Artigo de método

Dissecando a proteínas multi sinalização complexos pela purificação da afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP)

DOI:

10.3791/57109

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15 de junho de 2018

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1The Kinghorn Cancer Centre, Garvan Institute of Medical Research, 2Ubiquitin Signaling Group, Protein Signaling Program, The Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 3RCSI Molecular Medicine, Royal College of Surgeons in Ireland, 4Department of Epigenetics, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics, 5School of Medical Sciences, University of New South Wales, 6St Vincent's Hospital Clinical School, University of New South Wales, 7School of Medicine and Medical Science, University College Dublin

Neste artigo

Resumo

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Este manuscrito descreve o protocolo para a purificação de afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP). Este novo método facilita o isolamento específico e caracterização proteômica a jusante de algum duas proteínas interagindo, enquanto excluir un-complexado proteínas individuais, bem como os complexos formados com concorrentes parceiros de ligação.

Resumo

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A montagem de complexos de proteínas é um mecanismo central subjacente a regulação da célula muitas vias de sinalização. Um grande foco de investigação biomédica é decifrar como estes complexos de proteína dinâmica agem para integrar sinais de várias fontes a fim de direcionar uma resposta biológica específica, e como isto se torna desregulamentado em muitas configurações de doença. Apesar da importância deste mecanismo bioquímico chave, há uma falta de técnicas experimentais que podem facilitar a deconvolução destes complexos de sinalização multi molecular específica e sensível.

Aqui esta lacuna é abordada através da combinação de um ensaio de complementação da proteína com um nanobody de conformação específica, que nós temos denominado Bimolecular complementação de purificação da afinidade (BiCAP). Esta nova técnica facilita o isolamento específico e caracterização proteômica a jusante de qualquer par de interação de proteínas, com exclusão das proteínas individuais das Nações Unidas-complexado e complexos formados com concorrentes parceiros de ligação.

A técnica de BiCAP é adaptável a uma ampla gama de ensaios experimentais a jusante, e o alto grau de especificidade, proporcionada por esta técnica permite mais matizadas investigações sobre a mecânica da montagem complexa de proteína do que é actualmente possível usando técnicas de purificação de afinidade padrão.

Introdução

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Montagem complexa de proteínas é um processo chave na manutenção da especificidade spatiotemporal de muitas vias sinalização1,2. Enquanto a natureza crítica desse papel regulador é amplamente reconhecida, há uma falta de técnicas experimentais disponíveis para escrutinar esses complexos. A maioria dos estudos interactomics focar nas interações com proteínas individuais, ou o enriquecimento sequencial de componentes complexos individuais. Aqui apresentamos uma técnica para o isolamento de um dímero de proteínas específicas, enquanto excluir as partes individuais de proteínas componente os complexos formados com....

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Protocolo

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1. plasmídeo de clonagem

Nota: Para gerar vetores do plasmídeo com as tags V1 ou V2 fundidas à extremidade N-terminal ou do C-terminal do gene de interesse, BiFC vetores de destino tenham sido depositados com Addgene [marca N-terminal: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-terminal marca: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. O gene/s de interesse será necessário em específica recombinação clonagem vetores de entrada compatível (ou seja, pDONR223 ou pENTR221), sem códons de parada, para prosseguir com a clonagem. Muitos clones compatíveis já estão disponíveis em várias coleções de plasmídeo, incluindo a coleção de ....

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Resultados

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Após o uso de recombinação clonagem para gerar de V1 e V2 tagged genes de interesse com o plasmídeo de pDEST BiFC, co transfeccao de dois plasmídeos, que contém um par de proteínas interagindo resultará na geração de um sinal fluorescente Venus após cerca de 8 a 24 horas. Na ausência de um sinal positivo, é possível que a interação da proteína pode não ocorrer devido à escolha da linha celular, uma eficiência de transfeccao baixa ou que a orientação das marcas BiFC não é o ideal. Solução .......

