Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu analysieren von Zelle zu Zelle Übertragung der oszillierenden Informationen durch optogenetische Kontrolle und Überwachung der Genexpression zu leben. Dieser Ansatz bietet eine einzigartige Plattform, um eine funktionale Bedeutung der dynamischen Ausdruck Genprogramme in mehrzelligen Systeme zu testen.
Abstract
Zellen sollten richtig reagieren, sich zeitlich ändernden Umgebungen, die durch verschiedene Faktoren aus den umliegenden Zellen beeinflusst werden. Der Notch-Signalweg ist eine solche wesentliche molekularen Maschinerie für Zell-Zell-Kommunikation, die Schlüsselrollen in der normalen Entwicklung der Embryonen spielt. Dieser Weg beinhaltet eine Zelle zu Zelle Informationsübertragung oszillierende mit ultradian Rhythmen, aber trotz der Fortschritts in den Techniken der Molekularbiologie, es ist schon eine Herausforderung, die Auswirkungen der vielzelligen Interaktionen auf oszillierende gen aufzuklären Dynamik. Hier präsentieren wir eine Protokoll, die optogenetische Steuerung und live-Überwachung des Gens Expressionsmuster präzise zeitliche ermöglicht. Diese Methode zeigte erfolgreich, dass intrazellulären und interzellulären regelmäßige Eingänge der Notch signaling innere Schwingungen durch Frequenz-tuning und Phasenverschiebung bei einzelligen Auflösung mitzureißen. Dieser Ansatz gilt für die Analyse der dynamischen Eigenschaften von verschiedene Signalwege, bietet eine einzigartige Plattform, um eine funktionale Bedeutung der dynamischen Ausdruck Genprogramme in mehrzelligen Systeme zu testen.
Introduction
Zell-Zell-Kommunikation spielen wichtige Rollen im embryonalen Musterung in Entwicklungsprozessen. In den vertebrate Embryos sind die Metamere Strukturen, so genannte Somiten entlang der anterior-posterioren Körperachse mit präzise zeitliche Genauigkeit unter der Kontrolle einer Zeitmessung Uhr, genannt die Segmentierung Uhr1gebildet. Während dieses Prozesses eine Gruppe von presomitic Mesoderm (PSM) Zellen sind in regelmäßigen Abständen umgewandelt in Somiten in einer synchronen Weise. Dieser Prozess beinhaltet das synchronisierte oszillierende Genexpression und PSM-Zellen, die in Phase schwingen bilden die gleichen Somiten. Die oszillierende Genexpression beträgt etwa 2 bis 3 h bei Mäusen und ca. 30 min im Zebrafisch. Wenn dissoziiert, PSM Zellen verlieren die Synchronität2,3, aber wenn sie neu aggregiert werden, können sie selbst zu organisieren und die Bevölkerung Synchronität4, darauf hindeutet, dass Zell-Zell-Kupplung einen Schlüssel für die synchronisierte zu erholen Schwingungen.
Umfangreiche Anstrengungen ergab, dass Signalmoleküle in den Delta-Notch-Signalweg auf die synchronisierten Schwingungen der Segmentierung Uhrengene eng verbunden sind. Pharmakologische Inhibitoren oder genetische Mutationen der Notch signaling Synchronisierung die Bevölkerung der Oszillatoren. Im Zebrafisch anzeigen Mutanten von Notch signaling Komponenten wie DeltaC, DeltaD und Notch1a, asynchrone Schwingungen5,6. Küken oder Maus-Embryonen ist nicht nur Notch-Liganden Delta-like1 (Dll1), sondern auch die Kerbe Modulator Lunatic Fringe (Lfng) erforderlich für synchronisierte Schwingungen7,8,9. Jedoch wurde es schwierig, die Funktionsfähigkeit von solchen Molekülen zur dynamischen Informationsübertragung von Zelle zu Zelle zu testen, weil zeitliche Auflösungen von konventionellen Störung gen Verordnung Dynamik nicht ausreichend zu untersuchen, wurden die Prozesse der Zeitrahmen von 2 – 3 h (ultradian Rhythmen).
