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Ein experimentelles Modell der Diät-induzierten metabolischen Syndroms in der Kaninchen: methodische Überlegungen, Entwicklung und Bewertung

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57117
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 5, 2,3, 6, 2, 2, 1,3, 6
1CIBERCV, Instituto de Salud Carlos III, 2Department of Physiology, Universitat de València, 3INCLIVA, 4Department of Electronic Engineering, Universidad Politécnica de Valencia, 5UCIM, Universitat de València, 6Department of Physiotherapy, Universitat de València

Summary

Bei Kaninchen, die mit einer fettreichen, hohen Saccharose Diät beschreiben wir Methoden, um ein experimentelles Modell des Diät-induzierten metabolischen Syndroms (MetS) zu entwickeln. Tiere entwickelte zentrale Adipositas, milde Hypertonie, Prä-Diabetes und Dyslipidämie, damit die wichtigsten Komponenten des menschlichen MetS zu reproduzieren. Diese chronische Modell ermöglicht Erwerb von Wissen zugrunde liegenden Mechanismen der Progression der Erkrankung.

Abstract

In den letzten Jahren Adipositas und metabolischen Syndroms (MetS) ein wachsendes Problem für die öffentliche Gesundheit und klinischen Praxis, die aufgrund ihrer erhöhten Prävalenz durch den Anstieg der Bewegungsmangel und ungesunde Essgewohnheiten geworden. Dank Tiermodellen kann Grundlagenforschung die Mechanismen pathologischer Prozesse wie MetS untersuchen. Hier beschreiben wir die Methoden verwendet, um eine experimentelle Kaninchen Modell Diät-induzierten MetS und ihrer Bewertung zu entwickeln. Nach einer Zeit der Akklimatisierung sind Tiere eine fettreiche (10 % hydriertes Kokosnussöl und 5 % Fett), hoch-Saccharose (15 % Saccharose in Wasser aufgelöst) Ernährung für 28 Wochen gefüttert. Während dieser Zeit wurden mehrere experimentelle Verfahren durchgeführt, um die verschiedenen Komponenten des MetS zu bewerten: morphologische und Blutdruck-Messungen, Glukose-Toleranz-Bestimmung und die Analyse von mehreren Plasma-Markern. Am Ende der Probezeit, Tiere entwickelte zentrale Adipositas, milde Hypertonie, Prä-Diabetes und Dyslipidämie mit niedrigen HDL, hohen LDL und eine Erhöhung der Triglyzeride (TG) so reproduzieren die Hauptkomponenten des menschlichen MetS. Dieses chronische Modell ermöglicht neue Perspektiven für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen in der Progression der Erkrankung, die Erkennung von präklinischen und klinischen Markern, die es ermöglichen die Identifizierung von Risikopatienten, oder auch das Testen von neuen therapeutischen Ansätze für die Behandlung dieser komplexen Pathologie.

Introduction

Adipositas und metabolisches Syndrom (MetS) sind ein wachsendes Problem für die öffentliche Gesundheit und klinischen Praxis, die aufgrund ihrer erhöhten Prävalenz durch den Anstieg der Bewegungsmangel und ungesunde Ernährung Gewohnheiten1geworden. Es gibt mehrere Definitionen der MetS, aber die meisten von ihnen beschreiben wie ein Cluster von kardiovaskulären und metabolischen Veränderungen wie abdominale Adipositas, reduzierte HDL und erhöhten LDL-Cholesterin, erhöhte Triglyceride, Glukoseintoleranz und Bluthochdruck2 ,3,4. Die Diagnose erfordert, dass drei dieser fünf Kriterien vorhanden sind.

Aufgrund Tiermodellen konnte Grundlagenforschung untersuchen die Mechanismen pathologischer Prozesse wie MetS. Verschiedenen Tiermodellen verwendet worden, aber es ist von entscheidender Bedeutung, dass das Modell der Wahl die wichtigsten klinischen Manifestationen der menschlichen Pathologie (Abbildung 1) wiedergibt. Mit diesem Ziel worden betrachtet ähnlich wie Menschen, vor allem Hunde und Schweine, Tiermodelle entwickelt (siehe Verkest5 und Zhang & Lerman6 zur Überprüfung). Canine Modelle zeigen jedoch nicht alle Komponenten des MetS, angesichts der Tatsache, dass die Entwicklung von Atherosklerose oder Hyperglykämie bei Hunden durch die Ernährung fraglich5ist. Schweine-Modelle präsentieren die anatomischen und physiologische Ähnlichkeit mit den Menschen und bieten somit signifikante Vorhersagekraft für die Aufklärung der Mechanismen, die MetS, sondern deren Instandhaltung und die Komplexität der experimentellen Verfahren nutzen Dieses Modell sehr intensive und kostspielige6.

Auf der anderen Seite Nager-Modelle (Maus und Ratte), Diät-induzierten spontane und transgenen, ausgiebig benutzt worden in der Literatur für das Studium der Fettleibigkeit, Bluthochdruck, und MetS und deren pathologischen folgen in verschiedenen Organen und Systemen (siehe Wong Et al. 7 zur Überprüfung). Obwohl der Einsatz dieser Modelle günstiger als Hunde oder Schweine ist, haben sie wichtige Nachteile. In der Tat, abhängig von der Sorte Tiere entwickeln einige Komponenten der MetS, während andere wie Hypertonie, Hyperglykämie und Hyperinsulinämie abwesend7sind. Darüber hinaus eine der Hauptkomponenten des MetS, Fettleibigkeit, in einigen genetisch veränderten Stämmen hängt nicht nur Faktoren im Zusammenhang mit der Ernährung, vielmehr wurde nachgewiesen, dass einige Tiere mit normalen oder sogar weniger Nahrung Aufnahme8fettleibig werden. Zu guter Letzt Mäuse und Ratten zeigen einen natürliche Mangel in Cholesteryl-Ester-Transfer-Protein (CETP) und HDL zu verwenden, als die wichtigsten Transportmittel Cholesterin, wodurch sie relativ resistent gegen die Entwicklung von Atherosklerose. Dies ist ein wichtiger Unterschied im Fettstoffwechsel mit Menschen, die express CETP und transportieren ihre Cholesterin vor allem im LDL-9.

