Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att analysera cell till cell överföring av oscillerande information av optogenetic kontroll och live övervakning av genuttryck. Detta tillvägagångssätt ger en unik plattform för att testa en funktionell betydelse av dynamiska gen uttryck program i flercelliga system.
Abstract
Cellerna bör svara ordentligt på temporally förändrade miljöer som påverkas av olika faktorer från omgivande celler. Skåran signaling pathway är en av sådan grundläggande molekylära maskineri för cell-till-cell kommunikation som spelar viktiga roller i den normala utvecklingen av embryon. Denna väg innebär en cell till cell överföring av oscillerande information med ultradian rytmer, men trots framsteg i molekylärbiologiska tekniker, det har utmanande för att belysa effekterna av flercelliga interaktioner på oscillerande gen Dynamics. Här presenterar vi ett protokoll som tillåter optogenetic kontroll och live övervakning av genen uttrycksmönster temporal preciserad. Denna metod avslöjade framgångsrikt att intracellulära och intercellulära periodiska ingångar av Notch signalering stiga på tåg inneboende svängningar av frekvensinställning och fas skiftande med encelliga upplösning. Detta synsätt är tillämpligt på analysen av de dynamiska funktionerna i olika signalvägar, som ger en unik plattform för att testa en funktionell betydelse av dynamiska gen uttryck program i flercelliga system.
Introduction
Cell-till-cell kommunikation spelar avgörande roller i embryonala mönstring i utvecklingsprocesser. I ryggradsdjur embryon bildas de Metamera strukturer som kallas thoraxsegmenten längs främre-bakre kroppen axeln med en exakt temporal noggrannhet under kontroll av en tidsangivning klocka, kallas segmentering klockan1. Under denna process, en grupp presomitic mesoderm (PSM) celler omvandlas regelbundet till thoraxsegmenten i ett synkront sätt. Denna process omfattar synkroniserade oscillerande genuttryck och PSM celler som svänger i fas bildar de samma thoraxsegmenten. Det oscillerande genuttrycket är cirka 2 till 3 h i möss och ca 30 min i zebrafiskar. När dissocierade, PSM celler förlorar den sömnapparater2,3, men när de är åter samlade, de kan själv ordna och återställa den befolkning synchrony4, tyder på att cell-cell-koppling är en nyckel för den synkroniserade svängningar.
Omfattande insatser avslöjade att signalmolekyler i Delta-Notch väg är tätt anslutna till synkroniserade svängningarna av segmentering klocka generna. Antingen farmakologiska hämmare eller genetiska mutationer av Notch signalering desynchronize befolkningen av oscillatorerna. Mutanter av Notch signalering komponenter, såsom DeltaC, DeltaD och Notch1a, Visa i zebrafiskar, asynkron svängningar5,6. Chick eller mus embryon krävs inte bara Notch liganden Delta-like1 (Dll1) men också den Notch Modulator Lunatic fringe (Lfng) för synkroniserade svängningar7,8,9. Men det har varit svårt att testa den funktionella kapaciteten hos molekylerna för dynamisk informationsöverföring från cell till cell, eftersom temporal resolutioner av konventionella störning av genen förordning dynamics inte var tillräckliga för att undersöka den processer för tidsskalor på 2 – 3 h (ultradian rytmer).
Vi har nyligen utvecklat en integrerad metod för att kontrollera och övervaka gen uttrycksmönster i däggdjursceller10. Denna teknik möjliggör induktion av gen uttryck pulser av periodiska ljus belysning på ultradian tid-skalor. Detta protokoll representerar metoderna att upprätta ljuskänslig cell-linjer och respektera dynamiska svar av reporter cellerna genom live-cell luminiscens övervakning i sammanhang av cell-till-cell kommunikation. Denna metod är tillämplig till analysen av många andra signalvägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generering av stabil cellinjer av systemet för Tol2
-
Transfect plasmid vektorer (figur 1A) av Tol2-baserade optogenetic moduler tillsammans med transposase (Tol2) uttryck vektorn (pCAGGS-mT2TP) i C2C12 celler. I alla steg, kultur celler med DMEM medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och penicillin-streptomycin vid 37 ° C (tabell 1), i närvaro av 5% CO2, annars betecknas.
- Räkna trypsinized celler med en cell-räknare och plattan 5 x 104 C2C12 celler per brunn i en 12-well platta en dag innan transfection.
- Samtidig transfect 0,375 µg Tol2-baserade optogenetic vektorer (pAI177 eller pAI218), 0,125 μg av en drog urval vektor (pAI170) och 0,5 μg av pCAGGS-mT2TP vektor med hjälp av lipofection reagens.