Wir haben vor kurzem eine integrierte Methode zur Steuerung und Überwachung gen Expressionsmuster in Säugerzellen10entwickelt. Diese Technologie ermöglicht die Induktion der gen-Expression-Impulse durch regelmäßige Beleuchtung auf ultradian Zeitskalen. Dieses Protokoll stellt die Methoden zum lichtempfindliche Zelllinien zu etablieren und dynamische Antworten der Reporter Zellen durch live-Cell-Lumineszenz Überwachung in den Kontexten von Zelle zu Zelle Kommunikation zu beobachten. Diese Methode ist anwendbar auf die Analyse von viele andere Signalwege.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Erzeugung von stabilen Zelllinien vom Tol2 System
-
Transfizieren Sie Plasmid-Vektoren (Abbildung 1A) Tol2-basierte optogenetische Module zusammen mit dem Expressionsvektor Transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) in C2C12 Zellen. Bei allen Schritten, Zellkulturen mit DMEM Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C (Tabelle 1), in Anwesenheit von 5 % CO2, sonst gekennzeichnet.
- Zählen Sie trypsiniert Zellen mit einer Zelle-Zähler und Platte 5 x 104 C2C12 Zellen pro Bohrloch in einer 12-Well-Platte einen Tag vor Transfektion.
- Co transfizieren Sie 0,375 μg Tol2 basierende optogenetische Vektoren (pAI177 oder pAI218), 0,125 µg eines Medikaments Auswahl Vektors (pAI170) und 0,5 μg pCAGGS mT2TP Vektors mittels Lipofektion Reagenz.
- Trypsinize transfected Zellen und Platte sie in 100 mm Kultur Gerichte einen Tag nach Transfektion.
- Exchange-Nährmedium für transfizierte Zellen Kulturmedium mit 100 mg/mL Hygromycin ergänzt.
- Zellkulturen für 3 Tage, UN-transfizierte Zellen zu beseitigen. Beachten Sie, dass die mittlere Änderung nicht notwendig ist.
- Trypsinize transfected Zellen und reinigen einer Bevölkerung der Zellen, die mit dem Ausdruck fluoreszierende Proteine zur Auswahl. Stellen Sie für Empfänger Zellen tragen pAI177 die Sortierschleuse grün-PE Kanal für die Reinigung der mCherry-positiven Zellpopulation. Stellen Sie für lichtempfindliche Absender Zellen tragen pAI218 die Sortierschleuse APC Kanal für die Reinigung der iRFP713-positiven Zellpopulation.
- (optional) Stellen Sie eine klonale Zellpopulation durch Standardmethoden, wie begrenzt die Verdünnung oder einzellige Sortierung nach FACS.
2. Bewertung der Lichtempfindlichkeit von veränderter Zellen auf Bevölkerungsebene
Hinweis: Dieser Teil beschreibt ein Protokoll zur dynamischen Induktion Dll1 Liganden Proteine auf blaues Licht Beleuchtung durch biochemische Tests wie qPCR und Western blotting zu überprüfen.
- Zwei Arten von Inkubatoren mit oder ohne Lichtquellen für eine lichtinduzierte Bedingung oder einem dunklen Zustand bzw. einrichten. Set-up Lichtintensität von einer blau-LED Trans-Illuminator, wie in Abbildung 1 b, dargestellt mit einem Belichtungsmesser. Programm-Timings und Dauer der Beleuchtung durch das Laden ein Kontrollskript zu einem Einplatinen-Micro-Controller, der programmierbare Zeitpläne für Beleuchtung (Abbildung 1) ermöglicht.
- Graf trypsiniert Zellen mit einer Zelle-Zähler und Platte 1,0 x 105 Absender lichtempfindliche Zellen mit pAI218 und pAI170 auf 35-mm-Durchmesser Kunststoff Kultur Gerichte (mehr als 12 Gerichte für Lichtbedingungen und 1 Teller für dunklen Zustand) und die Gerichte in getrennte Inkubatoren für hell/dunkel-Bedingungen. Nach dem Einrichten der Gerichte, halten Sie Türen der Inkubatoren bis sammeln Zelle Lysates geschlossen.
