Artigo de método

Dissecando a proteínas multi sinalização complexos pela purificação da afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP)

DOI:

10.3791/57109

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15 de junho de 2018

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1The Kinghorn Cancer Centre, Garvan Institute of Medical Research, 2Ubiquitin Signaling Group, Protein Signaling Program, The Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 3RCSI Molecular Medicine, Royal College of Surgeons in Ireland, 4Department of Epigenetics, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics, 5School of Medical Sciences, University of New South Wales, 6St Vincent's Hospital Clinical School, University of New South Wales, 7School of Medicine and Medical Science, University College Dublin

Neste artigo

Resumo

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Este manuscrito descreve o protocolo para a purificação de afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP). Este novo método facilita o isolamento específico e caracterização proteômica a jusante de algum duas proteínas interagindo, enquanto excluir un-complexado proteínas individuais, bem como os complexos formados com concorrentes parceiros de ligação.

Resumo

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A montagem de complexos de proteínas é um mecanismo central subjacente a regulação da célula muitas vias de sinalização. Um grande foco de investigação biomédica é decifrar como estes complexos de proteína dinâmica agem para integrar sinais de várias fontes a fim de direcionar uma resposta biológica específica, e como isto se torna desregulamentado em muitas configurações de doença. Apesar da importância deste mecanismo bioquímico chave, há uma falta de técnicas experimentais que podem facilitar a deconvolução destes complexos de sinalização multi molecular específica e sensível.

Aqui esta lacuna é abordada através da combinação de um ensaio de complementação da proteína com um nanobody de conformação específica, que nós temos denominado Bimolecular complementação de purificação da afinidade (BiCAP). Esta nova técnica facilita o isolamento específico e caracterização proteômica a jusante de qualquer par de interação de proteínas, com exclusão das proteínas individuais das Nações Unidas-complexado e complexos formados com concorrentes parceiros de ligação.

A técnica de BiCAP é adaptável a uma ampla gama de ensaios experimentais a jusante, e o alto grau de especificidade, proporcionada por esta técnica permite mais matizadas investigações sobre a mecânica da montagem complexa de proteína do que é actualmente possível usando técnicas de purificação de afinidade padrão.

Introdução

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Montagem complexa de proteínas é um processo chave na manutenção da especificidade spatiotemporal de muitas vias sinalização1,2. Enquanto a natureza crítica desse papel regulador é amplamente reconhecida, há uma falta de técnicas experimentais disponíveis para escrutinar esses complexos. A maioria dos estudos interactomics focar nas interações com proteínas individuais, ou o enriquecimento sequencial de componentes complexos individuais. Aqui apresentamos uma técnica para o isolamento de um dímero de proteínas específicas, enquanto excluir as partes individuais de proteínas componente os complexos formados com vinculação parceiros3a competir. Chamamos esta técnica Bimolecular complementação de purificação da afinidade (BiCAP), que é uma combinação de um previamente existentes ensaio de complementação fragmento da proteína, complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC), com o novo uso de um nanobody recombinante de conformação específica para as boas práticas agrícolas e seus derivados (ver tabela de materiais).

Um ensaio de complementação do proteína-fragmento típica baseia-se na expressão de proteínas de "isca" e "presas" fundidos para separar fragmentos de repórteres como luciferase4, β-galactosidase5ou proteína verde fluorescente (GFP)6 ( Figura 1A). Através da interação das proteínas presas e isca, os domínios de repórter de divisão são encorajados a redobrar-se em uma estrutura funcional, permitindo a interação da isca e atacam proteínas para ser visualizado ou quantificada. BiCAP foi adaptado de uma versão dessa técnica que fez uso de fragmentos da variante GFP Venus. Ensaios de complementação de proteínas fluorescentes são um método popular para poder visualizar as interações da proteína-proteína em uma célula viva, mas até agora têm sido limitados a esta um função7. BiCAP representa um avanço significativo a este respeito, como esta técnica não só permite a visualização, mas também o isolamento e interrogatório da interação da proteína-proteína resultante.