Umgekehrt stellt die Labor Kaninchen eine Zwischenstufe zwischen den größeren Tier- und Nager-experimentelle Modelle. Die Kaninchen können so leicht auf verschiedene Arten von Protokollen mit minimalen Anforderungen des Personals und Wartung, leichter als größere Tiermodelle in experimentellen Verfahren verarbeitet werden eingereicht werden. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Kaninchen, die mit einer fettreichen Diät gefüttert ähnliche hämodynamische und neurohumoralen Veränderungen als übergewichtige Menschen8,10,11 haben. Der Hinweis auf Fettstoffwechsel die Kaninchen hat reichlich CETP im Plasma und profilieren Lipoprotein LDL-reichen12, auch ist ähnlich wie beim Menschen. Darüber hinaus entwickeln Kaninchen Hyperlipidämie recht schnell angesichts der Tatsache, dass als Pflanzenfresser, sie sehr empfindlich auf diätetische Fette13 sind.

Figure 1
Abbildung 1: Vergleich der MetS Tiermodellen. Siehe Verkest5, Zhang und Lerman6und Wong Et al. 7 zur Überprüfung. "Equation 1" zeigt einen Vorteil und "Equation 2" zeigt einen Nachteil. *umstritten ist, richtet sich nach der Studie, *wie gesagt, von Carroll Et Al. 8, fettleibig einige gentechnisch veränderter Stämme unabhängig von der Nahrungsaufnahme. CEPT: Cholesteryl-Ester-Transfer-Protein. GTT: Glucose-Toleranz-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Um die grundlegenden Mechanismen der pathologischen Umbau produziert von MetS in den verschiedenen Organen und Systemen aufzuklären und zu dieser komplexen Pathologie, die Wahl der ein experimentelles Modell verstehen, das die wichtigsten Komponenten des reproduziert menschlichen MetS ist unerlässlich. Die Kaninchen bieten viele Vorteile aufgrund seiner Ähnlichkeit mit der menschlichen Physiologie und die Erschwinglichkeit von Einsatz in chronischen Protokolle und Messungen. In dieser Linie wurden einige Diät-induzierten Kaninchen-Modelle mit hohem Fettgehalt und hohem Saccharose Diät verwendet14,15,16,17,18,19 (Tabelle 1), und eine Charakterisierung der verschiedenen Komponenten des MetS ist von großer Bedeutung, wenn ein Phänotyp mit der Orgel Umgestaltung im Zusammenhang mit. Hauptziel dieses Artikels soll so beschreiben die Methoden, um ein Modell von Diät-induzierten MetS bei Kaninchen, die ermöglicht die Untersuchung von seiner Pathophysiologie und Auswirkungen in Orgel Umgestaltung zu entwickeln.

Studie Ernährung Dauer Rasse MetS-Komponenten
Ob HT HG DL
Yin Et Al. (2002)14 ·    10 % Fett 24 Wochen ·      Männliche NZW Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    37 % Saccharose ·      2 kg
Zhao Et Al. (2007)15 ·    10 % Fett 36 Wochen ·      Männliche JW Equation 1 Equation 2 Equation 2 Equation 2
·    30 % Saccharose ·      16 Wochen
Helfestein Et Al. (2011)16 ·    10 % Fett 24 Wochen ·      Männliche NZW Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    40 % Saccharose ·      12 Wochen
·    0,5-0,1 Cholesterin
Ning Et Al. (2015)17 ·    10 % Fett 8-16 Wochen ·      Männliche WHHL Equation 2 - Equation 2 Equation 1
·    30 % Fruktose * ·      12 Wochen
Liu Et Al. (2016)18 ·    10 % Fett 48 Wochen ·      Männliche NZW Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    30 % Saccharose ·      12 Wochen
Arien-Mutis Et Al. (2017)19 ·    15 % Fett 28 Wochen ·      Männliche NZW Equation 1 Equation 1 Equation 1 Equation 1

Tabelle 1: Diät-induzierten MetS Kaninchen Modelle mit fettreichen, hohen Saccharose Diät. Das Symbol "Equation 2"deutet auf fehlen,"Equation 1" Präsenz, und "-" nicht ausgewertet. * eingeschränkt. WHHL, Watanabe erblich Hiperlipidemic Kaninchen. JW, japanische weiße Kaninchen. Ob, Adipositas. HT, Bluthochdruck. HG, Hyperglykämie. DL, Dyslipidämie.

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Protocol

Tierpflege und experimentelle Protokolle, die in dieser Studie verwendeten EU Richtlinie 2010/63 über den Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere eingehalten, und wurden durch die institutionelle Tier Pflege und Use Committee (2015/VSC/Erbse/00049) genehmigt.

Hinweis: Das Protokoll besteht die chronische Verabreichung von einer fettreichen, hohen Saccharose Ernährung 28 Wochen und die Bewertung der wichtigsten Komponenten des MetS. Wir haben 11 erwachsenen männlichen New Zealand White (NZW) Kaninchen mit einem Gewicht von 4,39 ± 0,14 (s.d.) kg, 20-22 Wochen alt zu Beginn des experimentellen Protokolls waren. Sie wohnten in einem Zimmer mit Feuchtigkeit (50 ± 5 %) und kontrollierter Temperatur (20 ± 1,5 ° C) Bedingungen mit einem 12-h-Licht-Zyklus. Die Worte "Chow" und "Ernährung" können in der Protokoll-Schritte werden austauschbar.

