Summary
Данио рерио недавно использовались как в естественных условиях система моделей для изучения времени репликации ДНК в процессе разработки. Вот подробные протоколы для использования данио рерио эмбрионов для синхронизации репликации профилей. Этот протокол может быть легко адаптирована для изучения времени репликации в мутантов, типы отдельных клеток, болезни моделей и других видов.
Abstract
Синхронизация репликации ДНК является важной характеристикой сотовой, экспонирование существенные отношения с Структура хроматина, транскрипция и скорости мутации ДНК. Изменения в сроках репликации происходят во время разработки и в рак, но времени репликации роль играет в развитии и заболевания не известна. Данио рерио недавно были созданы как в естественных условиях модель системы для изучения времени репликации. Вот подробные протоколы для использования данио рерио для определения сроков репликации ДНК. После сортировки клеток эмбрионов и взрослых рыбок данио, могут быть построены с высоким разрешением шаблоны времени репликации ДНК генома общесистемной путем определения изменений в ДНК копировать количество путем анализа последовательности данных следующего поколения. Данио рерио модель системы позволяет для оценки изменений времени репликации, которые происходят в естественных условиях на протяжении развития и может также использоваться для оценки изменений в типы отдельных клеток, модели заболеванием или мутантных линий. Эти методы позволят исследования, изучение механизмов и детерминанты репликации сроков создания и обслуживания во время разработки, сроки репликации роль играет в мутации и tumorigenesis и последствия нарушается время репликации по развитию и болезни.
Introduction
Для клетки к делению успешно они должны сначала точно и добросовестно повторить их весь геном. Геном дублирования в шаблоне воспроизводимость, известный как ДНК репликации сроки программы1. Синхронизация репликации ДНК соотносится с организации хроматина, эпигенетических меток и ген выражение2,3. Изменения в сроках репликации происходят на протяжении всего развития и значительно, относящиеся к транскрипционный анализ программ и изменения знаков хроматина и организации4,5. Кроме того репликация сроков связан с мутационного частот, и изменения в сроках наблюдаются в различных видах рака6,,78. Несмотря на эти замечания механизмы и факторы репликации сроков создания и регулирования по-прежнему в основном неизвестны и роль он играет в развитии и болезнь является неопределенным. Кроме того до недавно генома репликацией времени изменения, которые происходят на протяжении всего развития позвоночных только были изучены в модели культуры клеток.
Данио рерио, данио рерио, хорошо подходят для изучения репликации сроков в vivo во время разработки, как брачные пары может принести сотни эмбрионов, которые развиваются быстро с много сходства с млекопитающих развития9, 10. Кроме того на протяжении развития данио рерио, есть изменения клеточного цикла, организации хроматина и transcriptional программы, использующие отношения с ДНК репликации времени11. Данио рерио являются также отличным генетическим модели, как они особенно поддаются манипуляции трансгенез, мутагенеза и целевых мутации, и генетические экраны определили многих генов, необходимых для развития позвоночных12. Таким образом данио рерио может использоваться для идентификации генов, участвующих в репликации сроков создания и обслуживания и наблюдать последствия дерегулирования времени репликации на позвоночных развития. Трансгенные линии может также использоваться для оценки времени репликации из типов клеток отдельных, изолированных в различные области развития timepoints, или в условиях заболевания. Важно отметить, что существуют различные модели данио рерио болезней человека, который может использоваться для изучения роли репликации сроков в болезни формирования и прогрессии9,,1314.
Недавно первый профили синхронизации репликации были получены от данио рерио, утвердив его в качестве модельной системы для изучения времени в vivo15репликации. Для этого, клетки были собраны от zebrafish эмбриона на нескольких стадиях развития и в типе ячейки, изолированных от взрослых рыбок данио. Клетки были затем сортируются по СУИМ (сортировки активирован флуоресценции клеток) на основе содержимого ДНК для изоляции населения фазы G1 и S. Используя пример G1 как элемент номер копии, скопируйте номер вариации в S-фазе населения были определены и используются для определения относительной репликации времени16. Изменения в сроках репликации можно непосредственно сравнить между различными развития образцов и типов клеток, и это было использовано для определения изменения в репликации сроков, которые происходят в естественных условиях на протяжении развития позвоночных. Этот метод предлагает несколько преимуществ над другими геномной методами, главным образом что оно не требует маркировки с тимидина аналогов или иммунопреципитации ДНК4,6.