- Trypsinize transfekterade celler och platta dem i 100 mm kultur rätter en dag efter transfection.
- Exchange odlingsmedium för transfekterade cellerna till odlingsmediet kompletteras med 100 mg/mL hygromycin.
- Kultur celler i 3 dagar för att eliminera un-transfekterade celler. Observera att medium förändring inte är nödvändigt.
- Trypsinize transfekterade celler och rena en population av celler som uttrycker fluorescerande proteiner för utväljande. För mottagaren celler ange bär pAI177, sortering grinden till grön-PE kanal för rening av mCherry-positiv cell befolkningen. För ljuskänsliga avsändaren celler ange bär pAI218, sortering grinden till APC kanal för rening av iRFP713-positiv cell befolkningen.
- (valfritt) Upprätta en klonal cell befolkningen genom standardiserade metoder, såsom begränsad utspädning eller encelliga sortering av FACS.
2. utvärdering av foto-känslighet av bearbetade celler på populationsnivå
Obs: Denna del beskrivs ett protokoll för att kontrollera dynamisk induktion av Dll1 ligand proteiner vid blå-ljus belysning genom biokemiska analyser, såsom qPCR och Western blotting.
- Ställa in två typer av inkubatorer med eller utan ljuskällor för en ljus-inducerad eller en mörk villkoret, respektive. Set-up ljus intensitet av en blå-LED trans-illuminator, som visas i figur 1B, med hjälp av en ljusmätare. Programmet timings och varaktighet av ljus belysning genom att läsa ett kontroll-skript till en single-board mikro-controller som gör programmerbara scheman för belysning (figur 1 c).
- Räkna trypsinized celler med en cell-räknare och plattan 1,0 x 105 ljuskänsliga avsändaren celler bär pAI218 och pAI170 på 35 mm diameter plast kultur rätter (mer än 12 rätter för ljusförhållanden och 1 maträtt för mörka tillstånd) och ange rätterna i separata inkubatorer för mörk/ljus villkor. Efter inställning av rätter, hålla dörrar av inkubatorer stängd fram till samlande cell lysates.
- En och en halv dagar efter plätering, börja tända bromsljus (celler förväntas vara mer än 80% konfluenta). Utsätt inte celler för ljus för att undvika oönskade foto-stimulering.
Obs: Scheman för belysning beror på syftet med experiment. Observera att ett ihållande belysning villkor (t.ex. 1-min längd och 10 min intervaller med 40 µmol/m2/s ljus-intensitet) är tillräcklig för en enkel kontroll av foto-induktion, och den starka ljus belysningen är skadligt för celler. Således, säkerställa att ofarliga parametrar för belysning är markerade. - Ca 2 dagar efter plätering, förbereda cell-lysate med 30 minuters mellanrum. Flytta urval rätter från inkubatorer till på isen, och börja förbereda cell lysates för vidare analys.
3. dynamisk avsändare-mottagare Assay på populationsnivå: övervakning i realtid av cellulära svar vid optisk stimulering av PMT
- Trypsinize och räkna antalet avsändare och mottagare cellerna med standardmetoder. Förbereda en 1 mL totalvolym blanda suspension 2,5 x 104 mottagare och 1,25 x 105 avsändaren celler (1:5 ratio).
Obs: 2:1, 1:1 eller 1:2 avsändare-mottagare nyckeltal också arbeta med en summacell antal 1,5 x 105. 10 - Plattan blandas celler i varje brunn av 24-väl svarta plattor med odlingsmedium som innehåller 1 mM luciferin.
- Analysera cellerna på Plattläsare för luciferas analys och bekräfta att utsignaler inte är för hög för inspelningssystem.
Obs: Om utsignaler är högre än 1 x 106 photon räknas/s, de kan vara mättad. I så fall minska koncentrationen av luciferin till optimala värden så att utsignaler är lägre än 1 x 106 photon räknas/s. - Ställa in plattan på inspelningssystemet och starta en inspelningsprogram (figur 1 d). Till exempel börja tända bromsljus på 18 h efter att inspelningen.
Obs: Temporal filtrering, till exempel detrending signaler med rörliga genomsnitt och Savitzky-Golay filtrering, är användbara för visualisering av våg-former och högsta upptäckter.
4. dynamisk avsändare-mottagare Assay på Single-cell nivå: realtid avbildning av Single-cell Svaren under kontroll av Optogenetic störning
- Plåt 0,5 x 105 mottagare och 2,5 x 105 avsändaren celler på 27-mm-diameter-glas-base 35 mm diameter rätter. Säkerställa att blandning nyckeltal och ett totalt cellantal (en cell densiteten) är korrekt justerade.