- Eineinhalb Tage nach Beschichtung, beginnen Beleuchtung (Zellen werden voraussichtlich mehr als 80 % konfluierende). Setzen Sie nicht Zellen zum Leuchten, um unerwünschte Foto-Stimulation zu vermeiden.
Hinweis: Termine für die Beleuchtung hängt vom Zweck der Experimente. Beachten Sie, dass eine nachhaltige Beleuchtung Zustand (zB. 1 min Dauer und 10 min Abständen mit 40 µmol/m2/s Licht-Intensität) ist ausreichend für eine einfache Überprüfung des Foto-Induktion und die starke Beleuchtung schädlich für die Zellen ist. Somit gewährleisten Sie, dass harmlose Parameter für Beleuchtung ausgewählt werden. - Bereiten Sie ca. 2 Tage nach der Beschichtung, Zelle lysate mit 30-Minuten-Takt. Verschieben Sie Probeschalen aus Inkubatoren, Eis- und bereiten Sie Zelle Lysates zur weiteren Analyse.
3. dynamische Sender-Empfänger-Assay auf Bevölkerungsebene: Echtzeit-Überwachung von zellulären Reaktionen auf optische Stimulation von PMT
- Trypsinize und zählen die Anzahl der Absender und der Empfänger-Zellen mit Standardmethoden. Bereiten Sie eine 1-mL Gesamtvolumen des Mischens Aussetzung von 2,5 x 104 Empfänger und 1,25 x 105 Absender Zellen (Verhältnis 1:5).
Hinweis: 2:1, 1:1 oder 1:2-Sender-Empfänger-Verhältnis arbeiten auch mit einer Anzahl von insgesamt Zellen von 1,5 x 105. 10 - Platte mit Kulturmedium mit 1 mM Luciferin Zellen in jede Vertiefung des schwarzen 24-Well Platten gemischt.
- Analysieren Sie die Zellen auf Platte Reader für Luciferase Assay, und bestätigen Sie, dass die Ausgangssignale nicht zu hoch für die Recording-System sind.
Hinweis: Wenn Ausgangssignale höher als 1 x 106 Photon zählt/s sind, können sie gesättigt. In diesem Fall reduzieren Sie die Konzentration von Luciferin auf optimale Werte, so dass Ausgangssignale niedriger als 1 x 106 Photon zählt/s sind. - Legen Sie die Platte auf das Aufnahmesystem, und starten Sie eine Aufnahme-Programm (Abbildung 1). Z. B. Starten Sie Beleuchtung um 18 Uhr nach der Einstellung der Aufnahme.
Hinweis: Zeitliche Filterung, wie detrending Signale mit beweglichen Mittelung und Savitzky-Golay Filter, eignen sich zur Visualisierung von Wellenformen und peak-Erkennungen.
4. dynamische Sender-Empfänger-Assay auf der Single-Cell-Ebene: Echtzeit-Bildgebung des Single-Zell-Reaktionen unter der Kontrolle der optogenetische Störung
- Platte 0,5 x 105 Receiver und 2,5 x 105 Absender Zellen auf 27-mm-Durchmesser-Glassockel 35 mm Durchmesser Gerichte. Stellen Sie sicher, dass Mischungsverhältnisse und einer Anzahl von insgesamt Zellen (eine Zelle Dichte) richtig eingestellt.
- Einen Tag nach der Beschichtung, Austausch von Medium mit 2 mL des Aufzeichnungsmediums (Phenol-rot frei DMEM Mittel ergänzt mit 5 % FBS, Penicillin-Streptomycin und 1 mM Luciferin), und legen Sie die Glasboden Schüssel am Mikroskop. Bei Bedarf Waschen Sie Schmutz von abgestorbenen Zellen mit PBS (-).
Hinweis: Es empfiehlt sich, diesen Schritt in einem dunklen Zustand zu tun. - Richten Sie einem inversen Mikroskop mit einer Klimakammer bei 37 ° C und 5 % CO2ausgestattet.
- Einrichten einer gekühlten CCD-Kamera. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des CCD-Sensors auf den Zielwert (in der Regel-90 ° C) abgekühlt ist.
