Summary
ゼブラフィッシュは、開発中に DNA 複製タイミングを勉強する体内モデル システムとして最近使用されました。ここでは、プロファイル レプリケーション タイミングにゼブラフィッシュ胚を使用してのためのプロトコルの詳細。このプロトコルは、変異体、個々 の細胞の種類、病モデル、および他の種にレプリケーション タイミングを勉強する簡単に適合できます。
Abstract
DNA 複製タイミングが重要な携帯電話の特性、クロマチン構造、転写、DNA 突然変異率と有意な関係を展示です。がん、開発中に発生するレプリケーションのタイミングの変化、発展に果たしている役割のレプリケーション タイミングと疾患は知られていません。ゼブラフィッシュを最近レプリケーションのタイミングを研究する体内モデル システムとして開設ここでは、ゼブラフィッシュを使用して DNA 複製タイミングを判断するプロトコルの詳細。アダルト ゼブラフィッシュ胚から細胞を並べ替え後、次世代シーケンス データの解析による DNA コピー数の変化を調べることによって高解像度ゲノム DNA 複製タイミングのパターンを構築できます。ゼブラフィッシュ モデル システムでは、レプリケーションのタイミング変更、開発全体を通して体内に発生し、個々 の細胞の種類、病モデル、または突然変異系統の変化を評価するためにも使用できます評価ができます。これらのメソッドが開発中に機構と複製タイミングの確立と維持の決定要因を調査し、研究を有効にすると、突然変異と腫瘍形成、摂動の効果を果たしている役割のレプリケーション タイミング開発と疾患にレプリケーション タイミング。
Introduction
正常に分裂する細胞、彼らする必要があります最初正確かつ忠実に複製の全体のゲノム。再現パターンは、DNA 複製タイミングのプログラム1として知られているゲノム重複が発生します。DNA 複製タイミングのクロマチン組織、エピゲノム、遺伝子表現2,3と相関しています。レプリケーションのタイミングの変更、開発全体を通して発生して転写に大幅に関連するプログラムとクロマチン マークと組織4,5に変更。さらにレプリケーション タイミングが変異の頻度と相関して、タイミングの変化が癌6,7,8の様々 なタイプ。これらの観測にもかかわらずメカニズムとレプリケーション タイミング設立と規制の要因はまだほとんど分かっていないとそれが開発に果たす役割と病気は断固としたではないです。さらに、ゲノム全体のレプリケーションでは最近まで脊椎動物の開発中に発生する変更のタイミングのみ検討されていた細胞モデルに。
哺乳類の開発9、多くの類似点と急速に開発の胚の数百のもたらすことができる一つの交配組み合わせ、ゼブラフィッシュ、動脈分布開発中にレプリケーション タイミング生体内研究に適して 10。さらに、ゼブラフィッシュの開発を通して細胞周期、クロマチン組織および DNA 複製タイミング11との関係を共有する転写プログラムに変更があります。ゼブラフィッシュは、また優秀な遺伝モデル、彼らは標的突然変異、突然変異、遺伝子導入による操作に特に適しているし、遺伝的画面は脊椎動物の発生12に必要な多くの遺伝子を識別しました。したがって、ゼブラフィッシュは、複製タイミングの確立と維持に関与する遺伝子を識別するために、脊椎動物の発生にレプリケーション タイミングを規制緩和の効果を確認する使用できます。トランスジェニックは行は、異なる発達縦長や病状を分離した個々 のセルの種類からのレプリケーション タイミングを評価するために使用できます。重要なは、人間の病気病気の形成と進展9,13,14にレプリケーション タイミングの役割を調査するための様々 なゼブラフィッシュ モデルがあります。
最近では、最初のレプリケーション タイミング プロファイルは、ゼブラフィッシュ、複製を生体内で15のタイミングを研究するモデル システムとして確立することから生成されました。これを達成するためには、アダルト ゼブラフィッシュから分離された細胞型、開発の複数の段階でゼブラフィッシュ胚から細胞を採取されました。セルされた FACS (蛍光活性化細胞ソーティング) DNA の内容に基づいて G1、S 相の個体群を分離するによって並べ替えられます。G1 のサンプルを使用すると、コピー数コントロールとして、S 相集団でコピー数変異が決定され、相対のレプリケーション タイミング16を推測するために使用します。レプリケーションのタイミングの変化が直接比較発達の異なるサンプルやセルの種類間、これは生体内で脊椎動物全体で発生するレプリケーションのタイミングで変更を確認する使用されました。このメソッドは、チミジン類似体や免疫沈降 DNA4,6のラベル表示は必要ありませんが、他のゲノムの方法に比べていくつかの利点を主に提供します。