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Figura 1: O estrutural principal por trás da técnica BiCAP. (A) um esquema descrevendo o diretor por trás mostrando de complementação de fluorescência bimolecular as proteínas 'isca' e 'presas' marcado com o N-terminal V1 ou V2 C-terminal fragmentos da proteína completo Venus. (B) análise estrutural da interface de interação (ciano) entre o GFP nanobody (verde) e recombinada Vênus, mostrando a posição do (cinza) V1 e V2 (laranja) fragmentos (PDB 3OGO de adesão). Esta figura é republicado fromCroucher et al3 reproduzido com permissão da AAAS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O BiCAP técnica faz uso de dois fragmentos de não-fluorescente de Vênus (chamado V1 e V2) que associam com baixo grau de afinidade, a menos que uma interação ocorre entre seus parceiros de fusão. Neste caso, os divisão de dois domínios redobrar na estrutura funcional do β-tambor do fluoróforo (figura 1B)6. A inovação chave de BiCAP vem desde a introdução do nanobody recombinante de GFP, que reconhece um epítopo tridimensional sobre o β-barril de GFP (e variantes como Venus), que só está presente no fluoróforo corretamente recombinado e dobrado ( Figura 1B)8. Crucialmente, a GFP nanobody não liga para qualquer um dos fragmentos individuais Venus. Isso facilita o isolamento de dímeros de proteína somente depois que as duas proteínas formaram um complexo de vontade própria, levando a resultados mais representativos do que as adquiridas de métodos que fazem usam de interações quimicamente induzida, forçada9.

BiCAP é uma técnica poderosa que incide especificamente sobre proteínas multi complexos, que potencialmente podem ser combinados com um número de aplicações a jusante para melhorar a granularidade da nossa compreensão do papel que destes complexos jogar na transdução de sinal . Também abrange a característica importante de permitir a visualização de proteína interações in situ. Até à data, foi demonstrado como um método eficaz de analisar a interactome de receptores tirosina quinase (RTK) dímeros3BiCAP, mas a capacidade de adaptação desse método significa que pode ser adotado em quase qualquer contexto de interação de proteínas.

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Protocolo

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1. plasmídeo de clonagem

Nota: Para gerar vetores do plasmídeo com as tags V1 ou V2 fundidas à extremidade N-terminal ou do C-terminal do gene de interesse, BiFC vetores de destino tenham sido depositados com Addgene [marca N-terminal: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-terminal marca: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. O gene/s de interesse será necessário em específica recombinação clonagem vetores de entrada compatível (ou seja, pDONR223 ou pENTR221), sem códons de parada, para prosseguir com a clonagem. Muitos clones compatíveis já estão disponíveis em várias coleções de plasmídeo, incluindo a coleção de genoma de mamíferos (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/).

  1. Realize uma reação de recombinação para inserir o gene de interesse entre os sites attR do vetor de destino apropriado do BiFC:
    1. Em um tubo de 0,2 mL, adicione o vetor de entrada 150 ng, 150 ng BiFC destino vetor e buffer de TE 8 µ l (pH 8.0).
    2. Adicione 2 µ l recombinase enzima mistura (ver Tabela de materiais). Misture bem e centrifugue brevemente.
    3. Incube a reação por 1h à temperatura ambiente ou a 16 ° C durante a noite.
    4. Pare a reação adicionando 1 solução de Proteinase K µ l e incubar a 37 ° C por 10 min.
  2. Transforme o calor-choque-competente células (ver Tabela de materiais) com o produto de reação de LR:
    Nota: Toda a tensão básica pode ser plausivelmente neste ponto, desde que não contenha a antitoxina Ccdb, que impediria a seleção específica de plasmídeos contendo a inserção.
    1. Descongelar as células competentes no gelo e transferir 50 µ l de células para um tubo de polipropileno redondo de 14 mL.
    2. Adicionar 1 µ l de produto de reação para as células e misture suavemente. Incube durante 20 min no gelo.
    3. Aqueça o choque no banho de água a 42 ° C por 45 s. retorno imediato de gelo por 2 min.
    4. Adicionar 1 mL de LB mídia e incubar agitando a 37 ° C por 1h.
    5. Placa a transformação em uma placa de ágar de 10cm contendo ampicilina (100 µ g/mL) e incubar a 37 ° C durante a noite.
  3. Purificação de plasmídeo BiFC.
    1. Para purificar o plasmídeo de uma colônia individual, adicionar 100 mL de LB mídia para um grande balão de Erlenmeyer e adicionar ampicilina (100 µ g/mL). Para várias colônias da tela, adicionar 5 mL de LB mídia para tubos de polipropileno redondo 14 mL e adicionar ampicilina (100 µ g/mL).
    2. Utilizando uma ansa de inoculação estéril, escolha uma única colônia da placa de ágar. Coloque o laço do inoculation na mídia LB e misture brevemente.
    3. Cubra a parte superior do balão cónico com folha de alumínio e incubar durante uma noite a 37 ° C, com agitação.
    4. Produzir a transfeccao classe Plasmídeo usando um padrão maxiprep ou midiprep plasmídeo purificação kit (ver Tabela de materiais)10. Avalie a qualidade do DNA por espectros de absorvância.
      Nota: O DNA deve ter uma relação A260/A280 > 1.8 e um rácio de A260/A230 > 2.0. Neste ponto, recomenda-se várias colônias individuais para verificar a expressão eficiente da inserção e da marca da tela.

