamatória persistente.
Introdução
Dor crônica continua sendo um dos problemas médicos mais debilitantes e sob-Tratado do século XXI, afetando > 20% da população adulta1,2. No entanto, tratamentos para proporcionar alívio da dor crônica, muitas vezes são ineficazes ou devem ser descontinuados devido a efeitos colaterais graves3. Importante, atualmente drogas disponíveis apenas fornecer alívio sintomático, mas não significativamente modificar ou curar dor crônica. Embora a dor crônica parece ser um distúrbio neurológico, a evidência sugere envolvimento do sistema imunológico em dor crônica desenvolvimento
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Protocolo
Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com as diretrizes internacionais e aprovação prévia do Comitê de ética local experimental. Sangue total foi obtida do serviço de doador do Mini (Mini doador Dienst, MDD) na Universidade Medical Center Utrecht (UMCU) nos Países Baixos. O MDD recebeu aprovação positiva do Comitê de ética médica do UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) para a protocolo número 07-125/C.
1. caracterização e produção de proteínas
- Cultura celular
Nota: Consulte a Tabela de materiais por meio de cultura utilizado.- Descongele as células HEK293-F ....
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Resultados
Uma imagem representativa de um gel de SDS-PAGE contendo diferentes frações obtidas durante a purificação de cromatografia de afinidade é mostrada na Figura 1A. Na carga (L) e o fluxo através de frações (FT), todas as proteínas presentes no sobrenadante HEK293 são observadas. Nenhuma proteína é observada na fração de lavagem (W). Na fração de eluição (E), observam-se duas bandas de 35 e 37 kDa correspondente a dois glycoforms diferentes da pr.......
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Discussão
Este manuscrito descreve métodos para a produção e caracterização de um recombinante da proteína de fusão de IL4-10 e métodos para testar a sua eficácia na inibição de hiperalgesia inflamatória em modelos do rato da dor inflamatória persistente. A produção e purificação da proteína de fusão do IL4-10 é realizada em pequena escala. Células HEK293 são Selecionadodas como um sistema de expressão para produção de proteína, porque eles permitem modificações borne-translational que não podem ser realizadas em sistemas de expre.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Parte deste trabalho foi financiado por uma Universidade Utrecht Life Sciences conceder
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células FreeStyle 293-F | Invitrogen | R790-07 | Células renais embrionárias humanas |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Meio de cultura |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Reagent de transfecção |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium para uso durante transfecções lipídicas catiônicas |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| Sepharose Ativada por CNBr 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | meio pré-ativado para acoplamento de anticorpos ou outras proteínas grandes |
| Ácido clorídrico fumegante 37% | Merck | 1003171000 | |
| Cloreto de sódio | Sigma | S7653-1kg | |
| Bicarbonato de sódio | Cloridrato de Trizma Sigma | 31437 | |
| Cloridrato | TRIS Sigma | T3253-500G | |
| Ácido Acético 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glicina-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer para eletroforese SDS |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS géis pré-moldados |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 coluna | Phenomenex | ||
| Mancha de proteína InstantBlue | Expedeon | ISB1L | pronta para usar Coloração de proteína Coomassie para géis de poliacrilamida |
| Humano IL-10 DuoSet ELISA | R& D | DY217B | |
| TNF humano e alfa; Conjunto ELISA | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carragena | Sigma-Aldrich | 22049 | mucopolissacarídeo vegetal |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | adjuvante da vacina |
| Seringa Hamilton Seringa | vidro | Sigma-Aldrich | 20779 |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Suporte de malha Von Frey | IITC Life Science | 410 | Suporte de malha |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | sondas sensoriais |
| Teste Plantar (Método Hargreaves) | IITC Life Science | 390G | teste plantar com vidro aquecido |
| Teste dinâmico de sustentação de peso | de déficit postural | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M |
| Colunas Econo-Column de vidro, 1,5 &vezes; Coluna | BIO-RAD | 7371532 | |
| Tubo de Diálise SnakeSkin | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Filtro de Seringa | Sartorius | 16555-K | , 0.45 μ |
| Contador e Analisador de Células M CASY | Roche |
Referências
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widesp....
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Reimpressões e permissões