ここでは、プロファイル ゲノム DNA 複製タイミングの時にプロトコルの詳細なゼブラフィッシュの高解像度。これらのプロトコルは、開発中に発生するこれらの関係の変化のプロファイリングと同様、ゼブラフィッシュ ゲノム ゲノムとエピジェネティックな特徴との関係を決定するために使用されています。これらのプロトコルは、ゼブラフィッシュ突然変異系統と疾患モデルにレプリケーション タイミングの変化を勉強するも簡単に合わせられます。さらに、これらのメソッドは、ゼブラフィッシュから個々 のセルの種類を第 1 のソートによって特定のセルタイプにレプリケーション タイミングを勉強する時に拡張できる基盤を提供します。ゼブラフィッシュは、生体内で優れたモデル システムとしてレプリケーションのタイミングを研究し、最終的にこの重要なエピジェネティック特性の生物学的機能を明らかにする使用できます。
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Protocol
すべての動物は、オクラホマ医学研究財団機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従い、取り扱われました。
1 繁殖のため大人のゼブラフィッシュの設定
- 繁殖のための単一の菌株の成人男性と女性のゼブラフィッシュの大規模コホートを使用します。単一の株ものゼブラフィッシュの遺伝子のわずかな違いがあります、結果が人口の遺伝の可変性の代表、人口の小さいサブセットに制限されないようにする大規模コホートを使用します。
- 胚が収集され前に、の晩はタンクを飼育繁殖大人の多数を配置、男性と女性のほぼ同じ番号を使用します。実験によって次の繁殖戦略のいずれかを使用します。
- 育種戦略 1: 個々 の繁殖水槽にいくつかの男性と女性のゼブラフィッシュを配置、分周器を持つ女性から男性を分離します。このアプローチを使用する場合多くの異なった繁殖タンクをセットアップし、それぞれ生物学的変動の人口の代表であることを確認してから胚をプールします。
- 育種戦略 2: 大規模な繁殖水槽にオスとメスのゼブラフィッシュの数十を組み合わせます。この戦略を使用して、胚の十分に大きい数がある、限り、それは従って遺伝子の人口の代表的な創設者のさまざまなから来たと仮定するが妥当。
2. 時間指定交配 - 収集、並べ替え、およびゼブラフィッシュ胚の実験のための住宅
- ライト サイクルの朝にいるとすぐに始まる時間の交配を実行します。一晩に生成される任意の胚を破棄します。
- 脱出する胚の上げ底で、10 分の期間の浅瀬 (3-5 cm) で繁殖する魚ができます。
- 10 分後に、こし器を通って注ぎ洗浄ボトルと 10 cm のプレートに洗浄して胚を収集します。プールのすべての胚が同じ時点で収集されたコレクション、および 28.5 ° C の定温器ですぐに場所の時間でマークを付ける
- 一日に一つの交配組み合わせから胚の数が期待できます。10 分で得られた胚の数が 20 未満になるまでサイクルを飼育する大人を許可します。
- コレクションの並べ替え胚に死者と未受精卵の胚後約 1 〜 1.5 h。胚を並べ替え、インキュベーターから削除し、解剖顕微鏡下で観察します。
- 胚をカウントし、プレート 10 cm あたり 100 の胚の密度で配置します。
- 新鮮な E3 媒体 (5 mM NaCl、KCl、0.17 mM 0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4) を追加し、28.5 ° C の定温器に胚を戻ります。
3. Dechorionate、deyolk、およびゼブラフィッシュ胚を修正
注: プロトコルのこのセクションは、48 h ポスト受精 (hpf) 前に胚のため設計されています。開発の後の段階で胚の絨毛を削除する必要はありません (48 後 hpf)、彼らが多くの場合自然に落ちる。Deyolk または、絨毛を削除する必要はありません古い魚の 5 日後に受精 (dpf)。
- 胚が望ましい発達年齢に達したら、「のゼブラフィッシュ胚開発段階」17によると光顕微鏡形態学的開発の適切な段階を確認します。
- 15 mL の円錐管に 1500 の段階的な胚を転送し、E3 で数回を洗ってください。
- E3 の 1 mL とすべての 100 の胚のプロナーゼ ソリューション (30 mg/mL) の 20 μ L を加えて軽く旋回します。1500 胚まで 15 ml E3 の単管で dechorionated をすることができます。
- チューブを横に置き、容積の比率に最大表面を確保するためも、層胚を手配します。管胚の落ちたすべての絨毛まですべて 2 〜 3 分振ちましょう。合計 dechorionation 時間はプロナーゼ処理によって異なります。
- 上清を除去、E3 の 10 mL で 3 回胚を軽くすすいでください。プロトコルのこのセクションの残りの部分のための氷に胚を配置します。