Вот подробные протоколы к профиль ДНК генома общесистемной репликации сроков на высокого разрешения в данио рерио. Эти протоколы были использованы для определения отношения с геномных и эпигенетических функций в геноме данио рерио, а также профилировать изменения в этих отношениях, которые происходят на протяжении всего развития. Эти протоколы являются также легко адаптируется к изучать изменения в сроках репликации в мутантных штаммов данио рерио и модели заболеванием. Кроме того эти методы предоставляют основу, которая может быть расширена после изучения времени репликации в типах конкретных клеток, сортируя первый из типов индивидуальных клеток от данио рерио. Данио рерио может служить отличным в vivo модель системы для изучения времени репликации и в конечном итоге выявить биологические функции этой важной чертой эпигеномные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные были обработаны в строгом соответствии с протоколами, утвержденных Оклахома медицинских исследований Фонда институционального животное уход и использование Комитетом.
1. Настройка взрослых рыбок данио для разведения
- Используйте большой когорты взрослых мужчин и женщин данио рерио одного штамма для разведения. Есть небольшие различия в генетической данио рерио даже одного штамма, использовать большой когорты чтобы убедиться, что результаты представитель генетическая изменчивость населения и не ограничивается небольшим подмножеством населения.
- В ночь перед эмбрионы будут собраны, место десятки взрослых разведения в разведение танков, использовать примерно равное количество мужчин и женщин. В зависимости от эксперимента используйте одну из следующих стратегий селекции.
- Разведение стратегия 1: место несколько данио рерио мужского и женского пола в отдельных разведения танков, отделить самцов от самок с разделителем. Если используется этот подход, установки много различных племенных танков и бассейн эмбрионы от каждого, чтобы убедиться, что биологическая изменчивость является представитель населения.
- Разведение стратегия 2: объединить десятки данио рерио мужского и женского пола в крупных племенных танк. Использовать эту стратегию, пока существует достаточно большое количество эмбрионов, это разумно предположить, они пришли из различных учредителей и поэтому генетически представителя населения.
2. Временный вязки - сбор, сортировка и жилье zebrafish эмбриона для экспериментов
- Выполнение запланированных вязки, начиная, как только свет циклов, в первой половине дня. Отменить любые эмбрионов, созданных на ночь.
- Разрешить рыбу разводить в мелкой воде (3-5 см) в течение 10 мин, с дном false для эмбрионов бежать через.
- После 10 минут собирайте эмбрионов, наливание через сито и промывки в 10 см пластины с бутылкой мыть. Бассейн, все эмбрионы собираются в той же точке времени, Марк их со временем сбора, и место немедленно в инкубаторе на 28,5 ° C.
- Сотни эмбрионов можно ожидать от одной брачные пары в день. Разрешить взрослых развести в 10 мин циклов до тех пор, пока количество эмбрионов полученных не менее двадцати.
- Примерно 1-1,5 ч после сбора, сортировка эмбрионов для удаления мертвых и неоплодотворенных эмбрионов. Чтобы отсортировать эмбрионов, удалите из инкубатора и наблюдать под микроскопом рассечения.
- Количество эмбрионов и место на плотность 100 эмбрионов на 10 см пластины.
- Добавить свежие среднего (5 мм NaCl, 0.17 мм KCl, 0,33 мм2CaCl, 0,33 мм MgSO4), E3 и вернуться в инкубаторе 28,5 ° C эмбрионов.
3. Dechorionate, deyolk и исправить zebrafish эмбриона
Примечание: Этот раздел протокола предназначен для эмбрионов до 48 h пост оплодотворение (hpf). Существует не нужно удалять chorions эмбрионов на более поздних стадиях развития (после 48 hpf), как они часто естественно упасть. Нет необходимости deyolk или удалить chorions рыбы старше 5 дней после оплодотворения (dpf).
- Когда эмбрионы достигают желаемого развития возраста, убедитесь в надлежащей стадии развития морфологически под микроскопом света согласно «Стадий эмбрионального развития Zebrafish»17.
- Передача до 1500 поставил эмбрионов до 15 мл Конические трубки и промыть несколько раз с E3.
- Добавить 1 мл E3 и 20 мкл раствора Проназа (30 мг/мл) на каждые 100 эмбрионов и слегка взболтать. До 1500 эмбрионы могут быть dechorionated в одной трубке с 15 мл E3.
- Положите трубку на бок и организовать эмбрионов ровным слоем для обеспечения максимальной поверхности соотношение объема. Аккуратно агитируйте трубки, каждые 2-3 мин до всех chorions упали офф эмбрионов. Общая dechorionation время будет варьироваться в зависимости от активности Проназа.
