Artigo de método

Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos

DOI:

10.3791/57074

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16 de abril de 2018

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1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui nós apresentamos um protocolo para a manipulação do gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia, os corações de rato foram exteriorizados através do quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus codificação de genes específicos foram injetados com uma seringa o miocárdio, seguido por medição de expressão de proteínas via na vivo de imagem e Western blot análise.

Resumo

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Manipulação genética, especificamente no coração significativamente potenciar a investigação de doença cardíaca pathomechanisms e seu potencial terapêutico. Na vivo entrega cardíaco-específicas do gene é comumente conseguida entrega local ou sistêmica. Injeção sistêmica através da veia da cauda é fácil e eficiente em manipular a expressão de gene cardíaco usando vírus adeno-associado recombinante 9 (AAV9). No entanto, esse método requer uma quantidade relativamente alta de vetor para transdução eficiente e pode resultar na transdução de gene nontarget órgão. Aqui, descrevemos um método simples, eficiente e economia de tempo de injeção Intramiocárdica para na vivo manipulação gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia (sem ventilação), os músculos peitorais maiores e menores foram dissecados sem rodeios, e o coração de rato foi rapidamente exposto pelo manual exteriorização através de uma pequena incisão no quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus, codificação do luciferase (Luc) e receptor de vitamina D (VDR) ou RNA de gancho de cabelo curto (shRNA) segmentação VDR, foi injetado com uma seringa Hamilton o miocárdio. Subsequentes na vivo imagem demonstrou que luciferase foi com êxito Blumental especificamente no coração. Além disso, a análise ocidental do borrão confirmou o sucesso superexpressão ou silenciamento de VDR, no coração do mouse. Uma vez dominado, esta técnica pode ser usada para manipulação genética, bem como a injeção de células ou outros materiais, tais como nanogels no coração do mouse.

Introdução

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Doença cardíaca é a principal causa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo1,2. A falta de estratégias terapêuticas eficazes para doenças cardíacas fatais e incluindo infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca atrai a exploração intensiva de pathomechanisms subjacentes e identificação de opções terapêuticas novela3. Para estas explorações científicas, manipulação genética cardíaco-específicas é amplamente utilizado4,5. Manipulação genética cardíaca pode ser conseguida editando genoma usando a nuclease efetoras como ativa....

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Protocolo

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Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com os institutos nacionais de saúde orientações sobre o uso de animais de laboratório e foram aprovadas pelo Comitê de ética Animal do Instituto. Camundongos C57BL/6J machos (8-10 semanas de idade) foram usados para todos os experimentos. Os ratos foram alojados em condições de livre de patógeno a 24 ° C ± 4 ° C, sob um ciclo claro/escuro de 12-h, com livre acesso à água e comida.

1. preparação da solução de adenovírus

  1. Após a chegada da solução purificada adenovírus, conservar a solução em um freezer-80 ° C.
    Nota: A injeção de adenovírus foi realizada em ratos viáveis....

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Resultados

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O protocolo do experimento e algumas das principais etapas para o método relatado são mostradas na Figura 1. Em 5 dias após a injeção Intramiocárdica de luciferase codificação de adenovírus (Adv-luc), na vivo por imagens em ratos injetado adv-luc indicado robusto superexpressão de luciferase especificamente no coração (Figura 2A, B), que foi confirmado por análise ocidental do borrão (

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Discussão

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O presente relatório demonstra uma técnica modificada para injeção Intramiocárdica de vetores virais para manipulação do gene cardíaca, que foi modificado de um método para indução do infarto do miocárdio por Gao et al 13 atualmente, na vivo caracterização das funções do gene específico geralmente envolvem a geração de nocaute ou ratos transgénicos3,14,15,16<.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelo fundo nacional de ciência para ilustres jovens estudiosos (81625002), Nacional Natural Science Foundation da China (81470389, 81270282, 81601238), programa de Shanghai acadêmica líder de pesquisa (18XD1402400), Shanghai Municipal Apoio educação Comissão Gaofeng medicina clínica Grant (20152209), centro de desenvolvimento do Hospital de Shenkang de Shanghai (16CR3034A), Universidade do Tong de Shanghai Jiao (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 e 14XJ10019), Programa de navegação de Shanghai (18YF1413000) e programa de pós-graduação inovação da faculdade de medicina de Bengbu (Byycx1722). Agradecemos ....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamentos
Capuz estéril de fluxo laminarFengshi Animal Experimental  Equipamento Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)FS-CJ-2F
CentrífugaThermo Scientific (Waltham, EUA)75005282
Máquina de moagem de tecidosScientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)Scientz-48
Esterilizador de alta temperatura/alta pressãoHirayama (Saitama, Japão)HVE-50
Vaporizador de isoflurano Matrix (Orchard Park, EUA)VIP3000
IVIS  Sistema de imagem Lumina IIIPerkinElmer (Waltham, EUA)CLS136334
Precisão  balanceSartorius (Gö ttingen, Alemanha)28091873
Instruments 
Eppendorf pipeta (100 µ L)Eppendorf (Westbury, EUA) 
Pipeta Eppendorf (10 µ L)Eppendorf (Westbury, EUA) 
FórcepsShanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. JD4020Seringa de ponta curva
HamiltonHamilton (Nevada, EUA)80501Volume 50 μ L
Hemostático micro-mosquitoF.S.T (Foster City, EUA)13011-12Curvo, largura da ponta 1.3mm
Porta-agulhas Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Xangai, China)J32110
Tesoura cirúrgicaFST (Foster City, EUA)14002-12
Seringa de 1 mLWeiGao Group Medical Polymer Co., Ltd. (Shangdong, China)
< forte > materiais e reagentes < / forte >
anticorpo anti-GAPDHCST (Danvers,   EUA)#2118
Anticorpo anti-luciferaseAbcam (Cambridge, Reino Unido)ab187340
Anti-coelho IgGCST (Danvers,  EUA) #7074
Anticorpo anti-VDRAbcam (Cambridge, Reino Unido)  ab109234
BuprenorfinaThermo Scientific (Waltham, EUA)PA175056
Hidras CloralicasLingFeng Chemical (ShangHai, China)
Frascos CriogénicosThermo Scientific (Waltham, EUA)3754181.8 mL 
Creme depilatórioVeet (Xangai, China)
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco Gibco (Grand Island,  EUA)14040133
EntoiodoLiKang (Xangai, China)310132
tubo EPSarstedt (Newton, EUA)PCR001
FiltroMillipore (Bedford, EUA)Tamanho do poro 0.2 µ m 
IsofluranoYipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)
LuciferinaPromega (Madison, EUA)P1041
Tampão de lise para western blotBeyotime (Xangai, China)P0013JSem inibidores
Creme oftálmicoApex Laboratories (Melbourne, Austrália))PBS
Gibco (Grand Island,  EUA)10010023
Coquetel de inibidor de proteaseThermo Scientific (Waltham, EUA)78438
5-0 sutura de sedaShanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Xangai, China)
Bola de açoScientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)Largura 1,5 mm
Agulha de seringaKindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)30 gauge 
Tapete quenteWarmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China)NF-GNCW
49200000594920000113

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fa....

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