- E3 を外し、作りたての冷たい deyolking バッファーを持つ胚を洗う (ギンツブルグ魚リンゲル液、カルシウムなし x 0.5: 55 mM の NaCl、KCl、1.8 mM 1.25 mM NaHCO3)。
- 最大 500 の胚の冷たい deyolking バッファーの 1 つの mL を追加します。
- P1000 を使用して優しくピペットの胚を上下 5-10 倍に卵黄の袋を混乱させます。
- 1 mL を転送すると、1.5 mL および microfuge の管および 4 ° C と 500 × g で 5 分間遠心します。
- 1 mL の氷冷 1x PBS (リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.0) リンゲル液を削除すると上清と洗ってペレットを削除します。4 ° C で遠心して 5 分間 500 × g。
- 慎重に上清を除去し、1 mL の 1x PBS で細胞を再懸濁します。氷の上の管を配置します。
- 15 mL の円錐管に 3 mL の氷冷エタノール (エタノール) を追加します。低設定の上に優しく EtOH の渦管。
- 優しく P1000、ゆっくり (1 秒あたり 1 滴) 点滴ゼブラフィッシュ胚細胞懸濁液エタノールにボルテックス中を使用しています。
- 胚細胞懸架装置、75% の最終的な固定液の 1 mL の合計を追加江藤。
- 後 1 mL の細胞懸濁液が追加されました、優しく渦巻管をミックスし、少なくとも 1 時間-20 ° C で。容積の比率に最大の表面を確認し胚と一緒に固執する細胞の数を減らす彼らの側にチューブを配置することをお勧めします。2-3 週間の-20 ° C で胚細胞を格納します。
4. 染色の DNA、FACS 胚を並べ替え
注: プロトコルのこのセクションは 1 dpf で胚のために設計されています。
- -20 ° C から 4 ° C 1500 x g で 5 分間遠心からエタノール固定胚細胞を削除します。
- 氷と慎重に削除上清にチューブを置きます。P1000 を使用して、優しく作りたて冷 PBS-BSA (1 x PBS, 1% ウシ血清アルブミン) の 1 mL の細胞を再懸濁します。
- 4 ° C で 5 分間 1500 x g 細胞を遠心し、氷の上に配置。
- 削除上清と再懸濁します propidium ヨウ化 (PI) の染色液 (50 μ G/ml の PI、100 μ g/mL RNase A PBS、pH 7.0)、使用して細胞 200 μ L すべての 1000 の胚のため。
- PI ソリューション優しく 5 分ごとを混合氷の上で 30 分間のインキュベートします。
- 氷の上の 50 mL の円錐管に 40 μ m ナイロン セル ストレーナーを配置します。優しくミックス メッシュをフィルター処理して細胞をピペットします。
注: 同じ timepoint から胚の複数のチューブは、プロトコルのセクション 3 で収集された場合を組み合わせてこれらの胚この時点でこと彼らがすべて一緒に並べ替えられるようにします。 - シリンジのプランジャーの終わり中フラットを使用して、優しくメッシュ上のセルのすべての残りの塊を混乱させます。
- すべての 1000 の胚の冷 PBS BSA の 500 μ L でフィルターを通して細胞をすすいでください。
- 氷の上の 15 mL の円錐管に 40 μ m メッシュを置き、15 mL チューブに 2 回目の 50 mL の円錐管から細胞懸濁液をフィルター処理します。
- 楽器を並べ替え、適切なセルを使用すると、561 nm と排出量 610/20 propidium ヨウ化物イオンを検出する検出するレーザー励起を設定します。
- ボルテックスと 4 ° C で楽器の場所で簡単にステンド グラスの細胞のミックス 15 mL チューブ
- 低速流でセル レート、きれいな細胞周期のプロファイルを取得し、G1 の混合を避けるのため理想的に 1.0 mL/分、または S と G2/M 細胞相人口を実行します。
- まず、FSC A x SSC のゲート-(側の散布面積によって前方散乱領域) 残骸 (図 1 a) を削除します。
注: 胚から細胞をステージと細胞の種類によってサイズ変化することができます。中立的な密度 (ND) フィルターは、1.0 および 1.5 細胞存在のサイズに応じて切り替える必要があります。ほとんどの細胞を収集し、破片を除去する広範囲をゲートします。 - 第二に、ゲート SSC 地域 (SSC A) を PI エリア (PI-A) を残骸および細胞ダブレット (図 1 b) を削除します。
- ため第三に、ゲート SSC の SSC w (幅) を残りの細胞ダブレット (図 1) を削除します。
