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Artigo de método

Isolamento de células dendríticas do tracto reprodutivo feminino humano para estudos fenotípica e funcionais

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DOI:

10.3791/57100

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13 de março de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth

Neste artigo

Resumo

Descrevemos aqui um método para isolar e purificar as células dendríticas de diferentes compartimentos anatômicas no aparelho reprodutor feminino humano para a avaliação de suas características fenotípica e funcionais. Esse método pode ser adaptado para isolar outras células do sistema imunológico ou células dendríticas de outros tecidos da mucosa.

Resumo

A caracterização das humano as células dendríticas (DCs) residentes nos tecidos da mucosa é um desafio devido à dificuldade na obtenção de amostras e o baixo número de DCs presentes por tecido. Ainda, como o fenótipo e a função de DCs é modificado pelo ambiente de tecido, é necessário analisar as populações residentes de tecido DC, desde sangue derivado DCs incompleta refletem as complexidades de DCs em tecidos. Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar DCs de humano feminino trato reprodutivo (FRT) usando amostras de histerectomia que permite análise fenotípica e funcional. O protocolo é composto por digestão do tecido para gerar uma única célula misturado a suspensão de células, seguido pela seleção de grânulo magnética positiva. Nosso protocolo de digestão do tecido não cleave marcadores de superfície, que permite a análise fenotípica e funcional de DCs no estado estacionário, sem ativação de incubação ou celular durante a noite. Este protocolo pode ser adaptado para o isolamento de outros tipos de células imunes ou isolamento de DCs de outros tecidos.

Introdução

A FRT tem a dupla função de proteger contra patógenos, permitindo a implantação e gravidez1. Para realizar isto, a FRT é compartimentada, com cada região anatômica, mostrando características histológicas, imunológicas e funcional1.

DCs presentes em superfícies mucosas fazem contato com micróbios no pulmão, intestino e do trato genital e fornecer vigilância imune para potenciais patógenos2. DCs têm a capacidade única de prime ingênuo células T e desencadear respostas imunes adaptáveis3. DCs no FRT também são especializados para tolerar a antígenos estranhos, tais como aqueles encontrados no esperma e o desenvolvimento do feto, para permitir que a gravidez bem sucedida4. Portanto, dependendo da localização, o fenótipo de DC e a função será distintos. É conhecido que DCs são fortemente influenciados pelo ambiente de tecido, tal que o seu número, fenótipo e funções são modificadas pelo ambiente de tecido em que residem3. Portanto, para entender o papel que FRT DCs desempenham na gravidez, doenças infecciosas e câncer no FRT, DCs residentes precisam ser estudados, desde sangue derivada DC modelos são insuficientes para resolver as complexidades regulamentares encontradas em tecidos FRT.

A caracterização do tecido humano residentes DCs é um desafio devido ao baixo número de células presentes nos tecidos da mucosa e a dificuldade de obtenção de amostras de tecido humano. DCs têm sido estudadas no FRT usando immunohistochemistry5,6, que informa sobre a localização da célula dentro do tecido, mas se opõe a estudos funcionais e é limitado o número de identificação de marcadores de células que podem ser analisados ao mesmo tempo. Além disso, os protocolos de isolamento única célula para análise de fluxo cytometric foram desenvolvidos7,8,9. Alguns desses protocolos tirar proveito da capacidade migratória do DCs para isolar as células que migram. Esses métodos normalmente exigem a incubação do durante a noite e seleção de DCs ativados, mas não permitem o estudo da DCs no estado estacionário.

Aqui, usando amostras de histerectomia, nós aperfeiçoamos um protocolo para isolar DCs em locais anatômicos diferentes no FRT, o endométrio (EM), a endocérvice (CX) e a ectocérvice (ECX), que permite a análise fenotípica e funcional. Usando um protocolo não-proteolíticas digestão enzimática, podemos prosseguir imediatamente após a digestão do tecido celular isolamento e fluxo cytometric uma caracterização sem ativação de células. Utilizando citometria de fluxo multicolor e adaptação de estudos funcionais para baixo número de células, nós podemos identificar e caracterizar raros subconjuntos de DCs em diferentes locais do Frist

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Protocolo

Estudos envolvendo seres humanos foram conduzidos de acordo com os princípios expressados na declaração de Helsinque. Estudos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional Dartmouth College e o Comitê para a proteção de assuntos humanos (CPHS). Termo de consentimento informado foi obtido antes da cirurgia seronegativo mulheres passando por histerectomia no Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Líbano, NH). Patologistas treinados selecionadas amostras de tecido da EM, CX e ECX, livre de lesões patológicas e distante dos locais de patologia. Obtiveram-se amostras de sangue de doadores saudáveis voluntários recrutados no Dartmouth Hitchcock Medical Center. Doadores de sangue eram anônimos. Recentemente isolado ECX, CX e EM tecidos de centro cirúrgico foram transferidos para patologia para isolamento e classificação prévia transferir para o nosso laboratório em tubos de polipropileno separados, estéril.

