Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação e avaliação de anticorpos monoclonais contra produtos naturais para uso em diversos imunoensaios. Esse procedimento inclui imunização, fusão celular, indirecto ELISA competitivo para clone positivo triagem e preparação de hibridoma monoclonal. As especificações para a caracterização de anticorpo usando análises de ELISA e MALDI-TOF-MS também são fornecidas.
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Artigo de método
Geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais
Neste artigo
Resumo
Resumo
A análise dos componentes bioativos presentes em alimentos e produtos naturais tornou-se uma popular área de estudo em muitos campos, incluindo o tradicional chinesa medicina e comida segurança/toxicologia. Muitas das técnicas de análise clássica exigem equipamentos caros e/ou experiência. Notavelmente, ensaios imunoenzimático (ELISA) tornaram-se um método emergente de análise de alimentos e produtos naturais. Este método baseia-se na mediada por anticorpo de detecção de componentes o alvo. No entanto, como muitos dos componentes bioativos em produtos naturais são pequenos (< 1.000 Da) e não provocar uma resposta imune, criar anticorpos monoclonais (mAbs) contra eles, muitas vezes é difícil. Neste protocolo, nós fornecemos uma explicação detalhada das etapas necessárias para gerar mAbs contra moléculas-alvo, bem como aqueles necessários para criar o associado indireta competitiva (ic) ELISA para a análise rápida do composto em várias amostras. O procedimento descreve a síntese do antígeno artificial (ou seja, o conjugado de hapteno-portador), imunização, fusão celular, preparação de hibridoma monoclonal, caracterização do mAb e o aplicativo baseado em ELISA do mAb. O conjugado de hapteno-transportadora foi sintetizado por sódio periodato método e avaliada por MALDI-TOF-MS. Após a imunização, splenocytes foram isoladas a partir do rato imunizado com o mais alto título de anticorpos e fundido com a hipoxantina-aminopterin-timidina (HAT) - linha celular do mouse sensível mieloma Sp2/0 - Ag14 usando um polietileno glicol (PEG)-com base em método. As hibridomas secretando mAbs reativo ao antígeno alvo foram projectadas pelo icELISA de especificidade e de reactividade cruzada. Além disso, o método de diluição limitante foi aplicado para preparar os hybridomas monoclonais. Os finais mAbs foram ainda mais caracterizadas por icELISA e então utilizados em um aplicativo baseado em ELISA para a detecção rápida e conveniente de hapteno o exemplo (naringinases (NAR)) em produtos naturais.
Introdução
Anticorpos monoclonais (mAbs), também conhecido como anticorpos mono-específicos, são produzidos a partir de um único clone de linfócitos e são compostos de anticorpos monovalentes, que só ligam para o mesmo epítopo1. Nos últimos anos, utilizaram-se muitos produtos naturais de origem vegetal medicinais no tratamento de várias doenças2. De fato, muitos compostos moleculares pequenos originalmente derivados de produtos naturais são agora aplicados como drogas de primeira linha, tais como artemisinina para malária e paciltaxel (taxol) para câncer2,3. O estudo de pro....
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Protocolo
Todos os animais procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de revisão ética da Universidade de Beijing de medicina chinesa (aprovação número 2016BZYYL00109).
Nota: Camundongos BALB/c feminino (8 semanas de idade) foram imunizados com transportadora hapteno proteína conjugados. Quando usado sozinho, uma pequena molécula (< 1.000 Da) não pode eliciar uma resposta imune. No entanto, conjugando a molécula pequena para um resultados de macromolécula transportadora na síntese do antígeno. Neste contexto, a pequena molécula é rotulada um hapteno. Hapteno conjugação é uma estratégia eficaz e necessária para a produção do mAb....
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Resultados
Geração de hibridomas monoclonais
O peso molecular do conjugado hapteno-transportadora foi confirmado pela análise de MALDI-TOF-MS. Como o peso molecular de BSA e o NAR são conhecidos, o número de pequenas moléculas conjugadas com BSA poderia ser calculado. A Figura 1 mostra resultados representativos de espectrais para NAR-BSA22, que exibe.......
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Discussão
Aqui, apresentamos um protocolo para a produção bem sucedida de mAbs contra naturais produto derivado pequenas moléculas. As etapas essenciais no procedimento foram delineadas, e temos demonstrado a utilidade do presente protocolo usando NAR como uma pequena molécula de exemplo. Os espectros de exemplo, análises de reatividade e icELISA resultados que todos mostram representante experimental e dados de controle que são obtidos usando este protocolo. Imagens de exemplo das hibridomas fornecem uma representação visual de q.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (concessão números 81573573, 81473338 e 81503344) e a clássica receita básica equipe de pesquisa da Universidade de Beijing de medicina chinesa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 800 mesh (40 μ m nylon) filtro | FALCON | 352340 | |
| Placa de cultura de 24 poços | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Frasco | Labserv | 310109016 | |
| 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Frasco | Corning | 430720 | |
| Placa de cultura de 96 poços | NUNC | 117246 | |
| albumina de soro bovino | AMRESCO | 332 | |
| filtro de células | FALCON | 352340 | |
| tubo de centrífuga 15 mL | Tubo de | Corning | |
| 50 mL | Criotubos de 430828 | Corning | |
| , 1 mL | Cultivador Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| DRP-9082 | Samsung | ||
| (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimetilsulfóxido | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| balança eletrônica | BS124-S | Placas Sartorius | |
| ELISA, 96 poços | NUNC | 655101 | |
| etanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Soro fetal bovino | Gibco | 16000-044 | |
| soro fetal para bezerros | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund&agudo; s adjuvante, completo | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund&agudo; s adjuvante, incompleto | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatina | AMRESCO | 9764-500g | |
| Recipiente de resfriamento gradiente | Nalgene | 5100-0001 | |
| Suplemento de mídia HAT | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugado cabra-anti-rato IgG anticorpo applygen | C1308 | ||
| HT suplemento | de mídiaMicroscópio Invertido Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| IX73 | Olympus | ||
| buraco da fechadura limpa hemocianina | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Leitor de Microplacas | BioTex | ELX-800 | |
| rato | Rio Vital | BALB/c | |
| ovalbumina | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicilina& Solução de estreptomicina | Hyclone | SV30010 | |
| Pipeta 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipeta 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| leite desnatado | applygen | P1622 | |
| periodato de sódio | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| Pontas TipOne 1,000 µ L | Starlab | S1111-2021 |
Referências
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C.
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Reimpressões e permissões