- Удалить супернатант и осторожно промойте эмбрионы 3 раза с 10 мл E3. Место эмбрионов на льду для оставшейся части этого раздела протокола.
- Удаление E3 и мыть эмбрионов с буфером свежеприготовленные ледяной deyolking (0,5 x раствор Рингера Гинзбург рыбы, без кальция: 55 мм NaCl, 1.8 мм KCl, 1,25 мм NaHCO3).
- Добавьте 1 mL ледяной deyolking буфера до 500 эмбрионов.
- С помощью P1000, нежно Пипетка эмбрионов вверх и вниз 5 - 10 раз для нарушить желточного мешка.
- Передача 1 мл 1,5 мл отцентрифугировать и центрифуги на 4 ° C и 500 x g 5 мин.
- Удалите супернатант и мыть лепешка с 1 мл ледяной ПБС (фосфатный буфер, pH 7.0), чтобы удалить раствор Рингера. Центрифуга на 4 ° C и 500 g x 5 мин.
- Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте клеток в 1 мл ПБС. Место труб на льду.
- Добавьте 3 мл ледяной этанола (EtOH) 15 мл Конические трубки. Вихревой трубка EtOH мягко на низкое.
- Аккуратно с помощью P1000, медленно (1 капля в секунду) капельного zebrafish эмбриона суспензию клеток в EtOH во время vortexing.
- Добавить в общей сложности 1 мл суспензии клеток эмбриона, для окончательной фиксации решения 75% EtOH.
- После 1 мл ячейки подвеска был добавлен, нежно трубки вихрем перемешать и место при-20 ° C для по крайней мере 1 час. Рекомендуется разместить труб на их стороне для обеспечения максимальной поверхности соотношение объема и уменьшить количество эмбрионов и клетки, которые склеиваются. Хранить клетки эмбриона при-20 ° C на 2-3 недели.
4. окрашивание ДНК и СУИМ, сортировка эмбрионов
Примечание: Этот раздел протокола предназначен для эмбрионов на 1 dpf.
- Удаление EtOH Исправлена зародыша клетки от-20 ° C и центрифуги на 1500 x g 4 ° C за 5 мин.
- Место труб на льду и тщательно удалить супернатант. С помощью P1000, нежно ресуспензируйте клеток в 1 мл свежеприготовленные холодной PBS-BSA (ПБС, альбумина bovine сыворотки 1%).
- Центрифуга клетки на 4 ° C и 1500 g x 5 мин и место на льду.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в пропидий йодидом (PI) окрашивание раствора (PBS PI, 100 мкг/мл РНКазы A, 50 мкг/мл, pH 7.0), используя 200 мкл на каждые 1000 эмбрионов.
- Позволяют клеткам инкубировать в растворе PI для 30 минут на льду, аккуратно смешивая каждые 5 мин.
- Место стрейнер клеток нейлон 40 мкм на 50 мл конические на льду. Аккуратно Пипетка клетки перемешивают и процеживают через сетку.
Примечание: Если несколько трубок эмбрионов от же timepoint были собраны в разделе 3 протокола, объединить эти эмбрионы на данный момент так, что они все сортируются вместе. - С помощью плоского внутри конце поршень шприца, аккуратно сорвать любые оставшиеся сгустки ячеек сетки.
- Промойте клетки через фильтр с 500 мкл холодной PBS-BSA на каждые 1000 эмбрионов.
- Поместите сетку 40 µm 15 мл конические на льду и фильтрации суспензии клеток с 50 мл Конические трубки во второй раз в 15 мл.
- Используя соответствующую ячейку Сортировка инструмент, установите лазерный возбуждения для обнаружения 561 Нм и выбросов до 610/20 для обнаружения пропидий йодидом.
- Смесь 15 мл окрашенных клеток кратко vortexing и место в инструмент при 4 ° C.
- Запустите клетки на медленный поток оценить, идеально 1.0 мл/мин, с тем чтобы получить профиль чистой клеточного цикла и избегать смешивания G1 или G2/M клетки с S фазе населения.
- Во-первых, ворота для КФН-A-x SSC-(район вперед разброс по точечной Сиде) для удаления мусора (рис. 1A).