- Y 軸と propidium ヨウ化領域にセル数 (count) とヒストグラムのゲート個体群を表示 (PI A) x 軸に。24 hpf 胚のこれは図 1のようにステレオタイプの細胞周期のプロファイルを与える必要があります。
- S 相人口を並べ替えるには、G1 と G2 の集団ののみ最小限の量を含む、G2 ピークの左側に G1 ピークの右側からゲートを設定します。24 の hpf 胚は、これは通常ゲートの人口の約 10-15% を構成する (図 1を参照)。
- G1 人口を並べ替えるには、ピークの上を渡すが、G1 ピークの左側にある門を設定します。可能な限り狭く G1 ゲートの幅を調整する (図 1を参照)。
- ゲート G1 および適切な初期ゲート (図 1E) を確保するため S 相集団をバックアップします。
- PBS BSA の 3 mL と 15 mL の円錐管に G1、S 相の集団を並べ替えます。目標は、分数 (G1、S 相) あたり 500,000 と 100 万以上の並べ替えセル間を取得するはずです。
- 並べ替えの完了後遠心分離機管 1500 g x と 10 分のための 4 ° C での。
注: 小細胞ペレットは見えにくくなるが、それを中断することを避けるので、できれば固定角ローター上スイング バケツ ローター使用することが重要。 - 慎重に上清を除去し、1 mL の 1x PBS でペレットを再懸濁します。1.5 mL および microfuge の管と 5 分間遠心する 6,000 x g で 4 ° C のセルに転送します。
- 慎重にチューブからすべての液体を削除し、-20 ° C で乾燥ペレットを凍結2-3 週間の-20 ° C でペレットを格納します。
5. DNA の隔離、RNase 処理, および DNA の浄化
- -20 ° C から氷の上の場所から細胞ペレットを削除します。
- SDS バッファー (50 mM トリス-HCl (pH 8.0)、10 ミリメートルの EDTA、1 M の NaCl、0.5 %sds) にペレットを再懸濁しますの 400 μ L を追加します。
- 最終濃度 0.2 mg/mL にプロティナーゼ K、ボルテックスによって簡単に混ぜます。
- 56 ° C 2 時間、渦 15 分毎にサンプルをインキュベートします。
- 2 時間後にフェノール-クロロホルム抽出法を実行するために、フェノール-クロロホルム (10 mM トリス、pH 8.0、1 mM EDTA で飽和フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール 25:24:1) の 400 μ L を追加します。
- 別の段階に 5 分間 16,000 x g で 20 s と遠心分離機のサンプルの渦。
- 上層の水相 (400 μ L) と 1.5 mL チューブへの転送を慎重に取り外します。
- 座礁を実行するには、40 μ L の 3 M 酢酸ナトリウム (pH が 5.2)、グリコーゲン、2 μ L とエタノール 1 mL を追加します。
- 徹底的にミックスし、DNA を沈殿させる一夜に-20 ° C で渦。-80 ° c または 1 h のドライアイス、サンプルを沈殿もすることができます。
- 4 ° C およびペレット DNA を 30 分間 16,000 × g で遠心分離機のサンプルです。
- 破棄上清と洗ってペレット 1 mL 70 %etoh。4 ° C で遠心して 5 分間 16,000 x g。
- 2-3 分のため周囲温度で上澄みと空気乾燥ペレットを破棄します。
- オートクレーブ養生水の 96 μ L でペレットを溶解し、RNase A の 4 μ L (2 mg/mL) を追加します。
- ボルテックスでよく混ぜるし、37 ° C 1 時間インキュベートします。
- フェノール-クロロホルム抽出を実行するには、手順 5.2.1 - 5.2.2 で 100 μ L のフェノール クロロホルムおよび次の手順を追加します。
- 3 M 酢酸ナトリウム、1 μ L グリコーゲンおよび EtOH、5.3.5 5.3.1 - の手順で手順の 250 μ L の 10 μ L 追加して座礁を実行します。
- TE バッファー (10 mM トリス-HCl (pH 8.0) 10 mM EDTA (pH8.0)) の 60 μ L でペレットを再懸濁し、定量的蛍光法を用いた DNA 濃度を決定します。-20 ° C で DNA ストア
注: DNA 結合の蛍光染料、または紫外線分光器ベースのメソッドより信頼性の高い他の手段を使用して DNA を定量化することが重要です。
6. DNA ライブラリと次世代シーケンシングの準備
注: G1 コピー番号参照サンプル ソースごとに生物がシーケンスの実行 (すなわちWT、変異、遺伝子、細胞など) ごとに必要です。同じ G1 参照に実行同じシーケンスで同じ生物的源からすべての S 相試料を比較します。各サンプルのサンプル間の一貫性を確保するための少なくとも 2 つの生物学的複製を実行します。