2. cultura e transfecção de células

Nota: Para transfeccao dos vetores BiFC é importante alcançar uma eficiência elevada e a transfeccao relativamente homogêneo. Os vetores provavelmente será compatíveis com qualquer reagente de transfeccao padrão, e as condições de transfeccao devem ser otimizadas em conformidade. Para realizar a espectrometria de massa, nós geralmente cultura células dentro de pratos de 10 cm, embora isto pode também ser proporcionalmente reduzido para pequenos pratos ou travessas para experimentos que exigem menos material.

  1. Semente de 1,0 × 106 HEK293T células em um de 10 cm do prato com 10 mL de mídia DMEM, suplementada com 10% FBS e penicilina/estreptomicina (1: 100).
  2. Diluir 2,5 µ g de cada vetor de BiFC em 500 µ l de tampão de transfeccao (ver Tabela de materiais) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
  3. Adicionar 10 µ l de reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais).
  4. Mistura de vórtice para 10 s, em seguida, brevemente centrífuga. Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  5. Adicione a mistura de Transfeccao de DNA para a placa, gota a gota. Incube as células para um comprimento suficiente de tempo para as proteínas de fusão BiFC interagir e para Venus de dobramento e fluoróforo maturação, geralmente ~ 8-24h.
    Nota: A excitação de pico para Vênus é 515 nm e sua emissão de pico é de 528 nm, embora isto é facilmente visualizado usando um microscópio fluorescente padrão configurado para visualizar a fluorescência de GFP.

3. preparação da amostra

  1. Colheita lysates
    1. Antes da coleta de lisado, preparar o tampão de lise celular [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 1 mM EDTA, detergente não-iônico de 1% (v/v) (ver Tabela de materiais)]. Loja a 4 ° C.
    2. Imediatamente antes da colheita, suplemento de 10 mL de tampão de lise celular com inibidor de protease e o inibidor da fosfatase (ver Tabela de materiais). Mantenha o tampão de lise celular complementado no gelo.
    3. Lave as células duas vezes em PBS gelado. Aspirar a PBS e adicione 1 mL de gelado complementado lise celular. Coloque o prato no gelo, garantindo que o buffer está espalhado por toda a área de superfície.
    4. Incubar no gelo por cerca de 5 min, em seguida, use um raspador de célula (consulte a Tabela de materiais) para raspar as células e transfira para um tubo de microcentrifugadora pre-refrigerados 1,5 mL.
    5. Remover restos celulares por centrifugação a coletados lisado em 18.000 × g por 5 min a 4 ° C e transferência desmarcada sobrenadante para tubos microcentrifuga fresco.
      Nota: neste momento o lisado pode ser utilizado imediatamente ou armazenado a-80 ° C. Também é aconselhável manter uma alíquota do crude lisado para que a eficiência da transfecção e a purificação da afinidade pode ser validada.
  2. Purificação da afinidade
    Nota: A etapa de isolamento BiCAP é executada usando o nanobody GFP conjugada com grânulos de agarose (veja a Tabela de materiais).
    1. Prepare os grânulos de agarose lavando um volume adequado (20 µ l por amostra) + 10 µ l em excesso em 1 mL de PBS. Centrifugue os grânulos a 300 x g e remover o sobrenadante.
    2. Adicione 20 µ l de cada amostra lisada.
    3. Incube as amostras por 2 h a 4 ° C, com rotação de fim-de-final.
      Nota: neste ponto as amostras podem ser preparadas para SDS-PAGE e mancha ocidental ou análise por espectrometria de massa.
  3. Preparação de eluente BiCAP para a mancha ocidental.
    1. Centrifugue os grânulos em 300 x g e lavar três vezes em tampão de lise celular.
    2. Resuspenda as contas lavadas em 50 µ l de tampão de amostra diluída adequadamente (ver Tabela de materiais) e aquecer as amostras a 95 ° C por 2-3 min.
      Nota: Amostras preparadas desta forma podem ser armazenadas a-20 ° C, durante vários meses.
    3. Execute SDS-PAGE e mancha11 para a marca de V1 e V2 etiquetas (ver tabela de materiais), como bem como qualquer outras proteínas de interesse ocidental.
  4. Preparação de eluente BiCAP por espectrometria de massa.
    Nota: Para análise por espectrometria de massa (LFQ) livre de rótulo quantitativa é aconselhável preparar as amostras pelo menos quadruplicado para garantir potência estatística robusta.
    1. Centrifugue os grânulos em 300 x g e lavagem seis vezes em tampão de lise celular sem detergente. Isto é necessário para remover a proteína em excesso e também o detergente que interferirão com análise de espectrometria de massa. Imediatamente para a próxima etapa, ou armazenar os grânulos a-80 ° C.
    2. Trypsinize grânulos em 60 µ l tampão 1 [ureia 2 M, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 tripsina µ g/mL]. Permitir que os grânulos de digerir por 30 min a 27 ° C em uma thermomixer de tremer a 800 RPM.
    3. Brevemente centrifugar grânulos e, em seguida, recolher o sobrenadante e transferência para microcentrifuga tubos (ver Tabela de materiais).
    4. Lave os grânulos em 25 µ l tampão 2 [ureia de 2 M, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM ditiotreitol], a fim de reduzir as limite de proteínas.
    5. Juntar os grânulos e sobrenadante um microcentrifuga tubo. Permitir que a digestão ocorra durante a noite em temperatura ambiente.
    6. Alkylate as amostras, adicionando 20 µ l de iodoacetamide (5 mg/mL em água ultrapura) para cada amostra e incubar no escuro por 30 min.
    7. Iniba a digestão tratando cada amostra com 1 ácido µ l de trifluoroacético (TFA). Esta etapa também irá acidificar as amostras em preparação para a fase de tombamento.
    8. Fase de construção C18 dicas por empilhamento 6 camadas de extração de fase sólida de 1 mm C18 (octadecil) discos de membrana (ver Tabela de materiais) em uma ponta de micropipeta de 200 µ l. Prepare uma dica simples para cada amostra.
    9. Molhe as pontas do palco com metanol e equilibrar com 50 µ l 0,1% (v/v) ácido trifluoroacético (TFA), 80% (v/v) de acetonitrilo.
    10. Lave as pontas com 50 µ l 0,1% (v/v) TFA.
    11. Carregar os peptídeos acidificados para as pontas do palco e eluir em seguida usando a 0,1% (v/v) TFA, 80% (v/v) de acetonitrilo em duas etapas.
    12. Evapore as amostras usando um concentrador a vácuo.
    13. Se necessário, armazenar peptídeos secados a-80 ° C.