1. Ernährung Verwaltung

  1. Zu erhalten oder bereiten Sie Diäten
    1. Besorgen Sie eine handelsübliche fettreiche Ernährung mit zusätzlichen hydriertes Kokosnussöl (10 %) und Schmalz (5 %)19. Diese Diät wird 3,7 Kcal·g-1bieten.
    2. Bereiten Sie 5 bis 15 % Saccharose-Lösungen durch Auflösen der entsprechenden Mengen an Saccharose in sterilisierten Wasser (z.B.Gebrauch 300 g Saccharose in 2 L Brühe für eine 15 % Saccharose-Lösung). Eine 15 % Lösung 0,6 Kcal·mL-1.
    3. Erhalten Sie eine handelsübliche Steuerung Diät19, die 2,7 Kcal·g-1bietet.
  2. Gewöhnen Sie die Tiere für 4 Wochen
    1. Jedes Futtermittel in der Kontrollgruppe 120 g Kontrolle Ernährung täglich. Bieten Sie Wasser Ad Libitum.
    2. Füttern Sie die Tiere in MetS Gruppe 250 g Chow, beginnend mit einer 50 %-ige Kontrolle und 50 % High-Fat Chow, schrittweise Erhöhung auf 100 % High-Fat Chow bis Ende der Woche 4.
      Hinweis: Das Ziel würde sein, dass: (i) Kontrolle von 35 % und 65 % High-Fat Chow bis Ende der Woche 1; (Ii) Kontrolle 25 % und 75 % High-Fat Chow bis Ende der Woche 2; (Iii) 15 % und 85 % High-Fat Chow bis Ende der Woche 3. (iv) 100 % High-Fat Chow bis Ende der Woche 4.
    3. Den Tieren in die MetS Gruppe Wasser mit 5 % Saccharose zu Beginn, und erhöhen Sie Saccharose-Konzentration auf 15 % bis Endeder Woche 4 zu.
    4. Registrieren Sie die tägliche Einnahme von Chow und Saccharose Lösung Kalorienzufuhr entsprechend in 1.1.1 angegebenen Werte zu berechnen. und 1.1.2.
  3. Induzieren Sie MetS (28 Wochen)
    1. Jedes Futtermittel in Kontrollgruppe 120 g des Steuerelements Chow und Wasser Ad Libitum täglich.
    2. Füttern Sie die Tiere in der MetS Gruppe 250 g von fettreichen Chow und 15 % Saccharose in Wasser. Ersetzen Sie täglich Chow und die Saccharoselösung jeden dritten Tag.
    3. Wiegen Sie die verbleibenden Chow und Wasser täglich, Tagesdosis zu schätzen.

2. morphologische Beurteilung

  1. Tierische Körpergewicht auf einer wöchentlichen Basis zu messen.
  2. Messen Sie Höhe, Länge, Abdominal-Konturund tibiale Längeund schätzen Sie BMI vor der Verabreichung der experimentellen Ernährung und in den Wochen 14 und 28 bei narkotisierten Tieren.
    1. Cannulate rechtes Ohr marginal Vene mit einem sterilen Einweg-Katheter (18-22 G) und Propofol (8 Mgkg-1) gefolgt von 1,5 mL 0,9 % NaCl-Lösung zu injizieren. Führen Sie bei anästhesierten Kaninchen die Messungen in den nachfolgenden Schritten aufgeführt.
    2. Maß Höhe und Länge. Maßband, Maßnahme und Aufzeichnung der Abstand von der Nase bis zur Ferse verwenden in seitlichen Dekubitus Position (Länge). Nehmen Sie in der gleichen Position die Entfernung aus dem schulterdach in der Schulter bis zur Spitze der Pfote (Höhe).
    3. Berechnen der Body-mass-Index (BMI)20 als Körpergewicht (kg) · [Länge (m) x Körpergröße (m)] -1.
    4. Legen Sie das Maßband sanft um die Abdominal-Kontur und nehmen Sie eine Messung mit dem Tier in Rückenlage.
    5. Messen Sie tibiale Länge aus dem unteren Teil des Kniegelenks, die Einfügung der Achillessehne.

3. Fasten Glycemia und intravenösen Glukosetoleranztest (IVGTT)

Hinweis: Es ist ratsam, um die Verfahren der gleichen Tageszeit (d.h. 2-15:00).

  1. Bereiten Sie eine Glukose-Stammlösung (60 %) mit 60 g Glucose in 100 mL 0,9 % NaCl-Lösung.
  2. Schnell das Tier für 7 h (Entfernen von Nahrung und Pflege Wasser), dann legen Sie die bewusste Kaninchen in eine einschränkende in Bauchlage. Blutzuckermessgerät (legen Sie einen neuen Streifen in das Messgerät) vorzubereiten, und die erste Probe von der linken Ohr marginal Vene mit einer Lanzette um einen Tropfen Blut zu bekommen. Berühren Sie dann die Blutstropfen mit der Test-Streifen und Maßnahme Blutzuckerwerte mit dem Blutzuckermessgerät Fasten Glycemia bestimmen.
  3. Cannulate rechtes Ohr marginal Vene mit einem Einweg-Katheter (18-22 G) und injizieren einen Bolus von einer 60 % Glukoselösung (0,6 G·kg-1).
    Hinweis: Um den Bolus vorzubereiten, fügen Sie 1 mL/kg Glukose-Lager.
  4. Nehmen Sie Blutproben mit der Lanzette (ein Tropfen Blut) auf 15, 30, 60, 90, 120 und 180 min nach Injektion von Glukose und analysieren sie mit dem Blutzuckermessgerät wie in 3.2.
  5. Entfernen Sie Einweg-Katheter und Klemmen Sie die Website der Katheter Einfügung mit einer Gaze. Sobald Blut geronnen ist, entfernen Sie die Gaze und überprüfen Sie den Status des Tieres.