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Discussão

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BiCAP é um poderoso método para isolar dímeros de proteína específica excluindo os componentes individuais e seus concorrentes de parceiros de ligação3. BiCAP baseia-se na adaptação de um ensaio de complementação da fluorescência da proteína chamada BiFC6. Os métodos existentes, incluindo ensaios de ligadura BiFC e proximidade, têm sido amplamente utilizados para visualizar e quantificar as interações da proteína em células vivas7, mas não forneceu u.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar

Agradecimentos

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D.R.C é um companheiro de NSW do Instituto de câncer e D.N.S anteriormente foi um companheiro de NSW do Instituto de câncer. Os findings da pesquisa apresentados neste manuscrito foram financiados pelo câncer Instituto NSW (13/FRL/1-02 e 09/CDF/2-39), NHMRC (projeto Grant GNT1052963), Science Foundation Ireland (11/GRIC/B2157), NSW escritório de ciência e pesquisa médica, a família de comentários Comunhão e família Mostyn Foundation. J.F.H. e R.S. foram os destinatários de um prêmio de pós-graduação australiana.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
LR Clonase II Plus enzimaThermo Fisher Scientific12538120Recombinase enzima necessária para clonagem Gateway (Etapa 1) em vetores de destino pDEST BiFC
Proteinase K, recombinante, grau PCRThermo Fisher ScientificEO0491
Tubo de polipropileno de fundo redondo de 14 mLCorning352059
AmpicilinaRoche Diagnostics Austrália10835242001Solução de estoque preparada a 100 μ g/mL em água destilada.
Kit MiniprepPromega CorporationA1330
Kit MaxiprepLife Technologies AustraliaK2100-07
DMEMGibco11995-073
FBSLife Technologies Australia10099-141
Penicilina/EstreptomicinaLife Technologies Australia15070-063
tampão de transfecção jetPRIMEReagente de114-15
jetPRIMEPolyplus114-15
PhosSTOP (inibidor de fosfatase)Sigma-Aldrich4906837001
cOmplete, Mini, EDTA-free Coquetel de inibidor de proteaseRaspadorde células Roche 11873580001
Sarstedt83.1832
GFP-Trap_ANanocorpo Chromotek Gmbhgta-100GFP acoplado a grânulos de agarose
N-terminal GFP monoclonal anticorpo CovanceMMS-118PDetectará a etiqueta V1 dentro dos vetores BiFC
Anticorpo monoclonal GFP C-terminalRoche11814460001Detectará a etiqueta V2 dentro dos vetores BiFC
Tampão de amostraInvitrogenNP0008Suplementado com 1 mL de β-mercaptoetanol.
Tripsina modificada de grau sequencialPromega CorporationV5117h
Tubos de microcentrífuga LoBindDiagnóstico Point of Care0030 108 116
IodoacetamidaSigma-AldrichI1149-5GPreparado a 5 mg/mL em água ultrapura
Ácido trifluoroacético - Grau SequanalThermoFisher 10628494
Discos C18 de extração em fase sólida 3M Empore (octadecil) - 4,7 cmThermo Fisher14-386-2Para preparar pontas de palco, corte discos de 1 mm usando um furador de tamanho apropriado. Como alternativa, dicas de estágio pré-preparadas também podem ser adquiridas, veja abaixo.
C18 Pontas de Palco, 10 µ L camaThermo Fisher87782
Ácido fórmico OPTIMA para LC/MS grau 50mLThermo FisherFSBA117-50
1.9 μ m Partículas C18 ReproSilDr. Maisch GmbHr119.aq.Partículas de fase estacionária
Acetonitrila OPTIMA LC/MS grau Thermo FisherFSBA955-4
Easy-nLC HPLC Thermo Fisher
LTQ Orbitrap Velos ProThermo Fisher
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Detergente não iônico (100%)
DH5α célulasThermo FisherCélulas competentes para choque térmico
transfecção Polyplus

Referências

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  1. Kolch, W., Pitt, A. Functional proteomics to dissect tyrosine kinase signalling pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (9), 618-629 (2010).
  2. Pawson, T., Kofler, M. Kinome signaling through regulated protein-protein interactions in normal and....

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