4. espectrometria.

  1. Resuspenda as amostras em 15 µ l de ácido fórmico a 5%, 2% acetonitrila (em água ultrapura).
  2. Cuidadosamente, carregar 6 µ l em um prato de LC e o lugar em um sistema HPLC nanoLC (ver Tabela de materiais).
  3. Embale um 20 cm, a coluna de diâmetro interno de 75 µM com 1,9 µm C18 partículas da fase estacionária (ver Tabela de materiais). Carrega 5 peptídeo µ l em cada coluna.
  4. Eluir peptides usando um gradiente linear de acetonitrilo em nL/min 250 mais de 140 min e introduzir um espectrômetro de massa Linear armadilha Quadropole (LTQ) híbrido acoplado ao sistema HPLC nanoLC por nanoelectrospray.
  5. Colete dados de MS em tandem de íons mais abundantes de top 10 por exame ao longo de um gradiente de 140 minutos de tempo. Randomize a ordem de coleta de dados e intercâmbio com BSA executar entre cada amostra para minimizar o viés temporal.

5. análise

  1. Processar os dados brutos do MS usando a configuração padrão dentro MaxQuant versão do software 1.2.7.4 e analisar MaxQuant saída usando uma versão modificada do fluxo de trabalho de análise estatística Perseu no software R ambiente3.
    Nota: O fluxo de trabalho de análise estatística deste ponto está resumido na Figura 2. Brevemente, intensidades LFQ de proteínas identificadas usando MaxQuant são transformadas e filtradas seguidas de normalização e imputação. Proteínas de interação de pares de dímero são identificadas por comparação com um controle de Venus, excluir ligantes de fundo inespecífica, com teste t de Student e Benjamini-Hochberg correção para comparações múltiplas. Qualidade dos dados é confirmada por comparações de histogramas individuais e regressão múltipla hierárquica de clustering.