4. Blutdruck

  1. Bereiten Sie das Erfassungssystem, einschließlich einem Druckaufnehmer, eine 10-mL-Spritze mit 0,9 % NaCl, ein drei-Wege-Hahn, einen Verstärker und einen PC/Laptop mit der Datenerfassungs-Software (für Blutdruck-Aufzeichnung).
  2. Stellen Sie das Gerät. Zunächst legen Sie die drei-Wege-Hahn und die Spritze in der Drucksensor, zwischen dem Schallkopf und der Katheter und schließen Sie der Drucksensor an den Verstärker an. Dann den Verstärker an den PC/Laptop anschließen.
  3. Durchführen Sie Wandler druckkalibrierung gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
  4. Legen Sie das bewusste Tier in ein Kaninchen Restrainer in Bauchlage. Das Ohr vor Kanülierung Aufwärmen, dann topisch angewendet ein Lokalanästhetikum (2,5 % Lidocain/Prilocain) im Ohr auf dem Gelände der Einfügung. Klopfen Sie leicht den Bereich wo die vaskuläre Paket ausgeführt wird, auf einfache Weise die Arterie. Dann legen Sie einen sterilen Katheter (18-22 G) in der linken Ohr central Artery. Lösen Sie die Fesseln und lassen Sie das Tier ruhig 30 Minuten bleiben.
  5. Aufzeichnen der Blutdruck kontinuierlich für 20 min direkt vom arteriellen Katheter, Platzierung der Drucksensor neben das Tier auf die Herzhöhe positioniert (Sampling-Frequenz: 1 KHz, siehe Abbildung 5 b).
    Hinweis: Um den Blutdruck (BP) Aufnahmen frei von Blut gerinnen Störungen zu halten (BP Signal Amplitude verliert oder verschwindet), NaCl (0,9 %) Injektion erfolgen. Mit der drei-Wege-Hahn, schließen Sie die Schaltung, die geht aus den Schallkopf des Katheters, öffnen Sie die Schaltung, die aus der Spritze des Katheters geht, und 1-2 mL Spritzen. Dadurch werden Blutgerinnsel, die sich bilden, können in den Katheter entfernt. Dann öffnen Sie die Schaltung zwischen den Schallkopf und Katheter und fortsetzen Sie die Aufnahme, sobald das Signal wieder aufgefunden wurde.
  6. Sobald die Aufnahme beendet ist, entfernen Sie den Katheter und Klemmen mit einer Gaze auf der Website der Katheter Einfügung, Blutverlust zu stoppen. Sobald das Blut geronnen ist, entfernen Sie die Gaze und überprüfen Sie den Status des Tieres.

(5) Plasma Messungen

Hinweis: Es ist ratsam, um die Verfahren der gleichen Tageszeit (d.h. 2-15:00).

  1. Schnell das Tier für 7 h (Entfernen von Nahrung und Pflege Wasser), dann legen Sie das bewusste Tier in eine einschränkende in Bauchlage und legen Sie eine sterile Nadel 21 G in das linke Ohr marginal Vene. Sobald Blut beginnt zu Tropfen, verwerfen Sie den ersten Tropfen und sammeln Sie die Blutproben in EDTA-Röhrchen bis zur Ebene angegeben in der Röhre. Speichern Sie die Proben auf Eis.
  2. Zentrifugieren Sie Blutproben bei 1.500 x g, 15 min, 4 ° C. Nach Zentrifugation Saug das Plasma mit einer Pipette und Aliquote von 250 µL vorzubereiten.
  3. Sofort die frischen Proben analysieren. Grundlegende Steuerungsparameter lauten wie folgt: Gesamt-Cholesterin, Triglyceride, HDL und LDL Cholesterin.
    Hinweis: Nicht frisch analysierte Proben ist sofort in einem-80 ° C Gefrierschrank aufzubewahren. Bei Interesse bei der Analyse des Blutzuckers von Plasma-Proben sollten die Blutzuckermessung Röhren mit Fluorid Oxalat anstelle von EDTA verwenden.

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Representative Results

MetS repräsentiert eine Gruppe von Stoffwechsel- und Herz-Kreislauf-Anomalien, deren Studium durch den Einsatz von experimentellen Modellen erleichtert werden kann. In der Tat, um die Mechanismen der pathologischen Umbau produziert von MetS zu erhellen, ist die Wahl von einem experimentellen Modell, das entsprechend ähnelt die conditio humana und eignet sich für die Forschung von entscheidender Bedeutung. Hier präsentieren wir Ihnen die Methoden, um die MetS in Kaninchen mit einer Diät reich an gesättigten Fettsäuren und Saccharose und eine detaillierte Charakterisierung für seine Bewertung zu induzieren. Die Verwendung von Diät anstelle einer gentechnisch veränderten Tiermodell ist von großer Bedeutung da Ganzkörper-Stoffwechsel19, die Ernährung beeinflusst somit stark ähnelten Vorgänge im menschlichen MetS. Wir verwendeten eine Fakultät (mixed-Model) ANOVA mit zwei Faktoren eine Messwiederholung oder "innerhalb" Faktor (Zeit: Pre, 14 und Woche 28, abhängig von der Analyse) und ein "between" Faktor (Gruppe: Kontrolle und MetS) zur statistischen Auswertung. Bedeutung wurde akzeptiert, wenn p < 0,05.

