Como caldo em Vitro rastreio: um método fácil e rápido para detectar novos compostos antifúngicos

Resumo

Um fácil e adaptável como caldo para a seleção de extratos e compostos antifúngicos.

Resumo

Infecções fúngicas tornaram-se uma importante condição médica nas últimas décadas, mas o número de drogas antifúngicas disponíveis é limitado. Nesse cenário, a busca de novos medicamentos antifúngicos é necessária. O relatado aqui detalha um método péptidos de tela para suas propriedades antifúngicas. Ele se baseia o teste de sensibilidade como caldo de orientações Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 com modificações de acordo com a pesquisa de peptídeos antimicrobianos como potenciais novos antifúngicos. Este protocolo descreve um ensaio funcional para avaliar a atividade dos compostos antifúngicos e pode ser facilmente modificado para se adequar a qualquer classe particular de moléculas sob investigação. Desde que os ensaios são realizados em placas de 96 poços, usando volumes pequenos, uma triagem em larga escala pode ser concluída em um curto espaço de tempo, especialmente se realizado em um ambiente de automação. Este procedimento ilustra como um protocolo clínico padronizado e ajustável pode ajudar a busca de trabalho-banco de novas moléculas para melhorar a terapia de doenças fúngicas.

Introdução

Infecções fúngicas tornaram-se uma preocupação médica importante nas últimas décadas, tendo aumentado consideravelmente principalmente devido a um aumento do número de indivíduos imunocomprometidos, tais como aqueles submetidos a tratamento de câncer e aqueles que vivem com HIV/AIDS ou transplante de órgãos,^1,2. No entanto, um conjunto muito limitado de drogas antifúngicas disponíveis e o número crescente de relatórios sobre resistência fúngica-lhes contribuam para os grandes problemas em relação a terapêutica de micoses sistêmicas³.

Uma potencial fonte de novos compostos antifúngicos são peptídeos antimicrobianos (AMPs), pequenos peptídeos catiônicos produzidos por muitos organismos como parte de sua resposta imune inata para infecção⁴. No entanto, o método de triagem para testar estes compostos contra patógenos fúngicos não é padronizado. Diferentes procedimentos têm sido utilizados para avaliar a atividade antifúngica de AMPs, às vezes para o mesmo modelo microorganismo^5,6,7. Essas diferenças e a falta de detalhes em alguns protocolos complicam comparações entre compostos e dificulta a reprodutibilidade.

Uma forma de padronizar os testes de novos candidatos a fármacos é seguir diretrizes usadas para definir a susceptibilidade em ambientes clínicos, tais como o clínico e orientações Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. No entanto, estes testes de sensibilidade antifúngica são demasiado restritivas e não leva em variação de consideração no metabolismo em toda a espécie, como eles foram criados apenas para alguns agentes selecionados. Por exemplo, eles não levam em conta as necessidades metabólicas de leveduras não-fermentação.

Este protocolo permite a avaliação da atividade dos compostos antifúngicos em potencial e é implementado aqui para a procura de peptídeos antifúngicos. Ele se baseia o teste de sensibilidade como caldo de orientações CLSI M27-A3 com modificações que otimizam a exibição de novos compostos^8,9. Estas alterações permitem o uso de pequenas quantidades de composto, variações de temperatura ou inóculo inicial e de diferentes meios de comunicação para o crescimento ideal do pré-teste, enquanto padronizar os resultados com o uso de antifúngicos de referência como controles. Esse método, com o uso de placas de cultura multi bem, torna possível para um grande número de compostos de tela de forma rápida e confiável.

Devido à sua flexibilidade inerente, este protocolo pode ser usado com diferentes classes químicas de compostos e contra outros microorganismos, com algumas adaptações.

Protocolo

1. soluções e meios de comunicação

1. Prepare 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suporte, tampão fosfato salino (PBS), caldo de Sabouraud dextrose e ágar de Sabouraud dextrose conforme tabela 1.