-
Stellen Sie Parameter für "Multi-Dimensional Timelapse" Fenster in automatische Datenerfassungs-Software zum Erfassen von Bildern mit 5 min-Takt und mehr als 288 mal (mehr als eine Nacht Aufnahme).
- "Multi-Dimensional Timelapse" Fenster zu öffnen, wählen Sie eine Lumineszenz-Kanal und einen langsamen 50 kHz Auslesen-Modus aus dem Pulldown-Menü und 4 x 4 binning mit 4 min. Belichtung. Sicherstellen Sie, dass der Auslesen Modus in den langsamen 50 kHz-Modus, die entscheidend zur Verringerung der Auslesen Geräusche festgelegt ist um schwach emittierende Biolumineszenz Licht zu erkennen ist.
- "Multi-Dimensional Timelapse" Fenster zu öffnen, wählen Sie Fluoreszenz-Kanäle und ein Schnelldurchlauf 1 MHz Auslesen aus dem Pulldown-Menü und 2 x 2 binning mit 400 ms Exposition. Stellen sicher, dass der Auslesen-Modus Modus schnell 1 MHz ist, reduzieren Sie den Zeitaufwand für die Fluoreszenz-Bildgebung.
- Starten Sie Zeitraffer-Aufnahme "Acquire" Schaltfläche.
- Extrahieren Sie einzellige Spuren der Lumineszenz Kanäle von Zeitraffer-Filme von Bildanalyse-Software wie folgt. Stellen Sie zunächst Lumineszenz und Fluoreszenz Stapel Bilder durch die Bilddaten, Bildanalyse-Software importieren. Entfernen Sie für Lumineszenz Bilder hot Pixel, abgeleitet von der kosmischen Strahlung durch den Vergleich der Intensitäten von Pixeln in zeitlich benachbarte Bilder ersetzen die Pixelwerte der zeitlichen Durchschnitt der vorherigen und nächsten Frames (als "SpikeNoise Filter" implementiert), wenden Sie diese bearbeiteten Bilder auf eine räumlich glättenden Filter an, und subtrahieren Sie Hintergrund Pixelwerte Out-field Aussicht von jedem Frame. Bestimmen Sie anschließend eine "Region of Interest" (ROI) für jede Zelle auf einem fluoreszierenden Bild zu jedem Zeitpunkt den ROI auf leuchtende Bilder anwenden, und die leuchtende Intensität jedes ROI zu messen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir haben die LightOn System11,12, wodurch Foto-induzierte Genexpression in Säugerzellen, zur Erforschung der genetischen Oszillatoren mit 2 - 3 h Periodizität angepasst. Dieses System besteht aus zwei Teilen: die Foto-induzierbaren transcriptional Aktivator hGAVPO und eine UAS-Promotor-Kassette zu Laufwerk Transkription von willkürlichen Gene von Interesse. Um die pulsatile Kinetik der Foto-induzierte Genexpression zu beschleunigen, ersetzte die PolyA-Sequenz in der FH-Promotor-Kassette murinen Hes1 3' UTR, die die mRNA-Halbwertszeit bis 20 min in murine Fibroblasten verkürzt.
Um stabilen Zelllinien zu etablieren, war Tri-cistronic Vektoren basiert auf dem Tol2 Transposase System verwendeten13 (Abb. 1A). Tol2 Expressionsvektors ist essentiell für die Steigerung der Effizienz der chromosomale Integration von Plasmid Kassetten14. Diese Vektoren tragen nicht nur Expressionskassetten von Licht-induzierbaren Genen getrieben von der FH-Veranstalter, sondern auch die Expressionskassetten der lichtempfindlichen Proteins hGAVPO und fluoreszierende Proteine (iRFP71315 oder mCherry). Dieses Design erlaubt uns, eine Population von Zellen zu reinigen, die effektiv die Plasmiden in das Wirt Genom integriert.