Die fettreiche, hoch-Saccharose-Diät wird von den Tieren gut vertragen. Eine Akklimatisierung Frist von 4 Wochen ist notwendig für den richtigen Übergang von der vorherigen Fütterung die fettreichen, hohen Saccharose Diät. Tiere in der Kontrollgruppe sind 120 g Chow, gefüttert, das gezeigt worden ist, für die Aufrechterhaltung der Erwachsene Kaninchen8geeignet. Kaninchen in der MetS-Gruppe erhöhte sich schrittweise im Gewicht bis zum Ende des experimentellen Protokolls (Tabelle 2). Tiere sollten 50-100 g pro Woche gewinnen. Es ist wichtig, dass Kaninchen in Käfigen mit genügend Raum, Licht und umweltanreicherung (Abbildung 2) einzeln untergebracht sind, und eine tägliche Kontrolle der Tiere erfolgt. Auch auf einer täglichen Basis, muss Chow und trinken Einnahme überwacht und registriert, um Gewichtszunahme und mögliche gesundheitliche Probleme zu erkennen, da Kaninchen leicht gestresst sind und die Antwort kann Nahrung Konsum zu stoppen. Darüber hinaus da fettreiche Pellets tendenziell sehr instabil und Konsistenz sehr leicht verlieren in Pulver, welches Kaninchen nicht essen, zu verwandeln, ist es von entscheidender Bedeutung für die täglichen Portionen von Chow sehr sorgfältig vorbereiten (Abbildung 2A). In Abbildung 3A, beobachten wir das Verhalten von Energieaufnahme und seine Schwankungen, von 250 bis 815 kCal in der MetS-Gruppe. In Abbildung 3 bist der relative Beitrag der verschiedenen Energiequellen (Chow und Getränk) dargestellt. Es gibt kritische Perioden in 14 und 28 Wochen da, den Stress von experimentellen Verfahren produziert Kaninchen könnte Chow und Wasseraufnahme verringern. Die täglichen Quantifizierung ermöglicht die schnelle Identifizierung des Problems, die durch die Einführung von Kontrolle Chow (80 % fettreich, 20 % Steuern) vermieden werden und verringern die Saccharoselösung von 15 % auf 10 % oder sogar 5 %, während 2-3 Tage bis Tiere wiederherstellen ihrer normalen Aufnahme-Werte. Tiere entwickelt auch zentrale Adipositas, wie gezeigt durch die Erhöhung der Bauch Umfang, Gewicht und BMI (Tabelle 2), die eng mit den Risikofaktoren verbunden ist, die MetS3definieren.

Figure 2
Abbildung 2: Diät-Verwaltung. In Schalttafel A, Steuern Chow (oben) und High-Fat Chow (siehe unten) dargestellt sind, zeigen die Unterschiede zwischen den beiden wegen zusätzlichen Fett. Um das Pulver zu vermeiden, das fettreichen Pellets weniger macht schmackhaft, ist es notwendig, ein Sieb verwenden, um fettreiche Pellet-Pulver (zentrale A, unten) zu trennen. Im Bedienfeld " B" beobachten wir die benötigten Materialien für die Trink-Lösung (links) machen, und wie ist es ratsam, eine Stammlösung in den Wasserspender zu verteilen. Zu guter Letzt das Wohlergehen der Tiere ist sehr wichtig, und sie müssen einzeln in Käfigen (C) mit genügend Platz untergebracht werden und Licht und, wenn möglich, umweltanreicherung (d.h., Plattformen, Spielzeug, etc.). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Energieaufnahme. Die Entwicklung der wöchentlichen Einnahme während der 28 Wochen der Probezeit ist in zentrale A für Kontrolle und MetS dargestellt. Die relative Einnahme (in Prozent) von kCal aus High-Fat Chow und trinken Lösung der MetS Tiere zeigt sich in B. Control Panel (n = 5), MetS (n = 6). Fehlerindikatoren: SD Modified aus Arien-Mutis Et Al. 19 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Pre-Diät Woche 14 Woche 28
Kontrolle MetS Kontrolle MetS Kontrolle MetS
Gewicht (Kg) 4.35(0.15) 4.43(0.14) 4.49(0.12) 5.42(0.17) 4.51(0.13) 5.75(0.6)
Länge (cm) 52.4(1.6) 53.6(1.7) 52.5(0.8) 54.4(1.7) 53.7(0.7) 54.6(0.8)
Höhe (cm) 25.9(0.7) 25.5(1.1) 25.9(2.2) 26.1(5.3) 26.0(1.0) 26.1(1.5)
Abdom. Umfang (cm) 39.8(1.7) 40.5(1.4) 38.5(1.5) 47.5(2.2) 38.1(1.0) 49.7(3.5)
Tibiale Länge (cm) 16.4(0.8) 16.3(0.7) 16.7(0.3) 16.7(0.4) 17.4(0.4) 16.8(0.6)
BMI (Kg/m2) 32.8(1.9) 32.9(2.6) 32.8(1.2) 36.8(1.9) 32.6(2.1) 39.3(6.0)

Tabelle 2: morphologische. Wir fanden Unterschiede beim Vergleich von Kontrolle vs. MetS Wochen 14 und 28 in Gewicht (Haupteffekt p = 0,003, η2 = 0,6; paarweise Vergleiche in Woche 14 p < 0,001 und Woche 28 p < 0,001), abdominale Perimeter (Haupteffekt p < 0,001, η2 = 0,9 paarweise Vergleiche in Woche 14 p < 0,001 und Woche 28 p < 0,001), und BMI (Haupteffekt p = 0,016, η2 = 0,5; paarweise Vergleiche in Woche 14 p < 0,001 und Woche 28 p < 0,001). Kontrolle (n = 5) und MetS (n = 6). Diese Werte werden als bedeuten (SD) angegeben. Geändert von Arien-Mutis Et Al. 19.