2. condições de crescimento do inóculo fúngicas

1. Armazene todas as estirpes fúngicas como estoques congelados em glicerol de 35% a-80 ° C, até que seja necessário.
2. Execute as seguintes etapas antes de cada experimento.
   1. Por cepas de Candida albicans :
      1. Descongelar um frasco de estoque e transferir 200 µ l a 10 mL de caldo de Sabouraud dextrose em um tubo de polipropileno estéril 50 mL com tampa e cultura durante a noite a 30 ° C, com agitação (200 rpm). Lembre-se de inclinar o tubo e deixar a tampa um pouco aberta para melhor aeração da cultura.
   2. Para cepas de Cryptococcus neoformans :
      1. Raspe a superfície congelada de um frasco de estoque. As células em placas de ágar Sabouraud dextrose da placa e incubar durante 48 h a 30 ° C. Depois visível crescimento de colônias isoladas, manter as placas no frigorífico (4 ° C) selado com película de parafina para até 15 dias.
      2. Recolher uma colônia isolada de médio porte da placa usando um palito estéril ou ansa inoculando estéril e inocular 10 mL de caldo de Sabouraud dextrose em um tubo cônico estéril 50 mL. Incube durante aproximadamente 24 horas a 30 ° C, sob agitação (200 rpm).
      3. Não exceda a incubação de 24 h. Lembre-se de inclinar o tubo e deixar a tampa um pouco aberta para melhor aeração. É sempre bom padronizar a fase de crescimento das células antes de cada ensaio, já que este é um fator importante que afecta a resistência antimicrobiana.
         Nota: Ambos os fungos foram cultivados a 30 ° C, de rápida propagação em nossos experimentos, mas a temperatura pode ser alterada para refletir os objetivos do estudo, o tratamento por exemplo clínico (37 ° C). Mais importante, este tempo de incubação inicial deve ser previamente estabelecido para cada isolado fúngico e mantido ao longo de todos os testes para garantir a reprodutibilidade.
3. Após o crescimento de fungos, colete as células por centrifugação dos tubos cónicos a 1.200 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e adicionar 10 mL de PBS.
4. Ressuspender as células e centrifugar novamente a 1.200 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
5. Repeti a lavagem PBS e centrifugação mais duas vezes. Após a terceira lavagem, Ressuspender as células em 5 mL (de acordo com o tamanho da pelota) de 2 X RPMI-1640 médio.
6. Prepare-se 1 mL de uma diluição de 1: 100 ou 1:1,000 em um tubo de microcentrifugadora (dependendo da turvação de suspensão de células).
7. Alíquota 10 µ l desta diluição, coloque-o em uma câmara de hemocytometer e conte o número total de células nos quadrantes quatro canto sob o microscópio. Calcular a concentração pela fórmula: (total de número de celular/4) x diluição fator x 10⁴ (constante de diluição de câmara).
   1. Considere uma viabilidade de 100% se condições de viabilidade contagens e crescimento têm sido sistematicamente correlacionadas para o isolado a ser estudado.
      Nota: A padronização e controle de qualidade das contagens de viabilidade podem ser feitos por trás-chapeamento de acordo com o Comité Europeu de antifúngicos método de concentração inibitória mínima (CIM) teste de susceptibilidade aos antimicrobianos (EUCAST) para leveduras¹⁰ .
   2. Se a correlação de crescimento/viabilidade não foi estabelecida para o isolado sob estudo, medir a viabilidade de fungosa pela contagem de células vivas em um hemocytometer com o auxílio de corantes que cor seletivamente as células mortas, como Floxina B¹¹, trypan azul ¹², ou Janus verde¹³. Use as células fúngicas para este protocolo somente se a viabilidade da população neste momento é de 90% ou acima.
      Nota: Corantes mortos/vivos podem não funcionar bem com o fungo de escolha. Por favor, teste-os antes de usar. Por exemplo, o corante azul de Tripan não funciona bem com o c. neoformans.
8. Depois disso, preparar as suspensões celulares em 2 X RPMI-1640 médias (2 X ajustado inóculo em meio RPMI-1640). Para placas de 96 poços, considere um volume de 5 mL por cada placa.
   1. Para todas as cepas de c. albicans , prepare uma suspensão de célula estoque de 4 x 10³ células/mL. Esta concentração é 2x da concentração celular final em cada poço (2 x 10³ células/mL).
   2. Para cepas de c. neoformans , prepare uma estoque cultura de células de 2 x 10⁴ células/mL. Esta concentração é duas vezes a concentração celular final em cada poço (1 x 10⁴ células/mL).
   3. Para outros fungos, teste com um antifúngico conhecido qual concentração será ideal para o estudo particular em relação ao tempo de incubação. Tempo de duplicação e metabolismo do fungo em consideração.