1. enzimática digestão dos tecidos

Nota: Use material esterilizado e trabalhar em uma câmara de segurança biológica.

  1. Prepare um modificado do Hank equilibrado sal solução (HBSS) usando 1 x HBSS com vermelho de fenol, 100 U/mL penicilina-estreptomicina, 0,35 g/L NaHCO3e 20 mM HEPES.
  2. Prepare o coquetel enzimático (modificado desoxirribonuclease de 0,01% [wt/vol] HBSS, 450 U/mL colagenase IV, I e D-glicose de 2 mg/mL). Passe a solução através de um filtro de 0,22 µm estéril. Idealmente, preparar a enzima digestão no dia do uso, mas ele pode ser congelado a-20 ° C para armazenamento. Evite repetidos congelamentos e descongelamentos ciclos.
  3. Lave o tecido com modificados HBSS e coloque em um prato de Petri 100 x 15mm2 . Ajustar o tamanho da placa de Petri com base na quantidade de tecido disponível e a quantidade da enzima coquetel utilizada (ver passo 1.4.2 abaixo).
    Nota: Os tecidos variam em tamanho, dependendo do exemplo cirúrgico obtido a partir da patologia, variando de 1-10 g.
  4. Processamento físico com bisturi descartável e fórceps:
    1. Adicione cerca de 3 mL de enzima digestão cocktail ao tecido para impedir a secagem durante o corte.
    2. Use fórceps para estabilizar o tecido e picar com um bisturi para aumentar a área da superfície do tecido exposto para a coquetel de enzimas de digestão. Corte o tecido em pequenos pedaços (< 2 mm de um lado). Adicione o cocktail de enzima digestão suficientes para cobrir todos os pedaços de tecido (5 mL/g de tecido). Coloque a tampa na caixa de Petri.
    3. Incube a 37 ° C com 5% CO2 em rotacao em aproximadamente 80 rpm de 45 min. Certifique-se de que a velocidade do rotor mistura cuidadosamente o coquetel de enzimas de digestão sem derramar ou produzindo bolhas.
    4. Visualize a preparação do tecido com um microscópio invertido com o 4 X e 10 X de objectivos.
      Nota: Após a digestão, pequenos fragmentos de tecido e uma suspensão de células mistas incluindo glândulas epiteliais visíveis devem estar presentes (ver figura 1A).

2. física separação de células únicas

  1. Em um ambiente esterilizado, coloque uma malha tensionada 250 µm com suporte em uma placa de Petri 150 x 15 mm2 . Certifique-se de que a malha é de cerca de 0,5 cm acima da superfície da caixa de Petri.
  2. Molhar a malha com 2 mL de HBSS modificado e transferir o tecido digerido para a malha.
  3. Usando a superfície plana de um êmbolo de seringa de 10 mL, com delicadeza mas com firmeza, moa o tecido digerido picado através da malha.
    Cuidado: Moagem muito agressivamente irá danificar a rede e aumentar a mortalidade de célula. Esta etapa irá separar as células epiteliais e células do estroma (incluindo células do sistema imunológico) o tecido conjuntivo e muco.
  4. Uma vez que os fragmentos de tecido tem sido completamente dispersos, elevar a malha e o titular modificado de 2-3 cm acima da placa de Petri e enxágue com 3 mL de HBSS recuperar células adicionais.
  5. Recolha a suspensão de eritrócitos. Coloque a 20 µm de malha com suporte em uma placa de Petri e molhado com 2 mL de HBSS modificado. Despeje a suspensão de eritrócitos através da malha segurando a malha de 2-3 cm acima da placa de Petri e enxágue com 6 mL de HBSS modificado.
    Nota: Este passo irá separar as folhas epiteliais, que são retidas na parte superior, de células únicas que atravessam a malha. A passagem é uma suspensão de células mistas, que inclui as células imunes e fibroblastos do estroma.
  6. Recolher a suspensão de células mistas e centrifugar 500 x g por 10 min. Aspire o líquido e resuspenda o pellet em 4 mL de HBSS modificado para centrifugação gradiente de densidade.
  7. Camada a suspensão de células mistas mais 3 mL de solução de polysucrose e centrifugar a temperatura ambiente a 500 x g por 30 min com sem freio. Recolher a faixa branca do topo da solução polysucrose e lave com PBS.
    Nota: Esta fração é a suspensão de célula mista enriquecida, que é rico em células do sistema imunológico e contém alguns fibroblastos do estroma.

