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Secas de sangue e soro manchas como uma ferramenta útil para o armazenamento de amostra avaliar biomarcadores de câncer

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DOI:

10.3791/57113

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11 de junho de 2018

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1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 2Unit of Biostatistics and Clinical Trials, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 3Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 4Department of Oncology, Bugando Medical Center, Mwanza, Tanzania

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método simples e útil para armazenar o sangue periférico e soro/plasma para análises a jusante, tais como avaliação de nucleotídeo único (SNP) de polimorfismo e ensaio de ELISA.

Resumo

Qualidade de amostra de sangue é essencial para garantir a precisa análises a jusante como real-time PCR ou ELISA. Armazenamento correto de materiais biológicos é o ponto de partida para alcançar resultados reprodutíveis e confiáveis. Todas as amostras devem ser tratadas da mesma forma de coleta de sangue para armazenamento. Dependendo de análises a realizar, amostras de soro e sangue total devem ser armazenadas a-20 ° C ou -80 ° C até o uso. Amostras de sangue/soro também devem ser aliquotadas para evitar múltiplas de congelamento-descongelamento. Outra questão importante é as condições da amostra durante o transporte de um laboratório para outro. Se o gelo seco não está disponível ou o carregamento demora mais do que alguns dias, são necessárias abordagens alternativas. Uma opção é usar papel de filtro para coleta de sangue. Aqui, propomos um método de sangue e coleta de amostra de soro que aproveita seca manchas de sangue (DBS) e seca manchas de soro (DSS). Nós desenvolvemos o procedimento para extrair DNA de DBS para a avaliação a jusante de alguns polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) por PCR em tempo real. Nós também Aperfeiçoamos um ensaio de ELISA, a partir de proteínas eluídas da DSS. Esse método pode ser usado com outros ensaios de ELISA ou procedimentos de avaliação de proteínas.

Introdução

O principal objetivo da pesquisa em biomarcadores de câncer é a identificação de novos parâmetros biológicos que pode ser usada para diagnóstico, prognóstico de pacientes prever e para determinar se um paciente responderá a um tratamento específico. Esta área de investigação é fundamental para a descoberta de tratamentos inovadores e desempenha um papel fundamental no tratamento sob medido.

Os procedimentos realizados durante cada passo do biomarcador identificação e validação devem ser confiável e reprodutível. Uma pedra fundamental para o sucesso da investigação de translação é o correto armazenamento de amostras biológicas como sangue e soro. Este é o primeiro passo para obtenção de material biológico de alta qualidade que pode ser usado para realizar experimentos de biologia molecular ou ensaios da proteína.

Estudos multicêntricos são muitas vezes necessários para recrutar suficiente pacientes para obter dados robustos. Nem todos os institutos são capazes de armazenar amostras a-80 ° C ou para enviar amostras para outros centros internacionais em gelo seco. O uso de papel de filtro para coleta de sangue é um método simples para armazenar sangue e soro e não exige o imediato congelamento de amostras1,2. Uma gota de sangue ou soro pode ser vista no papel, deixada para secar durante a noite e então armazenado por até 14 dias em temperatura ambiente1,2. Isto dá a investigadores tempo para enviar as amostras de outros laboratórios. O uso de sangue seco manchas (DBS) e manchas secas soro (DSS), portanto, poderiam simplificar a colaboração entre os institutos em países desenvolvidos e em desenvolvimento.

Dada a sua facilidade de uso, amostragem de DBS é amplamente utilizada em diversos tipos de ensaios para análises a jusante serológicas ou genéticas. Por exemplo, no passado, DBS frequentemente foram usados para HIV triagem em países em desenvolvimento1,2,3,4,5. Outra vantagem deste método de armazenamento é que podem ser colhidas amostras de sangue do dedo-picas, permitindo seu uso para o recém-nascido, triagem de testes 6,7,8. Amostra de fácil manuseio e transporte são ainda mais vantagens de DBS, especialmente para amostras coletadas em locais remotos onde não há nenhum equipamento de laboratório. Em uma publicação anterior, usamos DBS e DSS para testar a vitamina D e vitamina D (DBP) proteína em uma série de pacientes africanos e caucasianos9. Nossos colegas africanas não foram capazes de obter gelo seco. Para comparar os marcadores biológicos para entender as diferenças na via da vitamina D, entre as duas populações étnicas, melhorámos ainda mais o procedimento usando combinadas amostras armazenadas sob condições normais e em papel de filtro. Depois de otimizar o procedimento DBS/DSS, fomos capazes de analisar DBP e vitamina D no soro em ambas as coortes. Avaliamos também um número de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) após a extração de DNA do sangue inteiro para brancos e de DBS para africanos9. O presente protocolo permite que as amostras de sangue de alta qualidade para ser armazenado em temperatura ambiente, sem afetar diferentes tipos de análises a jusante que variam de biologia molecular para ensaios de ELISA. É recomendável para uso gerenciar materiais biológicos em estudos multicêntricos ou para centros que não têm instalações para as condições de armazenamento padrão. O protocolo seguinte representa o culminar destes procedimentos otimizados.