Bezüglich der Nüchternblutzucker spielt die Reaktion auf die IVGTT eine Schlüsselrolle in der Charakterisierung der Glukose-Homöostase-21. Wir beobachten milde Hyperglykämie in Woche 14, die ein Plateau erreicht und unterhält ähnliche Werte in Woche 28 (Abb. 4A). Die Fläche unter der Kurve (AUC) erhöht sich auch der MetS-Gruppe (Abbildung 4 b). Obwohl Cut-Off Werte, Diabetes Typ II bei Kaninchen, die anhand der Nüchternblutzucker zu identifizieren noch nicht anerkannten19mit dieser experimentellen Protokoll, Kaninchen bis 28 Wochen von fettreichen, eingereicht wurden entwickelt Prä-Diabetes High-Saccharose Fütterung mit eingeschränkter Fasten Glucose und Glucose-Intoleranz.

Figure 4
Abbildung 4: Blut-Glukose Verordnung. Die Ergebnisse der IVGTT Kontroll-und MetS Tiere in den Wochen 14 und 28 werden im Fenster A. angezeigt. Die Quantifizierung der Fläche unter der Kurve (AUC) von 0 bis 180 min wird im Bedienfeld "B" mit einer Box dargestellt und Whisker plot. Dieser Parameter erhöht in MetS Tiere in Wochen 14 und 28 im Vergleich zu Kontrollen (Haupteffekt p = 0.001, η2 = 0,5; paarweise Vergleiche in Woche 14 p = 0,001 und Woche 28 p = 0,002). Kontrolle (n = 5), MetS (n = 6). Geändert von Arien-Mutis Et Al. 19 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Bluthochdruck ist eng und direkt mit dem Schweregrad der Fettleibigkeit im Zusammenhang mit. Eine fettreiche, hohen Saccharose Diät gefüttert Kaninchen 28 Wochen zeigten eine Zunahme bedeuten systolischen und diastolischen Blutdruck bereits in Woche 14, und dieser Anstieg des Blutdrucks auf Woche 28 (Abbildung 5 – E) gehalten wird. Angesichts der engere Beziehung zwischen Blutdruck und BMI22, ist es von großer Bedeutung, um sicherzustellen, dass Tiere Gewichtszunahme schrittweise um einen deutlichen Anstieg des Blutdrucks zu erhalten.

Figure 5
Abbildung 5: Änderungen des Blutdrucks. Zentrale A zeigt den Katheter in die Ohrmuschel Arterie. Der Hinweis angesichts der Tatsache, dass die auricular Arterie und der Vene des Gebisses des Ohres sehr eng durchlaufen, ist es von entscheidender Bedeutung, sie zu unterscheiden. Vor Kanülierung empfiehlt es sich, warme Aufbau des Ohrs und nach topische Anästhesie, klopfen leicht den Bereich wo die vaskuläre Paket ausgeführt wird. Die Arterie ist ein dicker Gefäßwand und eine hellere Farbe als die Vene, und Blut Impulse können beobachtet werden. Zentrale B zeigt den Versuchsaufbau mit der Drucksensor, die an einen Verstärker angeschlossen ist und nimmt ständig das Signal (BP-Aufzeichnung). Seitenteile C und D zeigen Box und Schnurrhaare Grundstücke des systolischen und diastolischen Blutdrucks in Woche 14 und 28 in beiden Versuchsgruppen. Mittleren arteriellen Druck (MAP) wird im Bedienfeld "E." vorgestellt. Wir fanden Unterschiede beim Vergleich von Kontrolle vs. MetS in den Wochen 14 und 28 im systolischen (Hauptwirkung p = 0,003, η2 = 0,4; paarweise Vergleiche in Woche 14 p = 0.029 und Woche 28 p = 0,013), diastolischen (Haupteffekt p = 0,027, η2 = 0,3; paarweise Vergleiche auf Woche 14 p = 0,036 und Woche 28 p = 0,001) und MAP (Haupteffekt p = 0,006, η2 = 0,4; paarweise Vergleiche in Woche 14 p = 0,027 und Woche 28 p = 0,001). Kontrolle (n = 5), MetS (n = 6). Geändert von Arien-Mutis Et Al. 19 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zu guter Letzt braucht man um die Entwicklung des MetS zu beurteilen, eine Bewertung der Veränderungen im Plasma biochemischen Markern. In diesem chronischen Modell beobachteten wir eine Veränderung in der Lipid-Profil so früh wie in Woche 14, und diese Veränderung blieb bis Woche 28, ohne weitere Erhöhungen in den unterschieden. Änderungen im Plasma-Lipid-Profil zeichnen sich durch eine Erhöhung der Triglyceride und LDL, einem Rückgang der HDL, und keine Änderungen im Gesamt-Cholesterin in MetS Tiere im Vergleich zu Kontrollen an beiden Zeitpunkten (14 und 28 Wochen) (Tabelle 3).

Woche 14 Woche 28
Kontrolle MetS Kontrolle MetS
Gesamt-Cholesterin (Mg·dL-1) 20.4(2.3) 24.0(9.1) 27.4(15.7) 21.2(4.4)
HDL (Mg·dL-1) 9.1(4.2) 4.3(1.7) 11.2(4.2) 5.1(2.9)
LDL (Mg·dL-1) 3.8(1.1) 8.7(4.5) 4.0(1.2) 13.8(9.3)
Triglyceride (Mg·dL-1) 71.2(58.8) 118.0(40.7) 30.2(11.4) 76.8(28.2)

Tabelle 3: Bewertung der Plasma Biochemie. Wir fanden Unterschiede beim Vergleich von Kontrolle vs. MetS Wochen 14 und 28 in HDL (Haupteffekt p = 0,008, η2 = 0,3; paarweise Vergleiche in Woche 14 p = 0,006 und Woche 28 p = 0,037), LDL (Haupteffekt p = 0,040, η2 = 0,2; paarweise Vergleiche auf Woche 14 p = 0,02 8 und Woche 28 p = 0,034), und Triglyceride (Haupteffekt p = 0,002, η2 = 0,4; paarweise Vergleiche in Woche 14 p = 0,004 und Woche 28 p = 0.001). Kontrolle (n = 5) und MetS (n = 6). Diese Werte werden als bedeuten (SD) angegeben. Geändert von Arien-Mutis Et Al. 19