Wir haben Absender lichtempfindliche Zellen, die Dll1 Liganden Proteine auf blaue Beleuchtung (Abbildung 2A). Zu diesem Zweck wurde ein Tol2 System basierende Bi-cistronic Vektor (pAI218) verwendet. Um Induktion Dll1 Liganden bei der Beleuchtung zu überprüfen, wurden in den Inkubatoren, ausgestattet mit programmierten LED Blaulicht-Quellen, dargestellt in Abbildung 1 b und 1 CZellen kultiviert. Repräsentative Ergebnisse der Foto-induzierte Dll1 Ausdruck Proteindynamik von Western Blot Analyse erkannt werden in Abbildung 2 b und 2 Cangezeigt.
Um Zellen zu etablieren, die Kerbe Signalisierung Eingaben reagieren, verwendeten wir einen Tol2 System basierende Bi-cistronic Vektor (pAI177) tragen die destabilisierten Luciferase Reporter unter der Kontrolle des Veranstalters das Kerbe-Effektor-gen Hes1 und der phosphoglycerate Kinase (PGK) Projektträger-gesteuerte Kerne lokalisiert rot fluoreszierende Reporter H2B-mCherry. In diesem Fall eignet sich die fluoreszierende Reporter für Reinigung und einzellige tracking im Zeitraffer-Mikroskopie.
Sobald Foto-induzierbaren Absender und Empfänger Zellen erfolgreich etabliert sind, ist es bereit, dynamische Sender-Empfänger-Test durchführen, indem Co Kultivierung dieser Zellen (Abbildung 2A). In diesem Test die lichtempfindliche Absender Zellen, die das Notch-Liganden-Protein ausdrücken Dll1 auf blaue Beleuchtung wurden Co kultiviert mit den Foto-unempfindliche Empfänger-Zellen, die den endogenen Hes1 Oszillator und ein Biolumineszenz Hes1 Reporter (tragen pHes1-dLuc) (Abb. 2D). Die Empfänger-Zellen express endogen den Notch-Rezeptor ist empfänglich für Dll1 präsentiert von benachbarten Zellen.
Repräsentative Ergebnisse der dynamischen Sender-Empfänger-Assays sind in Abbildung 2E und 2Fgezeigt. Um die dynamischen Reaktionen der Empfänger Zellen mit Biolumineszenz Aufnahme zu erkennen, haben wir zuerst eine live-Cell-monitoring-System ausgestattet mit einem High-Sensitive-Photomultiplier (PMT) für das Photon zählen und eine LED-Blaulicht-Lichtquelle für Lichtstimulation ( Abbildung 1). Dieses System ermöglicht Echtzeit-Aufnahme von Biolumineszenz Signale auf Bevölkerungsebene mit geplanten Beleuchtung. Wenn diese zwei Arten von Zellen wurden gemeinsam kultiviert und sich wiederholende Beleuchtung (30 s Dauer, 2,5 h-Intervallen) ausgesetzt, waren zyklische Reaktionen der Empfänger Zellen nachweisbar unter verschiedenen Bedingungen der Mischungsverhältnisse (Abb. 2E). In diesem Beispiel angewandt wir Savitzky-Golay Filter (4te Ordnung und einem 13 Datenpunkt Fenster), um verrauschte Signale zu vermindern. Time-Lapse Mikroskopie mit sich wiederholenden Beleuchtung (2 min Dauer, 2,75 h-Intervallen) zeigte auch die synchronisierten Reaktionen der Empfänger Zellen auf der Ebene der einzelligen (graue Linien in Abbildung 2F) und auf Bevölkerungsebene (rote Linie in Abbildung 2F). diese Daten legen nahe, dass zyklische Expression von Dll1 Protein im Absender Zellen ausreichen, um die Hes1 Schwingungen in benachbarten Zellen Empfänger zu synchronisieren.