- En dag efter plätering, utbyta medium med 2 mL av lagringsmediet (fenolrött gratis DMEM medium kompletteras med 5% FBS, penicillin-streptomycin och 1 mM luciferin), och ställa glas-base skålen på mikroskopet. Om det behövs tvätta ut skräp av döda celler med PBS (-).
Obs: Det är bättre att göra detta steg i en mörk skick. - Ställa in ett inverterat Mikroskop utrustat med en klimatkammare vid 37 ° C och 5% CO2.
- Ställa in en kylda CCD-kamera. Se till att temperaturen i CCD sensorn kyls ner till destination värde (vanligtvis-90 ° C).
-
Ställa in parametrar för ”Multi-Dimensional Timelapse” fönster i automatiska förvärv programvara för att fånga bilder med 5 minuters intervall och mer än 288 gånger (mer än en övernattning inspelning).
- Öppna ”Multi-Dimensional Timelapse” fönster, Välj en luminiscens kanal och en långsam 50 kHz avläsningssystem läge från den nedrullningsbara menyn och gör 4 x 4 binning med 4 minuters exponering. Se till att det avläsning-läget är inställt på långsam 50 kHz-läge, vilket är avgörande för att minska avläsningssystem ljud för att upptäcka svagt utsändande självlysande ljus.
- Öppna ”Multi-Dimensional Timelapse” fönster, Välj fluorescens-kanaler och en snabb 1 MHz avläsningssystem läge från den nedrullningsbara menyn och ange 2 x 2 binning med 400 ms exponering. Se till att den avläsning är inställt på det snabba 1 MHz läget att minska den tid som krävs för fluorescens imaging.
- Starta time-lapse inspelningen genom att klicka på ”Hämta” knappen.
- Extrahera encelliga spår av luminiscens kanaler från time-lapse filmer av bilden analysprogram, enligt följande. Se först luminiscens och fluorescens stack bilder genom att importera bilddata till bild analys programvara. För Luminiscens bilder, ta bort heta pixlar härrör från kosmisk strålning genom att jämföra stödnivåerna som pixlar i temporally intilliggande bilder, ersätter pixelvärdena med temporal genomsnittet av de föregående och nästa ramar (genomfört som ”SpikeNoise Filter”), tillämpa dessa bearbetade bilder till ett rumsligt utjämnande filter och subtrahera bakgrunden pixelvärdena i out-field utsikt från varje ram. Sedan bestämma en ”region av intresse” (ROI) för varje cell på en fluorescerande bild vid varje tidpunkt, gäller ROI självlysande bilder, och mäta varje ROI självlysande intensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi anpassade den LightOn system11,12, vilket gör att foto-inducerade genuttryck i däggdjursceller, att studera genetiska oscillatorer med 2 - till 3-h periodicitet. Detta system består av två delar: den foto-inducerbara transkriptionell aktivator hGAVPO och ett UAS-promotorn kassett till drive transkription av godtyckliga gener av intresse. För att påskynda den pulserande kineticsen av foto-inducerade genuttryck, ersattes polyA sekvensen i UAS-promotorn kassett av murina Hes1 3' UTR, vilket förkortar mRNA halveringstiden till 20 min i murina fibroblaster.
För att upprätta stabila cellinjer, tri-cistronic vektorer baserat på systemets Tol2 transposase var begagnad13 (figur 1A). Tol2 uttryck vektorn är avgörande för effektivisering av kromosomala integration av Plasmiden kassetter14. Dessa vektorer bära inte bara uttryck kassetter av ljus-inducerbara gener drivs av UAS-arrangören men också uttrycket kassetter av ljuskänsliga protein hGAVPO och fluorescerande proteiner (iRFP71315 eller mCherry). Denna design tillät oss att rena en population av celler som effektivt integreras värd genomen plasmidsna.
Vi etablerade ljuskänsliga avsändaren celler som producerar Dll1 ligand proteiner vid blå ljus belysning (figur 2A). För detta ändamål användes ett Tol2 system-baserade bi-cistronic vektor (pAI218). För att kontrollera induktion av Dll1 ligand vid tändning av ljusen, odlades celler i inkubatorerna utrustade med programmerade LED blå ljus källor visas i figur 1B och 1 C. Representativa resultat av foto-inducerad Dll1 protein uttryck dynamics upptäcks av Western blotting analysen visas i figur 2B och 2 C.