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Discussion

Die Einrichtung eines geeigneten experimentellen Modells bieten eine konsistente und zuverlässige Methode, um die Entwicklung des MetS zu studieren, und es ist auch notwendig, die grundlegenden Mechanismen zu verstehen, die den Organen und Systemen Umbau zugrunde liegen. Hier beschreiben wir die Methoden zur Entwicklung eines relevanten experimentellen Modells der Diät-induzierten MetS und wie die Hauptkomponenten dieses Clusters von Stoffwechsel- und Herz-Kreislauf-Anomalien zu bewerten, die dieses Modell zu charakterisieren: zentrale Adipositas, Bluthochdruck, Glucose-Intoleranz und Dyslipidämie mit niedrigen HDL, hohen LDL und eine Erhöhung der TG-Ebenen.

Die große Stärke des Modells ist die Fähigkeit, die Bedingung, die die klinische Manifestation der Pathologie vorausgeht. In der Tat über Stoffwechselveränderungen, in 28 Wochen Tiere nicht Typ-II-Diabetes entwickeln und waren in einem Zustand des prädiabetes (Abbildung 4). In ähnlicher Weise Plasma biochemischen Markern zeigte eine offensichtliche Änderung in der Lipid-Profil mit einem Anstieg der LDL und TG, eine Abnahme der HDL, aber keine Änderungen im Gesamt-Cholesterin (Tabelle 3), ist ein Schlüsselfaktor bei der Entwicklung von Atherosklerose. Obwohl wir eine Zunahme beobachten können systolischer, diastolischer, und Karte in Woche 28 (Abbildung 5), kann dies als milde Hypertonie. Alles in allem, die Effekte in dieser Stoffwechsel- und Herz-Kreislauf-Marker sind bescheiden, aber dieses Modell können die Forschung der Zustand vor der manifestierten (und in den meisten Fällen irreversibel) Pathologie, so dass die Identifizierung der präklinischen und klinischen Markierungen, die die Erkennung der Patienten gefährdet ermöglichen könnte.

Darüber hinaus können spontan oder transgenen Kaninchen Modelle im Gegensatz zu anderen MetS Tiermodellen (Maus, Ratte und Hund), alle Komponenten der MetS entwickeln. Interessanterweise wurde berichtet, dass die Kombination der verschiedenen Komponenten der MetS kardiovaskuläres Risiko verstärken kann. In der Tat der pathologischen Umbau produziert von Bluthochdruck wird verschärft, wenn weitere Komponenten der MetS23werden angezeigt. Diese experimentelle Modell könnte die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen ermöglichen, und die Wirkung der verschiedenen Komponenten kombiniert. Angesichts der Tatsache, dass die Ernährung Ganzkörper-Stoffwechsel beeinflusst, hat die Verwendung eines Diät-induzierten Modells darüber hinaus wichtige Bedeutung, eng emulieren, was in menschlichen MetS19.

Die letzte, aber nicht zuletzt wichtige Stärke ist die Balance zwischen der Relevanz und Auswirkungen auf die translationale Forschung und die wirtschaftlichen Kosten. Auf der einen Seite finden wir die Schweine Modelle, sehr ähnlich wie beim Menschen, aber sehr teuer in Bezug auf die wirtschaftlichen Kosten, Zeit und Ressourcen. Auf der anderen Seite haben wir Nager-Modelle, die leicht mit sehr geringem Aufwand umzusetzen, sondern haben eine geringere Leistung der Verallgemeinerung. Das Kaninchen-Modell stellt den mittleren Punkt wie es flexibel genug, um viele verschiedene Arten von Studien ist einige der Nachteile von großen Tiermodellen zu vermeiden, und ähnliche hämodynamische und neurohumoralen Veränderungen in menschlichen MetS8zeigt, 10,19.

Die folgenden Einschränkungen der beschriebenen Methoden sollten berücksichtigt werden. Im Hinblick auf zentrale Fettleibigkeit und Körper Fettverteilung wäre die Verwendung von Magnet-Resonanz-Tomographie der Goldstandard, falls vorhanden, sonst nutzen die Quantifizierung von viszeralem Fett am Ende der 28 Wochen. Andere nicht-invasive Methoden für Längsschnittstudien, wäre wie Röntgen, Computertomographie, berechnet eine angemessenere24. Wir stattdessen Bauch Umfang und BMI gemessen (Tabelle 2), die auch verwendet wurden in mehreren Studien bei Kaninchen als Maß für die zentrale Fettleibigkeit25,11,26. Tibiale Längenmessung könnte auch genauer mit Sonografie oder ein Bein Röntgen. Um festzustellen, wenn die Ursache von Glucose-Intoleranz in diesem chronischen Modell Insulin-Resistenz oder verminderte Insulin-Produktion ist, Insulin-Resistenz bestimmt werden soll, mit Hilfe einer Insulin-Toleranztest oder Fasten Insulinspiegel bestimmen.

Schließlich, um das Modell zu verbessern, könnten mehrere Maßnahmen ergriffen werden. Wir könnten wohl einen schnelleren Anstieg der fettanalyse mit der Kombination von kurzen Perioden von Alloxan Injektion erhalten haben und die fettreichen, hohen Saccharose Diät, aber dann den Phänotyp konnte nicht nur auf die Ernährung zurückgeführt werden. Alter könnte auch eine wichtige Rolle spielen, da wir arbeiteten oft mit jungen Erwachsenen Kaninchen (4,5 Monate alt, als Tiere in der Tierhaltung, 12,5-13 Monate alt Ende des experimentellen Protokolls ankam) und MetS tritt bei älteren Alter27. Leider waren ältere Kaninchen nicht im Handel erhältlich. Es wäre interessant, dieses Modell bei älteren Tieren zu testen und beobachten, ob der Phänotyp verschärft wird.

