Descrevemos aqui um método para isolar e purificar as células dendríticas de diferentes compartimentos anatômicas no aparelho reprodutor feminino humano para a avaliação de suas características fenotípica e funcionais. Esse método pode ser adaptado para isolar outras células do sistema imunológico ou células dendríticas de outros tecidos da mucosa.
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Artigo de método
Isolamento de células dendríticas do tracto reprodutivo feminino humano para estudos fenotípica e funcionais
Neste artigo
Resumo
Resumo
A caracterização das humano as células dendríticas (DCs) residentes nos tecidos da mucosa é um desafio devido à dificuldade na obtenção de amostras e o baixo número de DCs presentes por tecido. Ainda, como o fenótipo e a função de DCs é modificado pelo ambiente de tecido, é necessário analisar as populações residentes de tecido DC, desde sangue derivado DCs incompleta refletem as complexidades de DCs em tecidos. Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar DCs de humano feminino trato reprodutivo (FRT) usando amostras de histerectomia que permite análise fenotípica e funcional. O protocolo é composto por digestão do tecido para gerar uma única célula misturado a suspensão de células, seguido pela seleção de grânulo magnética positiva. Nosso protocolo de digestão do tecido não cleave marcadores de superfície, que permite a análise fenotípica e funcional de DCs no estado estacionário, sem ativação de incubação ou celular durante a noite. Este protocolo pode ser adaptado para o isolamento de outros tipos de células imunes ou isolamento de DCs de outros tecidos.
Introdução
A FRT tem a dupla função de proteger contra patógenos, permitindo a implantação e gravidez1. Para realizar isto, a FRT é compartimentada, com cada região anatômica, mostrando características histológicas, imunológicas e funcional1.
DCs presentes em superfícies mucosas fazem contato com micróbios no pulmão, intestino e do trato genital e fornecer vigilância imune para potenciais patógenos2. DCs têm a capacidade única de prime ingênuo células T e desencadear respostas imunes adaptáveis3. DCs no FRT também são especializados para tolerar a antígenos....
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Protocolo
Estudos envolvendo seres humanos foram conduzidos de acordo com os princípios expressados na declaração de Helsinque. Estudos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional Dartmouth College e o Comitê para a proteção de assuntos humanos (CPHS). Termo de consentimento informado foi obtido antes da cirurgia seronegativo mulheres passando por histerectomia no Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Líbano, NH). Patologistas treinados selecionadas amostras de tecido da EM, CX e ECX, livre de lesões patológicas e distante dos locais de patologia. Obtiveram-se amostras de sangue de doadores saudáveis voluntários recrutados no Dartmouth Hitchcock Medical Center. Doadore....
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Resultados
Após digestão com tecido, o lançamento de folhas epiteliais e glândulas pode ser observado, como mostrado na figura 1A; Este é um controle positivo que indica que a digestão enzimática foi bem sucedida. O número de células viáveis totais e DCs recuperados por grama de tecido também é mostrado na figura 1B e Figura 1, respectivamente. As células imunes representam entre 5-30% das células do estroma an.......
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Discussão
DCs da mucosa são uma população de células raras fortemente influenciada pelo ambiente de tecido, que muda seu fenótipo e a função, uma vez que eles entram os tecidos3. Enquanto o sangue derivado DCs são um modelo muito útil, totalmente não representam a diversidade de populações de DC, encontrado em tecidos. Portanto, para entender as características únicas do DCs da mucosa, o isolamento de células primárias de tecidos é necessário. Isolamento de DCs em locais anatômicos diferentes na FRT oferece.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar
Agradecimentos
Bolsas de estudo suportado pelo NIH, AI102838 e AI117739 (CRW). Agradecemos a Richard Rossoll para obter assistência técnica. Análise de fluxo cytometric foi realizado em DartLab, o recurso compartilhado no Dartmouthsupported por (P30CA023108-37) e (P30GM103415-15).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução salina balanceada de Hank (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicilina-estreptomicina | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Colagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Desoxirribonuclease I | Worthington Bioquímica | LS002140 | |
| D-glicose | Filtro Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL Placa | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm Placa de Petri de poliestireno | FB0875712 | Fisherbrand | |
| 150mm x 15mm | Placa | ||
| 150mm x 25mm | Corning | 430599 | Placa |
| Incubadora | Isotemp Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5,0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 μm malha de nylon | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 μm malha de náilon | Sefar | 03-20/14 | |
| Centrífuga Beckman GS-6R | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 com gentamicina L-Gln, Vermelho de Fenol, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Solução Tampão de Fosfato (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Kit de Remoção de Células Mortas | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Filtro de pré-separação (30um) | Coluna Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separador | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-suporte | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microesferas, humano | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| Microesferas CD14, humano | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 corante de proliferação celular | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 placa inferior redonda de 96 poços | Falcon | 9/8/2866 | |
| Corante de viabilidade amarelo zumbi | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC / Cy7, anti-humano | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-humano | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-humano | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Citômetro de Fluxo | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 cores, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 cores, VBR |
Referências
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245....
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Reimpressões e permissões