Примечание: Клеток эмбрионов различных размеров в зависимости от стадии и ячейки. Фильтр нейтральной плотности (ND) может потребоваться переключаться между 1.0 и 1.5 в зависимости от размера клетки присутствуют. Ворота большой площади для большинства клеток сбора и удаления мусора. - Во-вторых, ворота для SSC-области (SSC-A), Пи области (Пи-A), чтобы удалить мусор и ячейки Дуплеты (Рисунок 1B).
- В-третьих, ворота для SSC-A от SSC-W (ширина) чтобы удалить любые оставшиеся ячейки Дуплеты (рис. 1 c).
- Отображение условного населения на гистограмму с ячейки номер (количество) на оси y и пропидий йодидом области (PI-A) на оси x. Для 24 hpf эмбрионов это должно дать профиль стереотипных клеточного цикла, как показано на рисунке 1 d.
- Чтобы отсортировать населения фазы S, установите ворота с правой стороны пика G1 на левой стороне G2 пик, включая лишь минимальное количество населения G1 и G2. Для 24 hpf эмбрионов, это будет обычно составляют около 10-15% из населенности закрытого (см. рис. 1 d).
- Чтобы отсортировать G1 населения, установите ворота на левой стороне G1 пик, не пройти в верхней части пика. Отрегулируйте ширину ворот G1 как можно более узким (см. рис. 1 d).
- Обратно, ворота G1 и S фазу населения для обеспечения надлежащего первоначальный шлюзовые (Рисунок 1E).
- Сортировка G1 и S фазу населения в 15 мл конические трубы с 3 мл PBS-BSA. Цель должна заключаться в получить между 500 000 и 1 миллион или более сортировки клеток на фракции (G1 и S-фаза).
- После завершения сортировки центрифуги трубки на 1500 x g и 4 ° C на 10 мин.
Примечание: Мелкоклеточного Пелле будет трудно понять, и важно избежать нарушения его, так что используйте предпочтительно размахивая ведро ротора через фиксированный угол ротора. - Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 1 мл раствора 1 x PBS. Клетки перехода к 1,5 мл отцентрифугировать и центрифуги на 6000 x g и 4 ° C за 5 мин.
- Тщательно удалить все жидкости из трубки и заморозить сухих гранул при-20 ° C. Храните таблетки при-20 ° C на 2-3 недели.
5. ДНК изоляции, RNase лечение и очищение дна
- Удалите ячейку Пелле от-20 ° C и место на льду.
- 400 мкл буфера SDS (50 мм трис-HCl (рН 8,0), 10 мм ЭДТА, 1 M NaCl, 0,5% SDS) гранул и Ресуспензируйте.
- Добавить протеиназы K в конечной концентрации 0,2 мг/мл и перемешать кратко, vortexing.
- Проинкубируйте образцы на 56 ° C 2 h, вихревой каждые 15 мин.
- После 2 ч выполните извлечение фенола хлороформ, добавив 400 мкл фенол хлороформ (фенол: хлороформ: изоамилового спирта 25:24:1, насыщенных с 10 мм трис, рН 8,0, 1 мм ЭДТА).
- Вортекс для образца 20 s и центрифуги на 16000 x g 5 мин для разделения фаз.
- Осторожно удалите верхний водной фазе (400 мкл) и передачи в 1,5 мл трубку.
- Выполните EtOH осадков, добавив 40 мкл ацетат натрия 3M (рН 5.2), 2 мкл гликогена и 1 мл EtOH.
- Вихрь тщательно перемешать и поставить на 20 ° C ночь до осадок ДНК. Образец можно ускорили также в-80 ° C или на сухой лед за 1 ч.
- Центрифуга образца при 4 ° C и 16 000 x g за 30 мин до Пелле ДНК.
- Супернатант и мыть Пелле отменить с 1 мл 70% EtOH. Центрифуги на 4 ° C и 16 000 x g за 5 мин.
- Выбросите супернатанта и воздушно-сухой Пелле при комнатной температуре на 2-3 мин.
- Растворяют гранулы в 96 мкл газобетона воды и мкл 4 РНКазы A (2 мг/мл).
- Смесь хорошо, vortexing и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
- Выполните извлечение фенола хлороформ, добавив 100 мкл фенол хлороформ и Следующая процедура в шагах 5.2.1 - 5.2.2.
- Выполните EtOH осадков, добавив 10 мкл ацетат натрия 3M, 1 мкл гликогена и 250 мкл EtOH и после процедуры в шагах 5.3.1 - 5.3.5.
- Ресуспензируйте Пелле в 60 мкл буфера TE (10 мм трис-HCl (рН 8,0), 10 мм ЭДТА (pH8.0)) и определения концентрации ДНК с помощью количественного метода на основе флуоресценции. Хранить ДНК при-20 ° C.