3. remoção de célula morto

Nota: Se uma grande percentagem de células mortas (> 20%) está presente na suspensão de célula mista enriquecido após centrifugação gradiente de densidade, remoção de células mortas com grânulos magnéticos é recomendada. Células mortas precisam ser removidos, pois eles podem interferir com o processo de seleção do grânulo magnética positiva.

  1. Conte as células usando um hemocytometer em um microscópio de luz com o objetivo de X 10. Spin para baixo de todas as células na suspensão de célula mista enriquecido (500 x g, 10 min, 4 ° C). Completamente, aspirar e desprezar o sobrenadante. Adicione 100 µ l de grânulos de remoção de células mortas por 10 x 17 total células (vivos e mortos), de acordo com as instruções do fabricante. Incube a temperatura ambiente por 15 min.
  2. Coloque um filtro de 30 µm na coluna magnética, aplicar a suspensão de células e permitem que as células grânulo-etiquetadas a cair através da coluna magnética.
  3. Lave a coluna com buffer de remoção de células mortas como recomendado (3 mL). Colete o escoamento contendo as células vivas. O intervalo de recuperação celular após a remoção de células mortas é apresentado na figura 1B.
    Nota: Estas células podem ser usadas para executar a citometria de fluxo, coloração para estudos fenotípica (secção 5) ou continuar com isolamento DC (secção 4).

4. DC purificação pela seleção positiva do grânulo magnético

  1. Após a remoção de células mortas (passo 3.2), girar as células para baixo, remover o sobrenadante e ressuspender as células no buffer de seleção magnética 80 µ l por 1 x 107 células (PBS, 0,5% inactivadas pelo calor AB soro humano (HS), 2 mM EDTA).
  2. Para a seleção positiva das populações de DC, adicione CD1a ou CD14 grânulos magnéticos de acordo com as instruções do fabricante (20 µ l magnético grânulos por 1 x 107 células). Incube por 15 min a 4° C.
  3. Lavar as células com o buffer de seleção magnética, spin para baixo e retire o tampão completamente. Ressuspender as células em um mínimo de 500 µ l de tampão de seleção magnética.
  4. Unir a coluna ao ímã e adicionar um filtro de 30 µm no topo da coluna para reter qualquer restantes aglomerados de células. Lave o filtro e a coluna com seleção magnética como recomendado.
  5. Aplica a suspensão de células para a coluna. Lavar 3 vezes com tampão de seleção magnética.
  6. Transfira a coluna para um tubo de 15 mL, adicionar 5 mL de tampão de seleção magnética e aplicar o êmbolo para liberar as células selecionadas da coluna.
  7. Para aumentar a pureza, repita etapas 4.4-4.6 com as células recuperadas usando uma nova coluna. O intervalo de recuperação celular após seleção magnética do grânulo é apresentado na Figura 1.

5. avaliação da pureza de célula: microscopia e citometria de fluxo

  1. Anticorpo que mancha para citometria de fluxo:
    1. Ressuspender a 1 x 106 células em 100 µ l de PBS contendo 20% inactivadas pelo calor HS para bloquear receptores de Fc e incubar durante 10 min no gelo.
    2. Adicionar o desejado fluorescente etiquetado anticorpos e o reagente para identificação de células mortas (por exemplo, consulte a seção 6.5). Conjunto de fluorescência menos um controles (FMO) para estabelecer os portões e usar contas de compensação para preparar a única mancha controles de compensação. Exemplos de anticorpos usados são descritos na tabela 1. Incube durante 20 min a 4 ° C, protegido da luz.
    3. Lave as células com 2 mL de tampão de seleção magnética.
      Nota: A presença de EDTA é importante para evitar a formação de célula de aglutinação para análise de fluxo cytometric. Spin para baixo e descartar o sobrenadante.
    4. Corrigi as células adicionando-se 100 µ l de solução de paraformaldeído 2% pelo tubo.
    5. Analise as amostras em por um citômetro de fluxo10,11.
  2. Girar a coluna (por exemplo, cytospin) e usar para analisar a morfologia de coloração de Giemsa:
    1. Ressuspender as células em 200 µ l de tampão de seleção magnética.
    2. Carregar em uma coluna de girar e girar por 5 min. Que o slide fique completamente seco.
    3. Corrigir o slide por imersão em metanol 100% por 2 min. Enxágue o slide com água desionizada e deixe-o ar seco.
    4. Realize uma coloração de Wright-Giemsa padrão. Cobrir as células com eosina e incubar durante 10 min, enxaguar com água desionizada e deixe secar. Cobrir as células com mancha Wrights-Geimsa, incubar por 1 min, enxaguar com água desionizada e secar ao ar.
    5. Examine os preparativos com um microscópio invertido (Figura 2A, objectivo de X 40).