Für die Entwicklung dieser experimentellen Modell der MetS im Labor Kaninchen hier vorgestellten Methoden soll ein wertvolles Werkzeug für Studien mit dem Ziel, die grundlegenden Mechanismen der pathologischen Umbau produziert von MetS in den verschiedenen aufzuklären Organe und Systeme, und um diese komplexe Pathologie verstehen. Zu guter Letzt da NZW Kaninchen sitzende Tiere sind, diese Diät-induzierten Modell kann nützlich sein, zu studieren, wie die verschiedenen Komponenten der Pathologie in ähnlicher Weise entwickeln, als in menschlichen MetS auftritt, und neue Perspektiven für das Verständnis können der pathophysiologischen Mechanismen der Progression der Erkrankung, die Identifizierung von präklinischen und klinischen Markern um Risikopatienten zu identifizieren, oder sogar das Testen neuer therapeutischer Ansätze für die Behandlung dieser komplexen Pathologie beteiligt.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Generalitat Valenciana (GV2015-062), Universitat de València (UV-INV-PRECOMP14-206372), MZ, Generalitat Valenciana (PROMETEOII/2014/037) und Instituto de Salud Carlos III-FEDER Mittel (CIBERCV CB16/11/0486) FJC unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Veterinary scale SOEHNLE 7858 Scale
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Shovel for aluminum feed COPELE 10308 Shovel for aluminum feed
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Balance PCE Ibérica PCE-TB 15 Balance
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Strainer (20 cm diam.) ZWILLING 39643-020-0 Strainer
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Bowl ZWILLING 40850-751-0 Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Funnel BT Ingenieros not available Funnel
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Introcan Certo 22G blue B Braun 4251318 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Propofol Lipuro 10 mg/ml vial 20 ml B Braun 3544761VET General intravenous anesthetic
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FisioVet serum solution 500ml B Braun 472779 Scale
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Askina Film Vet 1,25cm x 5m B Braun OCT13501 Plastic Plaster
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Askina Film Vet 2,50cm x 5m B Braun OCT13502 Plastic Plaster
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Injekt siringe 10ml luer B Braun 4606108V Injection-aspiration syringe of two single-use bodies
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/injekt-
Seca 201 seca seca 201 Ergonomic tape for measuring perimeters
https://www.seca.com/es_es/productos/todos-los-productos/detalles-del-producto/seca201.html#referred
Sterican 21Gx1" - 0,8x25mm verde B Braun 4657543 Single Use Hypodermic Needle
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/agujas-hipodermicas-sterican-
CONTOURNEXT-Meter BAYER 84413470 Blood glucose analysis system
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-meter-2
CONTOUR NEXT test strips BAYER 83624788 Blood glucose test strips
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-test-strips-100-ct-package
MICROLET NEXT LANCING DEVICE BAYER 6702 Lancing device
http://www.contournextstore.com/en/new-microlet-next-lancing-device
MICROLET 2 Colored Lancets BAYER 81264857 Ultra-thin sterile lancet for capillary puncture
http://www.contournextstore.com/en/microlet2-colored-lancets-100s
Injekt 20ml luer siringe B Braun 4606205V Scale
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Askina Mullkompressen 7,5x7,5cm - sterile B Braun 9031219N Sterile gauze packets in envelopes
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-mullkompressen-esteril
Emla lidocaine/prilocaine AstraZeneca not available Local anesthetics
https://www.astrazeneca.es/areas-terapeuticas/neurociencias.html
Introcan Certo 18G short B Braun 4251342 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Introcan Certo 20G B Braun 4251326 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Blood Pressure Transducers-MA1 72-4497 Harvard Apparatus 724497 Transducer for monitoring blood pressure
http://www.harvardapparatus.com/physiology/physiological-measurements/transducers/pressure-transducers/research-grade-pressure-transducers.html
PowerLab 2/26 AD Instruments ML826 Amplifier
https://www.adinstruments.com/products/powerlab
LabChart ver. 6 AD Instruments not available Acquisition software
https://www.adinstruments.com/products/labchart
Animal Bio Amp AD Instruments FE136 Amplifier
https://www.adinstruments.com/products/bio-amps#product-FE136
K2EDTA 7.2mg BD 367861 Blood collection tubes
http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=367861
Centrifuge SciQuip 2-16KL Centrifuge
http://www.sigma-centrifuges.co.uk/store/products/refrigerated-sigma-2-16k-centrifuge/
Eppendorf Reference 2, 100 – 1000 μL Eppendorf 4920000083 Pipette
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Pipeteo-44563/Pipetas-44564/Eppendorf-Reference2-PF-42806.html
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30121023 Tubes
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Puntas-tubos-y-placas-44512/Tubos-44515/Eppendorf-Safe-Lock-Tubes-PF-8863.html
NZW rabbits (16-18 weeks old) Granja San Bernardo not available New Zealand White rabbits
http://www.granjasanbernardo.com/en/welcome/
Sucrose  Sigma S0389-5KG Sucrose for drinking solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=es&region=ES
Rabbit maintenance control diet Ssniff V2333-000 Control diet
http://www.ssniff.com/
Rabbit high-fat diet Ssniff S9052-E020 High-fat diet
http://www.ssniff.com/
Rabbit rack and drinker Sodispan not available Rack for rabbits
https://www.sodispan.com/jaulas-y-racks/racks-conejo-y-cobaya/
Rabbit restrainer Zoonlab 3045601 http://www.zoonlab.de/en/index.html

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