- 50 μ L と超音波処理のための特殊な管への転送の最終巻に DNA の 1 μ g を希釈します。
- メーカーの仕様やプロトコルによると、集中 ultrasonicator で 250-300 bp のターゲットのゲノム DNA をせん断します。
- メーカーの仕様やプロトコルに従っての自動電気泳動装置を用いたせん断のゲノム DNA の品質とサイズを確認します。250 〜 300 の大きなピークがあるを確認する傾斜されたゲノム DNA の bp。
- 製造元のプロトコルに従ってイルミナ プラットフォームの配列の多重 oligos と DNA ライブラリの準備キットを使用してシーケンス ライブラリを準備します。
- 製造元のプロトコルに従って自動電気泳動装置を用いたライブラリの準備の質を確認します。400 ~ 450 の大きなピークがあることを確認、bp、プライマー二量体 (80-85 bp) とアダプター ダイマーの最小限のピーク (〜 120 bp)。
- 製造元のプロトコルによると、次世代 DNA シーケンシングの DNA ライブラリ定量キットを使用してライブラリを定量化します。
- 5 nM とコンバインの集中ライブラリの 15 μ L 希釈は一意に必要な達成するために必要なライブラリを多重化マッピング サンプル当たりの数を読みます。
注: サンプルごと一意にマッピング読み取りの数は、解像度を決めます。500 万マップとして、ほとんどの使用は、ゼブラフィッシュ ゲノムにレプリケーション タイミングを評価するために読み取りません。1000 万の読み取りを開始することをお勧めします。 - 製造元の指示に従って次世代シーケンシング プラットフォームでペアエンド 100 bp 全ゲノム DNA 配列のサンプルを実行します。
7. シーケンス データの解析
注: このセクションの手順は、分析のためのガイドラインとしてものです。シーケンス配置、フィルタ リング処理等のための追加のメソッドを使用します。プロトコルのこのセクションは、この作品の分析の方法に対応いたします。追加のメソッドを使用する場合は、パラメーターとそれらの目的に合わせて機能を調整します。以下のコマンドは、適切なパッケージがインストールされた Ubutnu または Mac ターミナルに入力されます。
- ゼブラフィッシュ ゲノムの最新バージョンを取得 (danRer10、このプロトコルが書かれた時点) 次のコマンドを使用して UCSC のゲノムのブラウザーから。
wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz- 次のコマンドを使用して fa.gz ファイルを解凍します。
gunzip danRer10.fa.gz - BWA mem コマンドを使用を用いたゲノム配列データを配置します。
bwa mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
- 次のコマンドを使用して fa.gz ファイルを解凍します。
- .Sam ファイルを以下のコマンドで samtools を使用して .bam ファイルに変換します。
samtools 表示 bS input.sam > output.bam- 以下のコマンドで samtools を使用して一直線に並べられたシーケンス ファイルを並べ替え。
samtools ソート output.bam > output_sorted.bam - 以下のコマンドで samtools を使用して .bam ファイルをインデックスします。
samtools インデックス output.bam
- 以下のコマンドで samtools を使用して一直線に並べられたシーケンス ファイルを並べ替え。
- ピカールは、次のコマンドを使用して、マーク PCR を複製します。
java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \
INPUT=input.bam
OUTPUT=output.bam
REMOVE_DUPLICATES = false
METRICS_FILE=output_metrics.txt - 次のコマンドを使用して各染色体の読み取りのテキスト (.txt) ファイルを生成します。
私のための {1.25};クロームを行う ="chr"$i;エコー $CHROM;samtools input.bam $CHROM を表示 |カット -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr {i} $.txt完成です