För att fastställa celler som reagerar på Notch signalering ingångar, använde vi en Tol2 system-baserade bi-cistronic vektor (pAI177) bär destabiliserat luciferas reportern under kontroll av arrangören av Notch effektor genen Hes1 och phosphoglycerate tyrosinkinashämmare (PGK) arrangören-driven kärnor-lokaliserad röd fluorescerande reporter H2B-mCherry. I det här fallet är den fluorescerande reportern användbar för såväl rening och encelliga spårning i time-lapse mikroskopi.
När foto-inducerbara avsändaren och mottagaren celler är framgångsrikt etablerat, är det redo att utföra dynamiska avsändare-mottagare analys av samtidig odling av dessa celler (figur 2A). I denna analys, de ljuskänsliga avsändaren celler som uttrycker proteinet Notch ligand Dll1 vid blå ljus belysning var samtidig odlade med foto-okänslig mottagare celler som bär den endogena Hes1 oscillatorn och en Mareld Hes1 reporter ( pHes1-dLuc) (figur 2D). Mottagare cellerna express endogenously Notch receptorn, som är mottaglig för Dll1 presenteras av angränsande celler.
Representativa resultat av dynamisk avsändare-mottagare analyser visas i figur 2E och 2F. För att upptäcka de dynamiska svar av mottagaren celler med Mareld inspelningen, använde vi först ett live-cell system för övervakning, utrustad med en hög-känsliga foto-multiplikator tube (PMT) för fotonräknande och en LED blå ljus källa för ljus stimulering ( Figur 1 d). Detta system tillåter realtid inspelning av Mareld signaler på populationsnivå med schemalagda ljus belysning. När dessa två typer av celler var samtidig odlade och utsatt för repetitiva ljus belysning (30 s varaktighet, 2,5 timmars intervall), var cykliska Svaren av mottagaren celler detekterbart i olika villkor blandning nyckeltal (figur 2E). I det här exemplet tillämpat vi Savitzky-Golay filtrering (4th order och en 13 datapunkt fönstret) för att dämpa högljudda signaler. Time-lapse mikroskopi med repetitiva tända bromsljus (2 min varaktighet, 2,75 h intervall) avslöjade också synkroniserade Svaren av mottagaren celler på enskild cell nivå (grå linjer i figur 2F) och på populationsnivå (röda linjen i figur 2F). dessa data tyder på att cykliska uttryck av Dll1 protein i avsändaren celler är tillräcklig för att synkronisera Hes1 svängningar i grannlandet mottagare celler.
Figur 1: strategi för att analysera cellulära svar vid optogenetic störningar. (A) Schematisk bild av representativa plasmid vektorer används för detta protokoll. Dessa plasmider finns tillgängliga på begäran. (B) ett foto av en CO2 inkubator utrustad med en blå LED-enheten under en 6-väl cell kultur plattan. (C) Schematisk bild av en elektrisk krets till kontroll power levererar för ljuskällan LED av en programmerbar mikrodator. En solid-state relä (SSR) angavs till relä på/av påstår av digitala PIN-out av mikro-datorn för att på/av påstår av den LED-ljuskällan. (D) ett foto och Schematisk bild av en live-cell Mareld övervakningssystem. Observera att motordrivna scenen kan flytta unidirectionally från en inspelning position på toppen av PMT detektorn till belysning läge på toppen av den LED-ljuskällan. Observera också att PMT detektorn kan flytta från väl för väl att övervaka signaler från enskilda brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på optogenetic störning experiment. I dessa exempel användes murina C2C12 gorgina cellinjer. (A) Schematisk bild av dynamiska avsändare-mottagare analysen. (B, C) Representativa resultat av ljus-inducerad Dll1 uttryck analyseras av Western blotting analys. Dll1 proteiner förmåddes av periodiska ljus belysning med en 2,5 h period, 2 min varaktighet och intensitet 24,7 W/m2. (D) fluorescens bild av samtidig kultur system av avsändaren och mottagaren celler. (E, F) Representativa resultat av dynamisk avsändare-mottagare analysen. (E) tidsmässiga mönster av mottagaren Svaren registreras genom live-cell övervakningssystemet utrustade med kassarabatt Den totala cellantal var fast till 1,5 x 105 celler, men förhållandet mellan avsändarna och mottagarna distribuerades från 5:1 till 1:2. (F) Single-cell imaging visade att oscillerande information, som lockades av periodiska tända bromsljus (2 min varaktighet, 2,75 h intervall), överfördes från avsändare till mottagare celler. 1,5 x 105 celler med avsändare-till-mottagare förhållandet 5:1 användes. Anpassad från Ref. 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi visade en metod att styra gen uttryck dynamics med en periodicitet på 2 till 3 h. Denna tidsplan är mycket kortare än de i andra konventionella system, inklusive det Tet-On-systemet och den ursprungliga LightOn. Viktiga parametrar att nå ultradian tidsfristerna är halveringstider för foto-inducerad molecular produkter, mRNA och proteiner. Dessa kinetiska parametrar kan bero på celltyper och arter. För trimning kinetik, är ersätter Hes1 3' UTR sekvenser med andra ett okomplicerat sätt, eftersom det inte ändrar de sekvenser och funktioner för målproteiner. För att söka andra 3' utr att erhålla önskvärd pulserande mönster i synnerhet celler av intresse, live-cell övervakning av dLuc av ljus induktion är en bra utgångspunkt och används för screening och validering.