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Protocolo

Soro e sangue periférico foram coletadas e armazenadas de doadores saudáveis e pacientes que deram consentimento escrito para participar no estudo. O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de ética local em conformidade com os padrões éticos estabelecidos na declaração de Helsinque 1964.

1. sangue armazenamento em DBS

  1. Coleta de amostra de sangue
    1. Colete 3 mL de amostra de sangue periférico em um tubo de 3 mL com 5,4 mg de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
      Nota: Guarde o sangue periférico como DBS logo que possível e dentro de 8 h.
    2. Escreva o número de código do paciente no canto inferior direito do cartão de poupança.
    3. Resuspenda cuidadosamente o sangue com uma pipeta de 5 mL.
  2. Sangue manchando em DBS
    1. Pipeta e uma mancha de sangue (50 µ l) para o cartão de poupança (Tabela de materiais) com ponta 50 – 200 µ l de transferência.
    2. Repita a etapa 1.2.1. para ter um total de 3 – 5 manchas de sangue. Descartar a velha ponta e tomar um novo para cada sangue alíquota.
    3. Deixe o DBS para secar durante a noite em temperatura ambiente na posição horizontal, sobre uma superfície não-absorvente aberta, evitando a luz direta do sol. Deixe a tampa do cartão poupança aberta para facilitar a secagem do sangue.
      Nota: Quaisquer partículas no ar ou poeira durante esta etapa de secagem não afeta os aplicativos a jusante.
    4. Guarde o cartão em temperatura ambiente em um saco plástico com dessecante até o uso.

2. extração de DNA a partir de DBS de acordo com o Datasheet de Kit de extração de DNA (seção de manchas de sangue seco)

  1. Preparação da amostra
    1. Use 3 manchas de sangue seco do cartão. Cortar cada uma das manchas de sangue seco do cartão e separá-los da placa com uma pinça. Corte as manchas de sangue seco separado em pedaços pequenos (diâmetro de cerca de 1 mm).
    2. Coloque as peças pequenas para um tubo de centrifugação de 1,5 mL.
  2. Digestão da amostra
    1. Adicione 180 µ l de tampão de Lise 1 fornecidos no kit (Tabela de materiais) para o tubo. Adicionar 20 µ l de Proteinase K. Não misture lise 1 com Proteinase k antes de pipetagem no tubo de 1,5 mL de sangue manchado o cartão. Misture-se pela utilização do vortex.
    2. Colocar o tubo em um thermoincubator e incubar a 56 ° C durante 60 min. Se o thermoincubator não está equipado com um agitador, vórtice a amostra cada 10 – 15 min pelo menos 10 s, tomando cuidado para não deixar a temperatura da amostra diminuir. Brevemente centrifuga os tubos para remover gotas da tampa.
  3. Etapa de lavagem
    1. Adicionar 200 µ l de tampão de Lise 2 (Tabela de materiais) e vórtice por 10 s.
    2. Coloque os tubos em um thermomixer ou incubadora orbital aquecida e incubar a 70 ° C durante 10 min. Se o thermoincubator não está equipado com um agitador, vórtice amostras uma vez para pelo menos 10 s, tomando cuidado para não deixar a temperatura das amostras a diminuir.
    3. Repita a etapa 2.3.1. Transferi a 400 µ l de lisado do tubo de 1,5 mL para coluna de eluição (Tabela de materiais). Centrifugue a coluna a 6.000 x g por 1 min.
    4. Coloque a coluna de eluição em um novo tubo de coleta de 2 mL e descarte a outra.
    5. Adicione 500 µ l de tampão de lavagem 1 (Tabela de materiais) e centrifugar a 6.000 x g por 1 min.
    6. Colocar a coluna em um novo tubo de coleta de 2 mL e descarte a outra.
    7. Adicione 500 µ l de tampão de lavagem 2 (Tabela de materiais) e centrifugar a 6.000 x g por 1 min.
    8. Colocar a coluna em um novo tubo de coleta de 2 mL e descarte a outra.
    9. Centrifugar a 20.000 x g, durante 3 min secar a membrana.
  4. Etapa de eluição
    1. Coloque a coluna para um novo tubo de centrifugação de 1,5 mL e descartar o tubo de coleta.
    2. Colocar 50 µ l de água destilada sobre o centro da membrana. Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente.
    3. Centrifugar o tubo a 20.000 x g por 1 min. recolher o eluato e colocá-lo novamente no centro da membrana.
    4. Centrifugar o tubo a 20.000 x g por 1 min. descartar a membrana.
    5. Medir a concentração de DNA utilizando um espectrofotômetro.
    6. DNA de loja a-20 ° C até o uso.
      Nota: DNA extraído de DBS pode ser usado para executar várias análises, tais como avaliação de SNP por PCR em tempo Real ou DNA Sanger sequenciamento.