Abbildung 1: Strategie zur zelluläre Reaktionen auf optogenetische Störungen analysieren. (A) schematische Darstellung der repräsentativen Plasmid-Vektoren für dieses Protokoll verwendet. Diese Plasmide sind auf Anfrage erhältlich. (B) ein Foto von einer CO2 Inkubator mit einer blauen LED Vorrichtung unter Kultur ein 6-Well Zellplatte ausgestattet. (C) schematische Darstellung einer elektrischen Schaltung zur Regelleistung liefern für die LED-Lichtquelle durch ein programmierbarer Mikrocomputer. Ein Solid-State-Relais (SSR) wurde eingerichtet, um Relais ein-/Staaten digital PIN-out der Mikro-Computer an/aus-Zuständen der LED-Lichtquelle. (D) ein Foto und schematische Darstellung einer Leben-Zelle Biolumineszenz monitoring-System. Beachten Sie, dass die motorisierte Phase unidirektional aus einer Aufnahmeposition an der Oberseite der PMT-Detektor in eine Position der Beleuchtung an der Oberseite der LED-Lichtquelle bewegen kann. Beachten Sie, dass die PMT-Detektor von gut zu bewegen kann, gut, Signale aus den einzelnen Brunnen zu überwachen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beispiele für optogenetische Störung Experimente. In diesen Beispielen wurden murine C2C12 Myoblast Zelllinien verwendet. (A) schematische Darstellung der dynamischen Sender-Empfänger-Assay. (B, C) Repräsentative Ergebnisse der Licht-induzierten Dll1 Ausdruck von Western Blot Analyse analysiert. Dll1 Proteine wurden durch regelmäßige Beleuchtung mit höchstens 2,5 h, 2 min Dauer und der Intensität von 24,7 W/m2induziert. (D) Fluoreszenzbild Kokultur Systems von Sender und Empfänger Zellen. (E, F) Repräsentative Ergebnisse der dynamischen Sender-Empfänger-Assay. (E) zeitlichen Muster der Empfänger Antworten aufgezeichnet durch das Leben-Zelle-monitoring-System ausgestattet mit der Zlg. Die Ergebniszelle wurde auf 1,5 x 105 Zellen festgelegt, aber die Verhältnisse zwischen dem Absender und dem Empfänger verteilten sich von 5:1 bis 1:2. (F) Single-Cell Imaging ergab, dass oszillierenden Informationen, die durch regelmäßige Beleuchtung (2 min Dauer, 2,75 h-Intervallen) induziert wurde, wurde vom Absender zum Empfänger Zellen übertragen. 1,5 x 105 Zellen mit dem Sender-Empfänger-Verhältnis von 5:1 dienten. Adaptiert von Nr. 10. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir haben eine Methode zur Steuerung von gen Ausdruck Dynamik mit einer Periodizität von 2 bis 3 h gezeigt. Diese Zeitskala ist viel kürzer als die in anderen konventionellen Systemen, einschließlich der Tet-System und das Originalsystem LightOn. Wichtige Parameter, die ultradian Zeitskalen zu erreichen sind Halbwertszeiten von Foto-induzierte molekulare Produkte, mRNAs und Proteinen. Zelltypen und Arten können diese kinetische Parameter abhängen. Für die Optimierung der Kinetics, ist Hes1 3' UTR Sequenzen durch andere zu ersetzen eine unkomplizierte Möglichkeit, weil es nicht die Abläufe und Funktionen der Zielproteine ändert. Für die Suche nach anderen 3' wo wünschenswert pulsatile vor allem Zellen des Interesses Muster erhalten, Leben-Zelle Überwachung der dLuc durch leichte Induktion ist ein guter Ausgangspunkt und für Screening und Validierung verwendet.
Eines der am häufigsten gestellten Fragen ist über den täglichen Umgang mit lichtempfindlichen Zellen. Im Falle der dynamische Sender-Empfänger-Test der Notch signaling konnten wir Zelle Passagen unter Raumbeleuchtung, täglich zu tun, weil unsere Systeme (Foto-induzierbaren dLuc oder Dll1 Zellen und Empfänger) nicht, Zellproliferation ändern und schnell zur Ruhe zurück Staaten innerhalb von 6 Stunden, nachdem die Zellen zu einem dunklen Zustand verschoben werden. Wenn Gene von Interesse Schicksal-Bestimmung Faktoren sind, undichten Ausdruck kann induzieren zelluläre Differenzierung oder Erweiterungen der Zellen zu verhindern, und deshalb ist es wichtig, eine Rotlicht-Umgebung einrichten, um unerwünschte optogenetische Störung während zu vermeiden Zelle Handhabung.