注: 結果の .txt ファイル内の列は、フラグ、場所、mapQ、chr、ペアの場所、およびフラグメント サイズのペアをそれぞれ。 - Matlab (またはその他の同様のソフトウェア) の textscan 関数を使用して .txt ファイルを読み取る。
- 30 の mapQ のしきい値を設定することによって低マッピング品質読み取りをフィルター選択します。
- プライマリ配置、PCR の重複、または別の染色体に組マッピング フラグと読み取りを削除します。
- 2000 bp の距離のしきい値を超えて自分のペアを任意の読み取りをフィルター選択します。
- 統計、報道、挿入サイズおよび質 (図 2) の数を決定する結果の読み取りの統計を評価します。
- 各染色体の長さにわたって 100 bp 間隔の読み取りの数を数えることによって各サンプルの 100 bp 固定ウィンドウで読み取り範囲を決定します。
- 中央値を読むすべてのウィンドウの数を計算します。
- 中央値から標準偏差が 5 より大きい windows を削除することによって高い範囲の領域を除外します。
- スライディング ウィンドウを使用して 200 の読み取りと各染色体のセグメントを見つけることによって G1 標準試料の分析のための領域を定義します。
- 付属の G1 参照に対して定義されている 200 読み取りカウント ウィンドウで S 相の読み取りの数を数えることによって各 S 相サンプルの読み取りの深さを決定します。
- 10-16の補間係数 (p) を使用して、ソフトウェアで csaps 関数を使用して、生データを滑らかに。
- Z スコアが 0 の意味と 1 の標準偏差に平滑化されたデータを正規化します。
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Representative Results
タイミング データをパブリッシュされたレプリケーションを使用すると、代表的なレプリケーション タイミング プロファイルと品質への取り組みは、15が提供されます。処理の最初の手順は、ゲノム、読み込む長さとゲノム カバレッジの統計情報を計算して、対になっていない低品質をフィルタ リングし、PCR 重複読み取りシーケンス データの配置を含みます。典型的なゼブラフィッシュ シーケンス サンプルの読み取りの統計情報は、図 2のとおりです。フィルター処理後カウントは可変ウィンドウ サイズおよびデータで決定されます読み取りは平滑化、正規化します。図 3 aは、代表ゼブラフィッシュ染色体生物の複製のための典型的な平滑化正規化のレプリケーション タイミング プロファイルを示しています。生物学的および実験的複製のプロファイルで視覚的に非常に似ている (図 3 aを参照)、また染色体 (図 3 b) の長さに沿って高い相関を表示します。また、タイミング値ゲノム (図 3) の間の高い相関関係を表示する必要があります。自己相関、パターンの連続性を評価するためにメソッドを使用して、データ セット (図 3 D) の構造の程度を評価ください。構造化された成熟したタイミングのプログラムの自己相関が短い距離で高くなるし、距離が長くなると徐々 に減少します。生物学と実験の再現性の高いを示すサンプルを複製して組み合わせて高いカバレッジ サンプルを入手することが強い自己相関信号高品質のサンプルとして考慮されるべき。
図 1: レプリケーション タイミング解析のゼブラフィッシュ胚を選別します。(A) 前方散乱領域の並べ替えのすべてのセルの人口をゲート側の散布面積によって (FSC A) (SSC-A)。色は、赤、緑、青に至る色によって表される高-低密度ドット プロットの bin の密度を表します。(B) に並べ替えゲート FSC x SSC セルの人口をゲート propidium ヨウ化領域で SSC の PI A)。(C) ゲートのゲート PI 細胞 x SSC の人口 SSC-A 面散布幅 (SSC W)。ステレオタイプ的な細胞周期のプロファイルを表示するゲートのすべての人口の (D) のヒストグラム。並べ替えゲート G1 と S の段階でセルが灰色の網掛けで表示されますは、黒い線で箱入り。(E) Backgated G1、S 相の個体群は、初期ゲーティング セルの大半を取得すると表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 配列を読む典型的なゼブラフィッシュ サンプルの統計情報。(A) リアップ mapQ 値の統計量から質をマッピングします。(B) すべてのシーケンスに挿入サイズ分布のヒストグラムを読み取ります。(C) 総割り当てられた読み取り、読み取りの統計情報を読み取ります低品質フラグを含む別の染色体へのマッピングのペアを読み取ります (ペア diff chr)、距離のしきい値 (遠いペア), と PCR 重複以外のペアを読み取ります。