3. soro armazenamento para DSS

  1. Coleta de amostra de sangue
    1. Colete 7 mL de amostra de sangue periférico em um tubo de 7 mL sem EDTA. Embora a amostra de sangue a coagular durante 30 min à temperatura ambiente.
    2. Escreva o número de código do paciente no canto inferior direito do cartão de poupança.
    3. Centrifugar a amostra de sangue a 980 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente.
      Nota: Guarde o soro como DSS logo que possível e dentro de 8 h.
    4. Cuidadosamente, remover o sobrenadante do tubo e transferi-lo para um novo tubo de 15 mL. Resuspenda cuidadosamente o sangue com uma pipeta de 5 mL.
  2. Soro de spotting no DSS
    1. Pipeta e uma mancha de soro (50 µ l) para o cartão da poupança de transferência. Repita este passo para ter um total de 3 – 5 manchas de sangue.
      Nota: Tenha muito cuidado para pipetar exatamente 50 µ l de soro para cada ponto. Soro não deverá ir além da linha tracejada do cartão.
    2. Deixe o DSS para secar durante a noite em temperatura ambiente. Deixe a tampa do cartão poupança aberta para facilitar a secagem do sangue.
    3. Guarde o cartão em temperatura ambiente em um saco plástico com dessecante até o uso. Se o armazenamento é superior a 14 dias, guarde o cartão a-20 ° C.

4. ensaio de ELISA a partir de DSS

  1. Eluir proteína de DSS.
    1. Se necessário, descongele um DSS para cada amostra. Corte o DSS em pequenos pedaços (cerca de 1 mm de diâmetro). Coloque os pedaços em um tubo de 1,5 mL com 400 µ l de PBS.
    2. Agitar as amostras durante a noite a 4 ° C.
      Nota: Perdê-los em baixa intensidade. PBS não molhar a tampa do tubo durante a tremer.
  2. Use o eluato de proteína como uma amostra de soro para análise de fator de crescimento/proteína secretada de acordo com instruções do kit de ELISA, após diluições apropriadas.
    Nota: Este procedimento funciona bem para a deteção de DBP9. Para outros ensaios de ELISA, uma etapa de otimização pode ser necessária.

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Resultados

Tiramos vantagem dos procedimentos de DBS e DSS para armazenar sangue e soro à temperatura ambiente, sem afetar a qualidade do material biológico. A Figura 1 mostra um exemplo do protetor de cartão de proteína sem sangue e após a coleta de sangue. A fim de confirmar que o armazenamento em papel de filtro e o procedimento para eluir sangue não interferem com a qualidade da amostra, realizamos uma comparação com métodos de armazenamento padrão. Que extraímos o ...

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Discussão

Este protocolo investiga o potencial para armazenamento de sangue e soro em papel de filtro quando os laboratórios não têm o pessoal ou as infra-estruturas necessárias para a manipulação correta de amostras de sangue. Em particular, sangue total ou soro coletado em tubos padrão ou por picada do dedo pode ser armazenado usando este método e não há nenhuma necessidade para congelar amostras a-20 ° C ou -80 ° C imediatamente após a coleta de sangue. DBS/DSS podem permanecer em temperatura ambiente por até 14 dias sem qualqu...

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Divulgações

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer Gráinne Tierney assistência editorial.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cartões de economia de proteína Whatman 903 Cartão de economia de proteína, 100/pk‎SigmaZ761575Útil para armazenar amostras à temperatura ambiente para análises a jusante
Pipetas sorológicas Falcon, 5 mLStem cell#38003
50-200 µ Pontas LStar-LabS1120-8810
Tubo de centrífuga de 1,5 mLEppendorf4036-3204
QIAamp DNA microkitQiagen56304Este é um kit de extração de DNA projetado para isolar pequenas quantidades de DNA   
Buffer ATL (incluído no microkit QIAamp DNA)QiagenIsso é relatado como Buffer de Lise 1 no texto
Buffer AL (incluído no microkit QIAamp DNA)QiagenIsso é relatado como Buffer de Lise 2 no texto
QIAamp mini coluna de eluirQiagenIsso é relatado como coluna no texto
AW1  (incluído no microkit QIAamp DNA)QiagenIsso é relatado como Wash Buffer 1 NO TEXTO
AW2  (incluído no microkit QIAamp DNA)QiagenIsso é relatado como Wash Buffer 2 no texto
Human Vitamin D BP Quantikine ELISA KitR& D sistemasDVDBP0

Referências

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