6. alogênico estimulação ensaio para avaliar a função da célula de DC

  1. Descongelar as células mononucleares congelados de sangue periférico (PBMC)
    1. Aquecer o meio de cultura celular com 10% HS 37 ° c.
    2. Descongele os PBMCs colocando o criotubo num banho de água a 37 ° C, até que uma pequena quantidade de mídia congelados célula permanece no criotubo. Em um ambiente estéril, transferir o conteúdo do criotubo a 10 mL de meio de cultura celular previamente aquecido com 10% HS em um tubo de 15mL.
    3. Centrifugar a ~ 500 x g, durante 7 min. Remova a mídia, dispersar a pelota, resuspenda os PBMCs em 10 mL de meios de cultura celular com 10% HS e centrifugar as células.
    4. Repita a etapa de lavagem, uma terceira vez. Conte as células.
  2. Seleção de células T Naïve:
    1. Use um kit de seleção de célula de anticorpo magnético seleção negativa para isolar ingênuo células T de acordo com o protocolo do fabricante.
    2. Após o isolamento, verificar a pureza usando anticorpos CD45RA e CCR7.
      Nota: Pureza típica é > 99% ingênuo células T.
  3. Naïve T-proliferação tintura coloracao celular:
    1. Prepare-se 600 µ l da solução de 2 x de corante de proliferação celular, protegendo o corante de exposição à luz.
    2. Lave o ingênuo células T 2 x com PBS. Ressuspender as células em 500 µ l de PBS.
    3. Enquanto suavemente num Vortex as células no armário, a biossegurança adicionar 500 µ l de proliferação corante para o ingênuo células T.
    4. Incube as celulas por 10 min a 37° C.
    5. Parar a rotulagem de célula pela adição de 5 mL de meio de cultura celular com 10% HS às células. Incube no gelo por 5 min, protegido da luz.
    6. Centrifugar as células no ~ 500 x g, durante 7 min, aspirar a mídia e ressuspender as células em 4 ° C, de meios de cultura celular com 10% HS. Repita mais duas vezes para um total de 3 lavagens. Tome uma alíquota de células para contar antes a última centrifugação.
      Nota: Normalmente, ingênuo final números de células T variam entre 5% e 15% da contagem inicial PBMC células.
    7. Ressuspender as células com o meio de cultura celular com 10% HS na concentração celular desejado.
  4. DC-alogênico ingênuo células T co-cultura:
    1. O DCs isolado e ingênuo células T em uma placa de 96 poços, fundo redondo, a placa em um 01:15 proporção de DCs para células T. Garantir que o número ideal para DCs varia entre 3.000 e 5.000 células/poço.
    2. Centrifugue a placa no ~ 500 x g durante 3 minutos garantir que as células estão localizadas no centro do poço. Contato célula a célula é importante para a sinalização adequada para ocorrer.
    3. Incube a 37 ° C por 6 dias. Monitore o aglomerado de células, que aparecem em poços como proliferação ocorre, com microscopia (Figura 3A).
  5. Coloração para avaliar a proliferação de citometria de fluxo:
    1. Depois de 6 dias, as células podem ser examinadas por citometria de fluxo. Manche a co-cultura por citometria de fluxo.
    2. Prepare uma solução de 2 x de corante amarelo viabilidade (máximo de emissão 572 nm) em PBS.
      Nota: O uso de PBS sem soro é importante, como soro de proteínas interferem com o corante).
    3. Centrifugue a placa com células em ~ 500 x g durante 5 min.
    4. Remova 100 µ l do sobrenadante.
      Nota: neste momento coletar e armazenar o sobrenadante para análise separada dos fatores solúveis.
    5. Lavar as células duas vezes com PBS: Adicionar 150 µ l/poço de PBS, centrifugar a ~ 500 x g, durante 5 min, remover 150 µ l do sobrenadante com uma pipeta. Certifique-se de que não há 50 µ l do sobrenadante restantes em cada poço.
    6. Adicione 50 µ l de 2 x tintura de viabilidade para cada poço. Incube a temperatura ambiente por 10 min, protegido da luz.
    7. Durante a incubação, prepare uma mistura de mestre dos marcadores do anticorpo desejado. Por exemplo: CD3 APC/Cy7, PE de CD4, CD8 FITC, etc.
    8. Adicione a mistura de anticorpo para cada poço. Incube a temperatura ambiente por 10 min, protegido da luz.
    9. Lavar as células 2 x com PBS + 2% HS: Adicionar 150 µ l/poço de PBS + 2% HS. Centrifugar a ~ 500 x g durante 5 min. remover 150 µ l do sobrenadante com uma pipeta.
    10. Corrigi as células adicionando-se 100 µ l/poço de 2% pará-formaldeído. Se necessário: transferir as células e mídia para tubos de citometria de fluxo de polipropileno. Os tubos podem ser mantidos a 4 ° C e protegidos da luz, até a análise de fluxo cytometric.
    11. Tubos de leitura em um citômetro de fluxo.