(D) 合計の代表番号はマップ、マップされていないと対になっていない読み取り、カバレッジとゼブラフィッシュ サンプルの典型的なシーケンス実行のため解像度を読みます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 代表ゼブラフィッシュ複製タイミング結果と品質への取り組み。(A) レプリケーション代表の長さに沿って染色体 28 hpf 胚 (Siefert、2017) の 2 つの生物学的複製のタイミングします。(B) 生物の代表的な染色体の長さに沿って 2 Mb windows にレプリケーション タイミング値の相関を図 3 aに示すように 28 の hpf 胚のレプリケートします。(C) ゲノム生物 (rep1 と表示 rep2) にレプリケーション タイミング値と 28 の hpf 胚の実験 (rep3) 複製の相関。カラー マップは、ピアソンの相関係数を表します。(D) 自己相関構造の成熟したタイミングのプログラムの漸減してますます長い距離以上近い距離で高い相関が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ゼブラフィッシュでは、DNA 複製タイミングを勉強する新しい、ユニークな体内モデル システムを提供します。時限を行うときはこの実験的プロトコルの詳細は、その胚の何千もを実験のため 1 日で集めることができます。これらの胚は、開発の正確にタイミングとはっきりと特徴付けられる段階を通じて同期的に開発します。ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュ胚は外部開発、光学的に透明に、顕微鏡を用いて形態で容易にかつ正確にステージングできます。このプロトコルは、脊椎動物全体のレプリケーション タイミングを勉強するゼブラフィッシュ胚の使用を詳しく説明します。
ゼブラフィッシュ胚の同期開発、準備、FACS の並べ替え、およびライブラリの準備の間に細胞の損失を確保する問題を提示する可能性がありますプロトコルの領域が含まれます。ゼブラフィッシュの開発のタイミングは温度依存、したがって使用ゼブラフィッシュの明暗サイクルに適応し、実験 28.5 ° C であります。同期の開発をように正確に時限交配を実行し、非常に小さな時間 windows で胚を収集 (10 分以下)。28.5 ° C で胚を維持し、彼らは周囲温度で最小限の時間を過ごすことを確認する重要です。ゼブラフィッシュの開発のタイミングは与えられた領域で胚の密度に大きく依存しています。プレート 10 cm あたり 100 胚よりも高い密度でない家胚に重要な彼らが正常に発達しません。死者と未受精卵の胚を削除する最適な時間は、彼らは 4-16 細胞期に進展しているし、受精 (「のゼブラフィッシュの胚の開発の段階」17ガイドとして使用) として容易に識別できます。死胚は通常黒のボールとして表示されます、未受精卵の胚が 1 セルとして表示されます。周囲温度での時間を減らすことできるだけすぐに動作します。
とき dechorionating の胚は、胚からすべての絨毛が削除されることを確認することが重要です。ほとんどの絨毛がオフに来るまでは、胚プロナーゼ ソリューションにしてください。絨毛そのままで残りの胚を破棄または鉗子での絨毛を削除します。ゆっくりと滑らかな動きを用いた胚をピペットします。それは過度のストレスや細胞の損失の結果にセルを対象としては急速にピペットないです。また、細胞の破損の結果増加のせん断応力が生じると P200 を使用しないことが重要です。逆に、プラスチック転送ピペットには十分に小さい穴または十分に卵黄の袋を混乱させると、細胞の分解および十分な剪断応力を提供するがありません。代替のピペットはボアが提供される可能性があり、せん断は最適な P1000 に相当するでしょう。
とき並べ替え 28 FACS hpf、ステレオタイプ的な細胞サイクル プロファイル場合が得られない、G1 のピークが約 50 K を中心とした PI レーザーの電圧を調整します。FSC と SSC の利益ゲーティングと細胞集団は、図 1のようになるように調整する必要があります。難易度がまだの場合は、ND フィルターを交換する必要がありますと細胞の大半を確保するため調整 FSC と SSC の電圧がゲート。PI A のダブルスを近似する範囲があるだろう、PI 染色があるかどうかは明らかであるべきヒストグラムが表示されます 2 つの明確なピーク、G1 細胞の DNA を 2 n に大きなピーク、二重の強度でより小さいピーク 4N DNA の G2/M 細胞のコンテンツ。これがまだ得られない場合のままなセル、PI の染色の問題や固定問題低い数字ありますか、プロトコルがそれに応じて最適化する必要があります。