Примечание: Важно количественно с помощью привязки на основе флуоресценции ДНК красители, или других средств, более надежными, чем УФ спектрометр-методы на основе ДНК.
6. Подготовка библиотек ДНК и следующего поколения последовательности
Примечание: G1 копии номер эталонного образца для каждого биологического источника требуется для каждого запуска последовательности (т.е. WT, мутант, трансгенных, клеточная линия, и т.д.). Сравните все образцы фазы S из того же источника биологического в же последовательность запуска в одной и той же ссылке G1. Запустите по крайней мере два биологических реплицирует каждого образца для обеспечения согласованности между выборками.
- Разбавьте 1 мкг ДНК в окончательный объем 50 мкл и передачу специализированных трубки для sonication.
- Сдвига геномной ДНК для целевого 250-300 ВР в целенаправленной ultrasonicator, согласно спецификации изготовителя и протокол.
- Проверьте качество и размер стриженый геномной ДНК с помощью автоматизированных электрофорез машины, согласно спецификации изготовителя и протокол. Убедитесь, есть большой пик ~ 250-300 bp для стриженый геномной ДНК.
- Подготовьте последовательности библиотеки с помощью комплекта подготовки библиотеки ДНК с мультиплексной oligos для виртуализации на платформе Illumina, по словам производителя протокол.
- Проверьте качество приготовительная библиотеки с помощью автоматизированных электрофорез машины, по словам производителя протокол. Убедитесь, есть большой пик ~ 400-450 bp, и есть минимальный пиков Димеры праймера (80-85 bp) и адаптер димеров (~ 120 bp).
- Количественно библиотек с помощью комплекта количественного определения библиотеки ДНК для секвенирования ДНК следующего поколения, по словам производителя протокол.
- Разбавить 15 мкл библиотеки к концентрации 5 Нм и комбинировать мультиплексированных библиотек, необходимых для достижения желаемого однозначно сопоставления читать рассчитывает на сэмпл.
Примечание: Количество однозначно сопоставления чтений на сэмпл будет определять резолюции. Использование как 5 миллионов сопоставлены читает для оценки времени репликации для данио рерио генома. Рекомендуется начать с чтения 10-20 млн. - Выполните в паре конец 100 bp всей ДНК генома образцов на платформы виртуализации нового поколения, согласно инструкциям производителя.
7. Анализ последовательности данных
Примечание: Инструкции в этом разделе предназначены в качестве ориентира для анализа. Используйте дополнительные методы для выравнивания последовательности, фильтрацию, обработку, и т.д. Этот раздел протокола будет заниматься предпочтительным методом анализа в этой работе. Если используются дополнительные методы, настройте параметры и функции с учетом этих целей. Ниже команды вводятся в Ubutnu или Mac терминал, с установлены соответствующие пакеты.
- Получить самые последние версии данио рерио генома (danRer10, по состоянию на когда был написан этот протокол) от браузера геноме UCSC, используя следующие команды:
Wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz- Распакуйте файл fa.gz с помощью следующей команды:
gunzip danRer10.fa.gz - Выравнивание данных секвенирования генома используя АДЖ мем, используя следующие команды:
ВСБ мем -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
- Распакуйте файл fa.gz с помощью следующей команды:
- Преобразуйте файл .sam .bam файл samtools с помощью следующей команды:
SAMtools Просмотр -bS input.sam > output.bam- Сортировка файлов соответствие последовательности, samtools с помощью следующей команды:
SAMtools сорт output.bam > output_sorted.bam - Индекс .bam файл samtools с помощью следующей команды:
SAMtools индекс output.bam
- Сортировка файлов соответствие последовательности, samtools с помощью следующей команды:
- Марк PCR дублирует с Пикар, используя следующие команды:
Java-Xmx2g-банку picard.jar MarkDuplicates \
INPUT=input.BAM
Output=Output.BAM
REMOVE_DUPLICATES = false
METRICS_FILE=output_metrics.txt - Создайте файлы текста (.txt) операций чтения для каждой хромосомы, используя следующую команду:
я в {1,25}; делать CHROM = «chr» $i; Эхо $CHROM; SAMtools Просмотр input.bam $CHROM | вырезать -f 2,4,5,7,8,9 > .txt$ {i} readsChr; Договорились
Примечание: Столбцы в файле .txt, флаг, местоположение, mapQ, пара ЦПЧ, пара местоположение и размер фрагмента, соответственно. - Чтение файлов .txt в Matlab (или любое другое подобное программное обеспечение), используя функцию textscan.