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Resultados

Após digestão com tecido, o lançamento de folhas epiteliais e glândulas pode ser observado, como mostrado na figura 1A; Este é um controle positivo que indica que a digestão enzimática foi bem sucedida. O número de células viáveis totais e DCs recuperados por grama de tecido também é mostrado na figura 1B e Figura 1, respectivamente. As células imunes representam entre 5-30% das células do estroma an...

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Discussão

DCs da mucosa são uma população de células raras fortemente influenciada pelo ambiente de tecido, que muda seu fenótipo e a função, uma vez que eles entram os tecidos3. Enquanto o sangue derivado DCs são um modelo muito útil, totalmente não representam a diversidade de populações de DC, encontrado em tecidos. Portanto, para entender as características únicas do DCs da mucosa, o isolamento de células primárias de tecidos é necessário. Isolamento de DCs em locais anatômicos diferentes na FRT oferece...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar

Agradecimentos

Bolsas de estudo suportado pelo NIH, AI102838 e AI117739 (CRW). Agradecemos a Richard Rossoll para obter assistência técnica. Análise de fluxo cytometric foi realizado em DartLab, o recurso compartilhado no Dartmouthsupported por (P30CA023108-37) e (P30GM103415-15).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução salina balanceada de Hank (HBSS)HycloneSH30015.03
Penicilina-estreptomicinaHycloneSV30010
HEPES (1M)Hyclone15630-080
Colagenase IVSigmaC5138
Desoxirribonuclease IWorthington BioquímicaLS002140
D-glicoseFiltro Sigma Aldritch50-99-7
0.22 um Stericup 500 mL  PlacaMilliporeSCGPU05RE
100mm x 15mm Placa de Petri de poliestirenoFB0875712Fisherbrand
150mm x 15mmPlaca
150mm x 25mmCorning430599Placa
IncubadoraIsotemp Fisher ScientificFICO3500TABB5,0% CO2
American Rotator VAmerican DADER4140
250 μm malha de nylonSefar03-250/50
20 μm malha de náilonSefar03-20/14
Centrífuga Beckman GS-6RBeckman358702
X-VIVO 15 com gentamicina L-Gln, Vermelho de Fenol, 1 LLonza04-418Q
Human AB SerumValley BiomedicalHP1022
Histopaque-1077Sigma Aldritch10771
Solução Tampão de Fosfato (PBS)National DiagnosticsCL-253pH 7.4
Kit de Remoção de Células MortasMiltenyi Biotec130-090-101
Filtro de pré-separação (30um)Coluna Miltenyi Biotec130-041-407
LSMiltenyi Biotec130-042-410
Quadro MACS SeparadorMiltenyi Biotec130-090-976
MACS multi-suporteMiltenyi Biotec130-042-303
EDTAUSB15694
CD1a Microesferas, humanoMiltenyi Biotec130-051-001
Microesferas CD14, humanoMiltenyi Biotec130-050-201
eFluor 670 corante de proliferação celulareBiosciences65-0840-85
96 placa inferior redonda de 96 poçosFalcon9/8/2866
Corante de viabilidade amarelo zumbiBiolegend423104
CD3 APC / Cy7, anti-humanoTonbo Biosciences25-0038-T100
CD4 PE, anti-humanoeBiosciences12-0048-42
CD8a FITC, anti-humanoTonbo Biosciences35-0086-T100
Gallios Citômetro de FluxoBeckman Coulter Life SciencesB4361810 cores, VBR
MACSquant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-3438 cores, VBR
de poliestireno de poliestireno FB0875714 de cultura de células tratadas

Referências

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