3. peptídeos (agente desconhecido)

1. Armazenar os peptídeos liofilizados a-20 ° C e dissolvê-los em água desionizada antes de cada experimento. O tempo máximo de armazenamento, uma vez dissolvido em água vai depender da natureza de cada peptídeo.
2. Prepare alíquotas de duas vezes a maior concentração final testados no ensaio (2 X). Idealmente, prepare um pequeno número de alíquotas com suficiente peptídeo para uma utilização evitar ciclos de congelamento e descongelamento.
   Nota: A escolha da concentração deve ser baseada na literatura e as propriedades do peptide. Recomenda-se iniciar as diluições de série com cerca de 100 µM do peptide e, em seguida, diminuir ou aumentar este intervalo de concentração dependendo dos resultados obtidos.

4. referência antifúngicos (controles positivos)

1. Para aqueles diluído em água: preparar uma solução X 2 de maior concentração da análise (ver secção 5: ensaio antifúngicos para as etapas de diluição).
   1. Por cepas de c. albicans , prepare uma solução de 128 µ g/mL de fluconazol ou 128 µ g/mL de caspofungina. A concentração de placa para ambos será 64 µ g/mL.
   2. Por cepas de c. neoformans , prepare uma solução de 32 µ g/mL de anfotericina B (solução hidrossolúvel). A concentração de placa será 16 µ g/mL.
      Nota: Normalmente anfotericina B é diluído em dimetilsulfóxido (DMSO), desde que este antifúngicos é pouco solúvel em água. No entanto, existem preparações hidrossolúveis anfotericina B disponível comercialmente.
2. Para antifúngicos diluídos em um solvente orgânico: preparar uma 100 X solução estoque em DMSO e, em seguida, diluir a 10 X na água para uso.
   Nota: Assim, no poço, a concentração final de DMSO não exceda 1%. Um poço onde o fungo irá crescer em meios contendo 1% DMSO como controle é necessário, dado que alguns fungos não toleram bem esta concentração do solvente. Lembre-se que o DMSO é fotossensível, então cubra o prato com papel alumínio ou coloque-o em uma câmara escura para a duração do período de incubação.

5. antifúngico ensaio

Nota: Os ensaios In vitro antifungais são executados com base no teste de susceptibilidade de caldo como de orientações Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 com algumas modificações.

1. Preparar uma diluição serial dupla de cada peptídeo e antifúngico em microplacas de poliestireno de 96 poços para um volume final de 50 µ l de controle.
   1. Usando uma pipeta Adicione 100 µ l do peptide/antifúngico na concentração X 2 da mais alta desejada concentração final nas colunas 1-3, em linha A.
   2. Usando uma pipeta multicanal, adicionar 50 µ l de água estéril em outros poços, nas linhas B-H.
   3. Remover 50 µ l de poços com a maior concentração (linha A), transferir para o próximo bem da próxima concentração (linha B) e homogeneizar.
   4. Repita os passos acima até o poço com a menor concentração e descartar 50 µ l desta bem (linha H). Deixe colunas 11 e 12 (linhas A, B, C) com água apenas para controle em branco ou controle negativo/crescimento.
   5. Adicionar 50 µ l do 2 X inóculo ajustado em meio RPMI-1640 a cada poço (colunas 1-3 plus coluna 11 (controle negativo/crescimento)); a concentração final para c. albicans será 2 x 10³ células/mL e a concentração final para cepas de c. neoformans será 10⁴ células/mL.
   6. Prepare-se controles em branco (50 µ l água + 50 µ l 2 X RPMI-1640 meio sem células) e controle negativo/crescimento (50 µ l água + 50 µ l ajustado inóculo 2 X RPMI-1640 médio sem antifúngico) e carga na placa bem como descrito acima.
2. Repita o procedimento para cada composto a ser testado e o controle de antifúngico escolhido (colunas 4-10).
   Nota: As diluições de série podem ser feitas verticalmente como o experimento abaixo, ou horizontalmente na placa (ou seja, se o número de diluições de determinado composto/extracto que precisam ser testados é de oito ou mais).
   1. Se os compostos, referência drogas, ou qualquer dos seus componentes são fotossensíveis, realizar o ensaio em luz reduzida, cobrir as placas com papel alumínio ou coloque em uma câmara escura, durante a incubação do.
3. Considere as seguintes recomendações opcionais.
   1. Selo da placa com uma placa de tampa transparente que permite a troca gasosa, como este ajuda a reduzir a evaporação.
   2. Coloque a placa em uma câmara úmida; Isso também ajudará a reduzir a evaporação.
4. Incube as placas a 37 ° C por 24 h ou 48h para todas as cepas de c. albicans e por 48 h com 200 rpm agitação por c. neoformans. O volume final inferior (100 µ l) garante que não há repercussões ocorre.
   Nota: Nenhuma diferença significativa foi observada entre as leituras de MIC em 24 h e 48 h para cepas de c. albicans . No entanto, leituras em 48 h são mais fáceis de Visualizar.
5. Observe todos os poços, com o auxílio de um microscópio óptico invertido, antes do período de incubação e depois verificar as alterações na morfologia, bem como para verificar se há sinais de contaminação.
   Nota: As leituras podem ser feitas visualmente e fotografadas no final do experimento. Antes de cada leitura, homogeneizar ligeiramente a placa. As leituras também podem ser realizadas medindo seu OD em 600 nm, se agrupa de célula ou filamentação não são observados.
6. Realizar os experimentos que pelo menos três vezes em datas distintas.