- Фильтр из низких сопоставления качества читает, установив порог mapQ 30.
- Удаление читает с флагами не первичного выравнивания, ПЦР дубликаты или пара карт к другой хромосоме.
- Фильтр из любой читает с их пары за пороговое расстояние 2000 года bp.
- Оцените статистику результате гласит, чтобы определить количество чтения статистики, охват, размер вставки и качества (рис. 2).
- Определите чтения освещение в 100 bp фиксированной windows для каждого образца, подсчитывая количество считываний в 100 bp промежутки по всей длине каждой хромосомы.
- Вычислить медиану считывания счетчика для всех окон.
- Фильтр из регионов высокого охвата путем удаления windows больше, чем 5 стандартных отклонений от медианы.
- Определите регионы для анализа в G1 эталонных образцов путем нахождения сегментов вдоль каждой хромосомы с 200 чтений с помощью раздвижных окон.
- Определите чтения глубину в каждой пробе фазы S подсчитывая количество считываний фазы S в windows 200-чтения count, определенных для сопровождающих G1 ссылку.
- Гладкие необработанных данных, используя функцию csaps в программном обеспечении, с коэффициента интерполяции (p) 10-16.
- Нормализовать сглаживаемые данные для z скор с 0 среднее и стандартное отклонение 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование опубликованных репликации данных об использовании времени, представитель репликации синхронизация профилей и меры контроля качества предоставляются15. Первые шаги обработки включают выравнивание данных секвенирования генома, расчет чтения Длина и статистика покрытия генома и фильтрации низкого качества, непарные, и повторяющиеся читает ПЦР. Статистические данные чтения для типичного данио рерио последовательности образца приведены на рисунке 2. После фильтрации, чтения, которые счетчики определяются в переменной размера окна и данные являются сглаженный и нормализуется. Типичный сглаженный нормированный репликации сроки профили представитель данио рерио хромосомы для биологических реплицирует показаны на рисунке 3A. Профили для биологических и экспериментальных реплицирует следует визуально очень похожи (см. рис. 3а) и также отобразить высокие корреляции по длине хромосомы (рис. 3B). Они также должны отображать высокая корреляция между значениями времени генома широкий (рис. 3 c). Автокорреляция, метода для оценки модели непрерывности, должны использоваться для оценки степени структуры в наборе данных (рис. 3D). Автокорреляции для структурированных зрелого времени программ должны быть высокой на коротких расстояниях и постепенно уменьшаться с увеличением расстояния. Образцы, которые демонстрируют высокую воспроизводимость между биологическим и экспериментальных реплицирует и сигнал сильный автокорреляции следует рассматривать как высокое качество образцов и могут быть объединены для получения образца выше охват.
Рисунок 1: Сортировка данио рерио эмбрионов для репликации временной анализ. (A) Gated населения всех ячеек, сортировка области вперед точечной (FSC-A), разброс Сиде (SSC-A). Цвета представляют собой плотность бункеров в точка участок с высокой и низкой плотности, представленных цветов, начиная от красный зеленый синий. (B) Gated популяция клеток FSC x SSC воротами, сортируются для SSC-A пропидий йодидом области (PI-A). (C) Gated населения Госкомстат x PI закрытого клетки отсортированы для SSC-A, ширина бокового разброса (SSC-W). (D) гистограмму всех закрытых популяций, отображение профиля стереотипных клеточного цикла. Сортировка ворота для клеток в фазе G1 и S отображаются серые тени в штучной упаковке с черными линиями. (E) Backgated G1 и S фазу населения показывают, что первоначальный стробирования захватили большинство клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: последовательности читать статистику пример типичного данио рерио. (A) Рипа сопоставления качества статистики mapQ ценностей. (B) гистограммы распределения размеров вставки для всех последовательности читает. (C) читать статистику для всего сопоставленного читает, читает, содержащие флаг низкого качества, читает с парами, сопоставление с другой хромосоме (пара diff ЦПЧ), читает с парой за пороговое расстояние (отдаленные пара) и ПЦР дубликаты. (D) представитель числа общей сопоставлены, несопоставленные и непарных читает, освещение и прочитать резолюцию для типичной последовательности запуска данио рерио образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: результаты синхронизации репликации представитель данио рерио и меры контроля качества. (A) репликации сроков двух биологических реплицирует 28 hpf эмбрионов (Siefert, 2017) по длине представитель хромосомы. (B) корреляции между значениями времени репликации в windows 2 МБ по длине представителя хромосома для биологического реплицирует 28 hpf эмбрионов, показано на рисунке 3A. (C) генома всей корреляции между репликации значений времени для биологических (РЭП1 и rep2) и реплицирует экспериментальный (rep3) 28 hpf эмбрионов. Цветная карта представляет коэффициент корреляции Пирсона. Автокорреляции (D) для структурированных зрелого времени программы отображает высокий автокорреляции в тесном расстояний, которые постепенно уменьшается на все более дальние расстояния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Данио рерио предоставляют новый и уникальный в естественных условиях модельной системы для изучения времени репликации ДНК. Когда приурочен вязки выполняются как подробно этот экспериментальный протокол, тысячи эмбрионы могут быть собраны в один день для экспериментов. Эти эмбрионы синхронно развиваться через точно приурочен и отчетливо характеризуется этапы развития. Данио рерио можно легко и точно поставленный морфологии, используя стереомикроскопом, как zebrafish эмбриона развивать внешне и оптически ясно. Этот протокол описывает использование данио рерио эмбрионов для изучения времени репликации всей позвоночных развития.