In diesem Protokoll präsentierten wir Verfahren zur stabilen Zelllinien mit Foto-induzierbaren gen Expressionskassetten generieren. Dies ist ein entscheidender Schritt, zuverlässige Ergebnisse in der dynamischen Sender-Empfänger-Test zu erhalten. Man kann transiente Transfektion für die Einführung von optogenetische Modulen in Zellen betrachten, aber es funktioniert nicht gut in unseren Händen für quantitative Messungen der ultradian Impulse. Wir fanden, dass transiente Transfektion der Plasmide tragen UAS-Promotor Kassetten führt zu undichten Ausdruck auf relativ hohem Niveau auch unter einem dunklen Zustand. Diese undichten Ausdruck verursacht einen hohen Hintergrund ohne leichte Stimulation und behindert eine zuverlässige Messung der zeitlichen Verlauf. Eine alternative Methode zur stabilere Zellen zu etablieren ist ein Lentivirus System, die nützlich für Zelltypen, die nicht für die Transfektion12eignen. Klonale Zell-Linien präsentieren homogenere Antworten als heterogene Zell-Linien, aber auch in eine klonale Population-Zell-Antworten sind nicht immer einheitlich: einige Zellen reagieren nicht, leichte Stimulation und stellen daher eine verteilte Ebenen der Licht-induzierten Protein-Expression. Dies kann durch Variable Expressivität Ebenen hGAVPO Protein und/oder Variable endogene Fülle von Flavin, ein Chromophor für leichte Erfassung der hGAVPO erforderlich sein.
Die hier vorgestellten Protokoll ist ein leistungsstarkes Tool für die Analyse der gen-Expression-Dynamik, aber es gibt einige Einschränkungen. Ein Nachteil ist, dass einige Fluoreszenz-Kanäle für die live-Cell-Mikroskopie nicht kompatibel mit Blaulicht-Stimulation sind. Blaulicht-Beleuchtung aktiviert nicht nur die blau-lichtempfindliche Proteine, sondern auch fluoreszierende Proteine, einschließlich Grün und gelb fluoreszierende Proteine (GFPs und YFPs), die anfällig sind Foto-bleichen. Im Gegenteil, erfordert Visualisierung der GLP Blaulicht-Erregung, die unerwünschte Aktivierung von lichtempfindlichen Zellen während fluoreszierende Aufnahmen auslösen können. Bright-Feld (Phasenkontrast) Bildgebung durch ambient Lichtquelle ist auch unvereinbar mit Blaulicht-optogenetische Experimente, aber man kann dieses Problem umgehen, indem Sie mit grünen oder längere Wellenlänge Lichtquellen für die Bildgebung.
Der dynamische Sender-Empfänger-Test wäre sinnvoll für andere Signalwege zu untersuchen. Eine Möglichkeit ist eine Anwendung zur Sekretion von Signalanlagen. Für solche Analysen ist Anwendung gereinigte Liganden in Mikro-fluidischen Geräten eine alternative Möglichkeit zum Empfänger Zellen in eine präzise zeitliche16,17zu stimulieren. Allerdings sind diese Ansätze für dynamische Produktionsprozesse Liganden Moleküle in den Zellen der Absender nicht zugänglich. Einsatz des dynamischen Sender-Empfänger-Tests zusammen mit Foto-induzierbaren Liganden Ausdruck würde weitere Dissektion der Signalübertragung vom Absender zum Empfänger Zellen ermöglichen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von JST, PRESTO (A.I.), Core Research für evolutionäre Wissenschaft und Technik (JPMJCR12W2 (r.k.)), Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT), Japan unterstützt. 26119708 (A.I.) und 16 H 06480 (r.k.)), wissenschaftliche Forschung (A) (Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) 24240049 (r.k.)) und Nachwuchswissenschaftler (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)), und eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen "Fluoreszenz Live Bildgebung"des MEXT, Japan, und Plattform für dynamische Ansätze zu Living System von MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O.
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