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Figura 2: esquema de fluxo de trabalho a análise estatística. Diagrama de fluxo do gasoduto de análise estatística usado para analisar as intensidades LFQ de proteínas identificadas a partir de dados de espectrometria de massa crua processados usando MaxQuant. Caixas de verde: filtragem, caixas azuis: marrons, transformação/normalização/dimensionamento de caixas: caixas de dados de controle de qualidade, amarelo: caixas de análise, cinza semiexclusão / comparativa: análise estatística. Esta figura é republicado fromCroucher et al3 reproduzido com permissão da AAAS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

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Após o uso de recombinação clonagem para gerar de V1 e V2 tagged genes de interesse com o plasmídeo de pDEST BiFC, co transfeccao de dois plasmídeos, que contém um par de proteínas interagindo resultará na geração de um sinal fluorescente Venus após cerca de 8 a 24 horas. Na ausência de um sinal positivo, é possível que a interação da proteína pode não ocorrer devido à escolha da linha celular, uma eficiência de transfeccao baixa ou que a orientação das marcas BiFC não é o ideal. Solução ...

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Discussão

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BiCAP é um poderoso método para isolar dímeros de proteína específica excluindo os componentes individuais e seus concorrentes de parceiros de ligação3. BiCAP baseia-se na adaptação de um ensaio de complementação da fluorescência da proteína chamada BiFC6. Os métodos existentes, incluindo ensaios de ligadura BiFC e proximidade, têm sido amplamente utilizados para visualizar e quantificar as interações da proteína em células vivas7, mas não forneceu u...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar

Agradecimentos

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D.R.C é um companheiro de NSW do Instituto de câncer e D.N.S anteriormente foi um companheiro de NSW do Instituto de câncer. Os findings da pesquisa apresentados neste manuscrito foram financiados pelo câncer Instituto NSW (13/FRL/1-02 e 09/CDF/2-39), NHMRC (projeto Grant GNT1052963), Science Foundation Ireland (11/GRIC/B2157), NSW escritório de ciência e pesquisa médica, a família de comentários Comunhão e família Mostyn Foundation. J.F.H. e R.S. foram os destinatários de um prêmio de pós-graduação australiana.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
LR Clonase II Plus enzimaThermo Fisher Scientific12538120Recombinase enzima necessária para clonagem Gateway (Etapa 1) em vetores de destino pDEST BiFC
Proteinase K, recombinante, grau PCRThermo Fisher ScientificEO0491
Tubo de polipropileno de fundo redondo de 14 mLCorning352059
AmpicilinaRoche Diagnostics Austrália10835242001Solução de estoque preparada a 100 μ g/mL em água destilada.
Kit MiniprepPromega CorporationA1330
Kit MaxiprepLife Technologies AustraliaK2100-07
DMEMGibco11995-073
FBSLife Technologies Australia10099-141
Penicilina/EstreptomicinaLife Technologies Australia15070-063
tampão de transfecção jetPRIMEReagente de114-15
jetPRIMEPolyplus114-15
PhosSTOP (inibidor de fosfatase)Sigma-Aldrich4906837001
cOmplete, Mini, EDTA-free Coquetel de inibidor de proteaseRaspadorde células Roche 11873580001
Sarstedt83.1832
GFP-Trap_ANanocorpo Chromotek Gmbhgta-100GFP acoplado a grânulos de agarose
N-terminal GFP monoclonal anticorpo CovanceMMS-118PDetectará a etiqueta V1 dentro dos vetores BiFC
Anticorpo monoclonal GFP C-terminalRoche11814460001Detectará a etiqueta V2 dentro dos vetores BiFC
Tampão de amostraInvitrogenNP0008Suplementado com 1 mL de β-mercaptoetanol.
Tripsina modificada de grau sequencialPromega CorporationV5117h
Tubos de microcentrífuga LoBindDiagnóstico Point of Care0030 108 116
IodoacetamidaSigma-AldrichI1149-5GPreparado a 5 mg/mL em água ultrapura
Ácido trifluoroacético - Grau SequanalThermoFisher 10628494
Discos C18 de extração em fase sólida 3M Empore (octadecil) - 4,7 cmThermo Fisher14-386-2Para preparar pontas de palco, corte discos de 1 mm usando um furador de tamanho apropriado. Como alternativa, dicas de estágio pré-preparadas também podem ser adquiridas, veja abaixo.
C18 Pontas de Palco, 10 µ L camaThermo Fisher87782
Ácido fórmico OPTIMA para LC/MS grau 50mLThermo FisherFSBA117-50
1.9 μ m Partículas C18 ReproSilDr. Maisch GmbHr119.aq.Partículas de fase estacionária
Acetonitrila OPTIMA LC/MS grau Thermo FisherFSBA955-4
Easy-nLC HPLC Thermo Fisher
LTQ Orbitrap Velos ProThermo Fisher
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Detergente não iônico (100%)
DH5α célulasThermo FisherCélulas competentes para choque térmico
transfecção Polyplus

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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