Области протокол, который может представлять проблемы включают в себя обеспечение синхронное развитие зародышей данио рерио, потеря клеток во время подготовки, СУИМ сортировки и подготовки библиотеки. Сроки разработки данио рерио — температура зависимым, поэтому использование данио рерио адаптирована к свет/темно циклов и размещены на 28,5 ° C для экспериментов. Для обеспечения синхронного развития, выполняют точно приурочен вязки и собирать эмбрионов в очень небольшое время windows (10 минут или меньше). Это имеет решающее значение для сохранения эмбрионов на 28,5 ° C и убедиться, что они тратят минимальное время при комнатной температуре. Сроки разработки данио рерио также сильно зависит от плотности эмбрионов в данной области. Важно, чтобы не дом эмбрионов на плотность выше, чем 100 эмбрионов на 10 см пластины, или они не будут правильно развиваться. Оптимальное время для удаления мертвых и неоплодотворенных эмбрионов, когда они продвинулись к стадии 4-16 клеток и легко могут быть определены как удобренных (использование «Стадий эмбрионального развития Zebrafish»17 как руководство). Мертвых эмбрионов обычно отображаются в виде черных шаров и неоплодотворенных эмбрионов отображаются как 1-клетка. Работа как можно сократить время на окружающей температуре быстрее.
Когда dechorionating эмбрионы, важно, чтобы убедиться, что все chorions будут удалены из эмбрионов. Держите эмбрионов в Проназа решения до тех пор, пока большинство chorions пришли. Отменить любые оставшиеся эмбрионы с chorions нетронутыми, или удалить их chorions с щипцами. Пипетка эмбрионы с использованием медленного и плавного движения. Не Пипетка быстро как он будет подвергать клетки чрезмерного стресса и приводят к потере клеток. Важно также, чтобы не использовать P200, как это может вызвать увеличение напряжения сдвига, что приводит к поломке клеток. И наоборот пипетки пластиковые передачи могут не иметь небольшой достаточно родила или предоставить достаточно касательное напряжение адекватно нарушить желточного мешка и разбить ячейки. Могут использоваться альтернативные пипетки, предусмотрено отверстие и сдвига будет эквивалентна оптимального P1000.
Когда СУИМ, сортировка 28 hpf, если стереотипных клетки цикла профиль не получается, регулировать напряжение на лазерной PI так, что пик G1 центрируется вокруг 50K. Выгоды для КФН и SSC могут также должны корректироваться таким образом, что стробирования и клеток населения похож на рисунке 1. Если есть еще трудности, ND-фильтр должен быть включен, и FSC и SSC напряжений, скорректирован для обеспечения большинство клеток находятся в ворота. Это должно быть очевидно, есть PI окрашивания, а будет ли диапазон, который приближает удваивается для Пи-A. Гистограмма должна показать две четкие пики, большой пик на 2N ДНК для G1 клеток и небольших пика удвоить интенсивность 4N ДНК содержание клеток G2/М. Если это до сих пор не получено может быть либо низкое количество нетронутым клеток, проблемы с PI пятнать или проблемы с креплением и протокола будет необходимо оптимизировать соответственно.
