Artigo de método

Como caldo em Vitro rastreio: um método fácil e rápido para detectar novos compostos antifúngicos

DOI:

10.3791/57127

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14 de fevereiro de 2018

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1Laboratory of Molecular Biology, Department of Cellular Biology, Institute of Biological Sciences, University of Brasília, 2Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 4Faculty of Ceilândia, University of Brasília

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Um fácil e adaptável como caldo para a seleção de extratos e compostos antifúngicos.

Resumo

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Infecções fúngicas tornaram-se uma importante condição médica nas últimas décadas, mas o número de drogas antifúngicas disponíveis é limitado. Nesse cenário, a busca de novos medicamentos antifúngicos é necessária. O relatado aqui detalha um método péptidos de tela para suas propriedades antifúngicas. Ele se baseia o teste de sensibilidade como caldo de orientações Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 com modificações de acordo com a pesquisa de peptídeos antimicrobianos como potenciais novos antifúngicos. Este protocolo descreve um ensaio funcional para avaliar a atividade dos compostos antifúngicos e pode ser facilmente modificado para se adequar a qualquer classe particular de moléculas sob investigação. Desde que os ensaios são realizados em placas de 96 poços, usando volumes pequenos, uma triagem em larga escala pode ser concluída em um curto espaço de tempo, especialmente se realizado em um ambiente de automação. Este procedimento ilustra como um protocolo clínico padronizado e ajustável pode ajudar a busca de trabalho-banco de novas moléculas para melhorar a terapia de doenças fúngicas.

Introdução

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Infecções fúngicas tornaram-se uma preocupação médica importante nas últimas décadas, tendo aumentado consideravelmente principalmente devido a um aumento do número de indivíduos imunocomprometidos, tais como aqueles submetidos a tratamento de câncer e aqueles que vivem com HIV/AIDS ou transplante de órgãos,1,2. No entanto, um conjunto muito limitado de drogas antifúngicas disponíveis e o número crescente de relatórios sobre resistência fúngica-lhes contribuam para os grandes problemas em relação a terapêutica de micoses sistêmicas3.

Uma potencial fonte de no....

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Protocolo

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1. soluções e meios de comunicação

  1. Prepare 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suporte, tampão fosfato salino (PBS), caldo de Sabouraud dextrose e ágar de Sabouraud dextrose conforme tabela 1.

2. condições de crescimento do inóculo fúngicas

  1. Armazene todas as estirpes fúngicas como estoques congelados em glicerol de 35% a-80 ° C, até que seja necessário.
  2. Execute as seguintes etapas antes de cada experimento.
    1. Por cepas de Candida albicans :
      1. Descongelar um frasco de estoque e transferir 200 µ l a 10 mL de caldo de Sabouraud dextrose em um tubo de poliprop....

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Resultados

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O MIC é definido como a menor concentração de compostos antimicrobianos que inibe completamente o crescimento fúngico visível no final do período de incubação. Desde que o objectivo do presente protocolo é ter um método rápido de antifúngicos potencial de tela, qualquer bem com clara mídia similar aos poços em branco é considerado um resultado positivo, Considerando que qualquer bem com turbidez análoga dos poços de controle negativo/crescimento considerados negativos. No entanto, se houv.......

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Discussão

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Como testes podem analisar a potencial atividade antifúngica de um alvo composto usando pequenas quantidades do composto e ao mesmo tempo testá-lo em uma gama de concentrações. Nesse sentido, o presente protocolo é recomendado como um primeiro passo na triagem para potenciais novos compostos antifúngicos. O protocolo aqui apresentado é baseado no protocolo M27-A3, inicialmente projetado para auxiliar na seleção da terapia antifúngica em clínicas e pode ser adaptado a uma variedade de novos compostos antifúngicos. Globalm.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos a CAPES-Brasil, Brasil-CNPq, FAP/DF para apoio financeiro. Nós estamos gratos ao Dr. Hugo Costa Paes para a revisão do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meios e Reagentes
Meio RPMI 1640 com l-glutamina, sem bicarbonato de sódioThermo Fisher31800-022
3-(N-morpholino) ácido propano sulfônico (MOPS) (o que a gente usa tem um só dio, completa o nome dele please)Sigma-AldrichUse para tamponar 2X RPMI meio
Cloreto de sódio (NaCl)Dinâ mica1528-1137 mM para solução salina tamponada com fosfato (PBS)
Cloreto de potássio (KCl)J.T.Baker3040-012,7 mM para solução salina tamponada com fosfato (PBS)
Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)Sigma-AldrichV00012910 mM para solução salina tamponada com fosfato (PBS)
Di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4)Sigma-Aldrich602302 mM para solução salina tamponada com fosfato (PBS)
BD Difco Sabouraud caldo dextroseBD238230
BD Difco Sabouraud Dextrose AgarBD210950
GlicerolSigma-AldrichV00012335% para (soluç ã o de estoque? Criopreservaç ã o?)
estérilPara diluiç ã o das drogas na diluiç ã o seriada
Medicamentos antifúngicos
Anfotericina BSigma-AldrichA2942
FluconazolSigma-AldrichF8929
CaspofunginaSigma-AldrichPHR1160
Plásticos
50 mL tubocônicoSarstedt62.547.254
Prato petriJ.Prolab0304-5
Placa de 96 poçosCorning3595
Reservatório de Solução EstérilKASVIK30-208Use para pipetar as soluções usando o pippet multicanal
Equipamento e outros materiais
Microscópio ópticoNikonCentrífuga E200MV
Thermo FisherMegaFuge 16R
IncubadoraEthik Technology403-3DConjunto para 37° C
ShakerNew Brunswick ScientificExcella E25Conjunto para 37° C, 200 RPM
Câmara de contagem de células, NeubauerBOECO AlemanhaBOE 13
Pipeta multicanalHTL5123
Água

Referências

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  1. Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
  2. Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
  3. Pfaller, M. A.

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Reimpressões e permissões

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Etiquetas

Triagem Antif ngicaDilui o SeriadaSuscetibilidade F ngicaConcentra o Inibit ria M nimaPept deos AntimicrobianosCLSI M27 A3Placas de 96 Po osCultura F ngicaContagem Celular

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