初期胚から細胞 (10 の前に hpf)、S 段階にこれらの細胞の割合が高い、典型的な細胞周期のプロファイルを与えることはありません。これらのサンプルは、S 相試料として扱われ 24 hpf 胚から G1 の参照と比較することができます。10 間の胚 hpf と 24 hpf 中間細胞周期プロファイルを与える可能性があります、必要な場合に並べ替えることができます。S 期の人口はまた識別し、固定する前に簡単なパルスでエドゥ (5-エチニル-2'-デオキシウリジン) など BrdU チミジン類似体を組み込むことによって並べ替えられます、しかし、これは正確な定量必要はありません。複製のタイミング。
理想的には 1 μ g の DNA を持つライブラリの準備を始めなければなりません。理論的に 300,000 〜 細胞は約 1 μ g の DNA をもたらすだろう (推定 ~3.3 pg/核)、ただし、プロトコル全体の損失は常に。500,000 に 100 万並べ替えられた細胞は、DNA の以上 1 μ g を与える必要があります。典型的な 24 hpf 胚でお越しの際にも約 18,000 細胞、S 期で 10-15% になります。開発の初期段階に胚がかなり少ない細胞が、S 期の細胞の割合が高い。
ライブラリの準備から不要な要素を排除するため、正確な浄化と磁気ビーズを用いたサイズ選択を実行することが重要です。製造元の指示に慎重に従ってくださいし、さらなる最適化が必要になる場合があります。PCR ダイマーの少量は通常主要な問題ではないが、彼らは最小限で済みますのでアダプター ダイマーが非常に効率的にシーケンスします。これは、DNA の比率、初期のアダプターを調整してライブラリの準備時に正確なサイズ選択を行うによって達成することができます。
シングル エンド配列実験ニーズに合わせて適切な場合もあります。シングル エンドは安価でありこのアプローチは読み取り回数のカウントに依存しているために、必要な情報のほとんどを提供しますペアエンドでは、PCR と光の重複を削除する反復配列と他の構造変化 (これはゼブラフィッシュのゲノムの共通) の領域を解決する高い能力を提供します。ペアエンド シーケンス読み取りのみに以下の分析部分が対処します。短い配列読み取りが適切な場合があります。これは低コストで読み取り数の増加を提供します、読み取りがマップするより難しいかもしれません。100 bp の読み取り、解析部分の下が最適化され、調整リード長を短くしている場合必要があります。
このプロトコルも簡単にゼブラフィッシュ モデルを使用するために適応することができます。それは既に使用されています、ゼブラフィッシュ テールフィン線維芽細胞 (ZTF 細胞) の分析一次電池文化ライン大人ゼブラフィッシュ テールフィンから分離されました。ゼブラフィッシュから分離された細胞の種類を勉強するに特定して染色、DNA の内容を並べ替えする前に個々 のセル型を分離遺伝子マーカーを使用できます。1 つの潜在的な戦略は、FACS 並べ替え、続いて固定および DNA 量の並べ替えによって細胞を分離ティッシュ特定の促進者と最初に蛍光マーカーを表現するトランスジェニック ラインを使用するでしょう。また、G1、S 相の人口と同様、個々 のセルの種類の同時分離細胞透過性 DNA 染料を使用できるように。この議定書これらの適応可能性も他の生体内でのモデルにレプリケーション タイミング研究を有効にします。
このプロトコルの将来の使用のための刺激的な可能性は、病にレプリケーション タイミングの役割を研究することです。ゼブラフィッシュ、いくつか自然と他の誘導で発癌中にレプリケーション タイミングの変化が発生するときを決定するために使用できるいくつかの癌モデルがあります。これは癌と病気の進行で果たしている役割のレプリケーション タイミングの評価となります。さらに、ゼブラフィッシュは薬剤スクリーニングのための優れたモデル、がん治療で使用する可能性があるレプリケーション タイミング規制に影響を与える薬剤を識別するために使用することができます。
ゼブラフィッシュは、レプリケーションのタイミングを研究する有望な新しいモデルです。このプロトコルは多くの人にこのモデルの開発と疾患にレプリケーション タイミングの役割を研究で利用することを余裕します。このプロトコルは、生体内で発達モデルなど他のシステム、キイロショウジョウバエ、アフリカツメガエル、これらおよび他の有機体から見て以降に調査結果で使用するために合わせることができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作業によって支えられた国立医学研究所全般を通じて健康の国民の協会の 5P20GM103636-02 (フローサイトメトリー コア サポートを含む) と 1R01GM121703、助成金し、同様、オクラホマ センターから成体幹細胞のための賞研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