Resultados

O MIC é definido como a menor concentração de compostos antimicrobianos que inibe completamente o crescimento fúngico visível no final do período de incubação. Desde que o objectivo do presente protocolo é ter um método rápido de antifúngicos potencial de tela, qualquer bem com clara mídia similar aos poços em branco é considerado um resultado positivo, Considerando que qualquer bem com turbidez análoga dos poços de controle negativo/crescimento considerados negativos. No entanto, se houv...

Discussão

Como testes podem analisar a potencial atividade antifúngica de um alvo composto usando pequenas quantidades do composto e ao mesmo tempo testá-lo em uma gama de concentrações. Nesse sentido, o presente protocolo é recomendado como um primeiro passo na triagem para potenciais novos compostos antifúngicos. O protocolo aqui apresentado é baseado no protocolo M27-A3, inicialmente projetado para auxiliar na seleção da terapia antifúngica em clínicas e pode ser adaptado a uma variedade de novos compostos antifúngicos. Globalm...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meios e Reagentes
Meio RPMI 1640 com l-glutamina, sem bicarbonato de sódio	Thermo Fisher	31800-022
3-(N-morpholino) ácido propano sulfônico (MOPS) (o que a gente usa tem um só dio, completa o nome dele please)	Sigma-Aldrich		Use para tamponar 2X RPMI meio
Cloreto de sódio (NaCl)	Dinâ mica	1528-1	137 mM para solução salina tamponada com fosfato (PBS)
Cloreto de potássio (KCl)	J.T.Baker	3040-01	2,7 mM para solução salina tamponada com fosfato (PBS)
Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	V000129	10 mM para solução salina tamponada com fosfato (PBS)
Di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	60230	2 mM para solução salina tamponada com fosfato (PBS)
BD Difco Sabouraud caldo dextrose	BD	238230
BD Difco Sabouraud Dextrose Agar	BD	210950
Glicerol	Sigma-Aldrich	V000123	35% para (soluç ã o de estoque? Criopreservaç ã o?)
		estéril	Para diluiç ã o das drogas na diluiç ã o seriada
Medicamentos antifúngicos
Anfotericina B	Sigma-Aldrich	A2942
Fluconazol	Sigma-Aldrich	F8929
Caspofungina	Sigma-Aldrich	PHR1160
Plásticos
50 mL tubo	cônicoSarstedt	62.547.254
Prato petri	J.Prolab	0304-5
Placa de 96 poços	Corning	3595
Reservatório de Solução Estéril	KASVI	K30-208	Use para pipetar as soluções usando o pippet multicanal
Equipamento e outros materiais
Microscópio óptico	Nikon	Centrífuga E200MV
	Thermo Fisher	MegaFuge 16R
Incubadora	Ethik Technology	403-3D	Conjunto para 37° C
Shaker	New Brunswick Scientific	Excella E25	Conjunto para 37° C, 200 RPM
Câmara de contagem de células, Neubauer	BOECO Alemanha	BOE 13
Pipeta multicanal	HTL	5123