Клетки из ранних эмбрионов (до 10 hpf) не даст профили типичных клеточного цикла, как высокий процент этих клеток в S фазе. Эти образцы можно рассматривать как образцы фазы S и по сравнению с G1 ссылку из 24 hpf эмбрионов. Эмбрионы между 10 hpf 24 hpf может дать профили промежуточных клеточного цикла и могут быть отсортированы при желании. S-фазе населения также могут быть определены и сортируются путем включения тимидина аналогов как Эду (5-Ethynyl-2'-дезоксиуридина) или BrdU (Бромдезоксиуридин) в краткий импульсов до фиксации, однако, это не является необходимым для точного определения Синхронизация репликации.
В идеале подготовка библиотеки следует начать с 1 мкг ДНК. Теоретически ~ 300 000 сортировки клеток даст около 1 мкг ДНК (оценки ~3.3 ПГ/ядро), однако, всегда есть потери на протяжении протокол. 500 000 до 1 миллиона отсортированных клетки должны дать более чем 1 мкг ДНК. Типичная 24 hpf эмбриона будет иметь около 18.000 клетки, из которых 10-15% будет в S-фазе. Зародышей на ранних стадиях развития будут иметь значительно меньше клетки, но будет иметь более высокий процент клеток в S-фазе.
Выполнение точных очищения и выбор размера с помощью магнитной бусины имеет решающее значение для устранения нежелательных элементов из библиотеки подготовки. Внимательно следуйте инструкциям производителя и может потребоваться дополнительная оптимизация. Небольшое количество димеры PCR обычно не является серьезной проблемой, но димеры адаптер будет очень эффективно последовательности так, что они должны быть сведены к минимуму. Это может быть достигнуто путем корректировки первоначальных адаптер ДНК соотношение и выполнять выбор точного размера во время подготовки библиотеки.
Одноместный конец последовательности также могут быть подходящими для различных экспериментальных потребностей. Одноместный конец дешевле и обеспечивает большую часть необходимой информации, поскольку этот подход основывается на подсчет читает; в паре конец выше позволяет удалить ПЦР и оптические дубликаты и для устранения повторяющихся последовательностей и другие структурные изменения, (которые являются общими в геноме данио рерио). Часть анализа ниже будут рассмотрены только читает в паре конец последовательности. Также возможно короткие последовательности чтения. Это обеспечит большее количество чтений по более низкой цене, но читает может быть более сложным для сопоставления. Анализ часть ниже оптимизирован для 100 bp читает, и корректировки могут быть необходимы, если используется длина короче читать.
Этот протокол также легко может быть адаптирован для дополнительного использования в zebrafish модель. Он уже используется для анализа данио рерио хвост фибробластов (ZTF клетки), главной ячейки культура линии изолированы от взрослых рыбок данио хвост. Изучить типы изолированных клеток от данио рерио, трансгенных маркеров может использоваться для выявления и изоляции отдельных клеток до окрашивания и Сортировка содержимого ДНК. Одной из возможных стратегий бы использовать трансгенные линии, выражая маркер флуоресцентные ткани конкретной промоутера, а к первому изолированных клеток СУИМ сортировки, после фиксации и сортировки содержимого ДНК. Кроме того использование красителей проницаемых ДНК клеток может позволить для одновременной изоляции отдельных клеток, а также населения фазы G1 и S. Эти приспособления к настоящему Протоколу может также включить репликации времени исследования в других моделях в естественных условиях .
Захватывающие возможности для будущего использования этого протокола заключается в изучении роли репликации сроки заболевания. Существует несколько моделей рака в данио рерио, некоторые спонтанное и другие индуцибельной, которые могут использоваться для определения, когда происходят изменения в сроках репликации во время онкогенеза. Это позволит многочисленным оценки сроков репликации роль играет в tumorigenesis и болезнь прогрессии. Кроме того данио рерио являются прекрасным примером для скрининга наркотиков и может использоваться для выявления наркотиков, которые влияют на регулирование времени репликации, которые имеют потенциал для использования в лечении рака.
Данио рерио является перспективным новая модель для изучения времени репликации. Этот протокол будет позволить себе многие другие возможность использовать эту модель в изучении роли репликации сроки развития и болезней. Этот протокол может быть адаптирована для использования с другими в естественных условиях развития модели систем, таких как Drosophila melanogaster Xenopus laevisи смотреть вперед к будущим выводы от этих и других организмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здравоохранения посредством грантов 5P20GM103636-02 (включая поддержку основной поток цитометрии) и 1R01GM121703, а также награды от Оклахома центр для взрослых стволовых клеток Исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