En av de vanligaste frågorna handlar om den dagliga hanteringen av ljuskänsliga celler. När det gäller dynamiska avsändare-mottagare analysen av den Notch signalering, kunde vi göra dagligen cell passager under rummet ljus, eftersom våra system (foto-inducerbara dLuc eller Dll1 och mottagare celler) inte ändra cellproliferation och snabbt återgå till vila stater inom 6 timmar efter cellerna flyttas till ett mörkt tillstånd. Om gener av intresse är öde-bestämning faktorer, läckande uttryck kan inducera celldifferentiering eller förhindra utbyggnader av cellerna, och därför är det viktigt att inrätta ett rött ljus miljö att undvika oönskade optogenetic störning under cell-hantering.
I detta protokoll presenterade vi rutiner för att generera stabil cellinjer med foto-inducerbara gen uttryck kassetter. Detta är ett viktigt steg för att få tillförlitliga resultat i dynamiska avsändare-mottagare-analysen. Man kan betrakta övergående transfection för införandet av optogenetic moduler i celler, men det fungerar inte bra i våra händer för kvantitativa mätningar av ultradian pulser. Vi hittade det övergående transfection av plasmider transporterar UAS-promotorn kassetter leder till läckande uttryck på relativt höga nivåer även under mörka villkor. Denna läckande uttryck orsakar en hög bakgrund utan någon ljus stimulering och hämmar en tillförlitlig mätning av tid-kurs. En alternativ metod att etablera stabila celler är ett lentivirus system, vilket är användbart för celltyper som inte lämpar sig för transfection12. Klonal cellinjer presentera mer homogena Svaren än heterogen cellinjer, men även i en klonal befolkning, cell svaren är inte alltid enhetliga: vissa celler svarar inte ljus stimulering och därför presentera en distribuerad nivåer av ljus-inducerad proteinuttryck. Detta kan bero på varierande nivåer av hGAVPO protein och/eller variabel endogena överflöd av flavin, en kromofor krävs för lätta avkänning av hGAVPO.
Det protokoll som presenteras här ger ett kraftfullt verktyg för analys av gen uttryck dynamics, men det finns vissa begränsningar. En nackdel är att vissa fluorescens kanaler för live-cell mikroskopi inte är kompatibla med blå ljus stimulering. Blå-ljus belysning aktiveras inte bara blå-ljuskänsliga proteiner men även fluorescerande proteiner, inklusive gröna och gula fluorescerande proteiner (GFPs och YFPs), som är mottagliga för foto-blekning. Tvärtom kräver visualisering av GFP blå-ljus excitation som kan utlösa oönskade aktivering av ljuskänsliga celler under fånga fluorescerande bilder. Bright-fältet (fas-kontrast) imaging av omgivande ljuskällan är också oförenligt med blå ljus optogenetic experiment, men man kan kringgå problemet genom att använda gröna eller längre våglängd ljuskällor för bildtagning.
Dynamiska avsändare-mottagare analysen skulle vara användbar för att undersöka andra signalvägar. En möjlighet är en ansökan till utsöndrar signalering system. För sådana analyser är tillämpa renat ligander i mikro-fluidic enheter ett alternativt sätt att stimulera celler till mottagaren i en temporal preciserad16,17. Men är dessa metoder otillgängliga för dynamisk produktionsprocesser av liganden molekyler i avsändaren celler. Anställa dynamisk avsändare-mottagare analysen tillsammans med foto-inducerbara ligand uttryck skulle möjliggöra ytterligare dissektion av signalöverföring från avsändare till mottagare celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av JST, PRESTO (AI), Core forskning för blickar vetenskap och teknik (JPMJCR12W2 (R.K.)), bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden (undervisningsministeriet, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT), Japan 26119708 (AI) och 16 H 06480 (R.K.)), vetenskapliga forskning (A) (Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS) 24240049 (R.K.)), och unga forskare (A) (JSPS 15 H 05326 (AI)), och ett bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden ”fluorescens Live imaging ”av MEXT, Japan och plattform för dynamiska metoder till Living System från MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O.
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
