Análise do comportamento de crescimento de Arabidopsis thaliana em diferentes qualidades de luz

Arabidopsis thaliana tem sido o organismo modelo para pesquisadores da planta da época molecular por mais de duas décadas. Várias características fazem deste pequeno representante da família Brassica um candidato ideal para estudos genéticos e moleculares: tem um genoma relativamente pequeno com apenas cinco cromossomas (em comparação com , por exemplo, Nicotiana tabacum com 24 cromossomos) e seu genoma foi completamente sequenciada em 2000¹. A. thaliana podem ser facilmente geneticamente modificados por Agrobacterium infecção² e é passível de mesmo as mais recente genéticas ferramentas como CRISPR/Cas³. Embora pequeno, o ciclo de crescimento é rápido o suficiente para fazer experimentos bioquímicos viáveis onde uma maior quantidade de material é necessária. As plantas crescem em placas de ágar ou no solo e podem ser cultivadas como culturas líquido⁴. Arabidopsis pode ser crescido em armários climaticamente controlados, por exemplo, de Percival, em câmaras climáticas ou em estufas. Para ser capaz de comparar o comportamento de crescimento e analisar fenótipos mutantes é essencial para fornecer reproduzíveis e no mesmo tempo crescimento flexível condições⁵. Dependendo do problema científico que deve ser abordada uma precisar de diferentes temperaturas e condições de luz constantes, diversas intensidades luminosas ou qualidades de luz diferentes à mesma temperatura. A luz é um parâmetro muito crítico no crescimento das plantas e sua influência é frequentemente estudada em diversas abordagens⁶. Para garantir a reprodutibilidade e a comparabilidade dos dados obtidos é crucial assegurar uma saída estável e aplicar o mesmo tipo de fontes de luz.

As habituais fontes de luz em estufas e câmaras climáticas consistem de vapor de sódio ou lâmpadas fluorescentes, que promovem o crescimento de planta satisfatória, mas têm várias desvantagens. Primeiro, eles envelhecem com o tempo que muda a saída espectral não apenas em intensidade, mas em qualidade (observações próprias). No entanto, somente a intensidade é geralmente monitorada continuamente para que uma mudança na qualidade da luz pode passar despercebida, mas ainda tem efeitos significativos. Em segundo lugar, ambos os tipos de lâmpadas geram calor em intensidades mais elevadas de luz, que em si tem uma profunda influência fisiológica no crescimento das plantas e pode mascarar qualquer efeito dependente de luz. Em terceiro lugar, a saída espectral destas fontes de luz é invariável e diferente da luz natural do sol⁷. Todas estas desvantagens foram vencidas no caso de diodos emissores de luz)^8,9,10,11. Eles têm uma vida longa com quase nenhuma mudança na emissão, não produzem calor waste mesmo em intensidades luminosas muito altas e eles são muito flexíveis sobre sua saída espectral.

Aqui ilustramos como preparar uma câmara climática com luzes de LED separadas para luz branca, azul e vermelho e siga os diversos parâmetros de crescimento da planta ao longo do tempo. Medimos o peso fresco, área foliar, densidade de estômatos e desempenho fotossintético. Ao mesmo tempo, podemos demonstrar a importância da corretamente configurar avaliações estatísticas.

Este protocolo contém alguns exemplos de como analisar o comportamento do crescimento de plantas da . thaliana .

1. preparação

1. Antes de começar, faça um plano cuidadoso sobre quantas plantas serão necessários para fazer uma análise estatística confiável dos experimentos e depois Preparem as quantidades adequadas de potes.
   Nota: Sempre permita a possibilidade de que algumas sementes não podem germinar.
2. Use uma câmara climática com diferentes níveis de LED individualmente programáveis para comparar o crescimento de plantas sob as mesmas condições ambientais gerais (tabela de materiais).

2. planta de crescimento e set-up das luzes LED

1. Preparar o número apropriado (dependendo de diferentes condições e/ou mutantes a serem analisados) de vasos 6 x 7 cm com o solo e plantar uma semente em cada um deles.
   Nota: neste caso, 36 plantas por condições foram semeadas.
2. Vernalize por dois dias a 4 ° C.
3. Defina a umidade relativa do ar de 65% e a temperatura de 22 ° C/16 ° C para um dia de 16 h / h 8 ciclo de noite. Ajuste a luz de todos os níveis, a uma intensidade de 200 µM/cm2/s¹. Fazer isso inserindo os respectivos valores em um programa através do ecrã de toque na frente da câmara climática. Para comparar quatro diferentes qualidades de luz como os LEDs os seguintes parâmetros conforme fornecidas na tabela 1.

Tabela 1: composição de intensidades de luz emitida por diodo emissor de luz

4. Monitore a espectral saída continuamente, por exemplo, usando um espectrômetro interno calibrado.
5. Coloque as plantas na câmara climática em diferentes níveis e mantê-los cobertos com uma blusa transparente até bem desenvolvidos cotilédones são visíveis. Certifique-se que as plantas são regadas suficientemente.
6. Plantas de monitor e o documento pelo olho e fotograficamente tão frequentemente quanto necessário, dependendo de como as plantas crescem sob as condições escolhidas, por exemplo, em dois dias. Certifique-se de usar um tripé para a câmera, para garantir a igual distância entre a câmera e objetos para todas as fotos e, assim, permitir comparações. Use uma barra de escala quando apropriado.
   Nota: O termo Souza (dias após semeadura) refere-se a real plantio das sementes incluindo vernalização.

3. determinação do rendimento do FSII

1. Use um fluorímetro pulso modulada. Configurar a cabeça de câmera em uma distância adequada da planta para que o rosette completo pode ser visto na janela ao vivo.
2. Após iniciar o software aparece uma janela "selecionar unidade". Tick "MINI" e depois "okey". Escolha a cor "azul" na próxima janela pop-up. Clique em "okey".
   Nota: A fluorescência de pulso modulada luz de medição é automaticamente ligada. No monitor, aparece a janela de imagem mostrando o parâmetro de fluorescência Ft. Uma planta colocada sob a câmera agora pode ser vista como uma imagem de laranja.
3. Para focalizar a imagem e/ou escolher regiões específicas da planta, alterne para vídeo ao vivo, marcando a caixa "vídeo ao vivo" e rode o anel de ajuste da lente da objetiva. Sair da janela de vídeo ao vivo clicando na caixa de saída no canto superior direito.
4. Para medir parâmetros fotossintéticos, defina uma área de interesse (AOI). Use a configuração padrão para este, que é um círculo que automaticamente aparece no meio da tela. A caixa vermelha ao lado representa o valor de Ft em média de todos os pixels dentro da AOI. Defina o AOI adequado, escolhendo entre a caixa AOI no painel da direita, onde diferentes formas estão disponíveis. Clique em "Adicionar" na aba AOI e coloque o círculo de dentro da área da folha. Repeti cinco vezes por folha.
5. Manter as configurações (aba no canto direito) para os valores padrão fornecidos pelo fabricante (tabela 2).

Tabela 2: configurações padrão para as medições de PAM, conforme fornecido pelo fabricante.

6. Aplica um flash de luz saturante para realizar uma medição de parâmetros fotossintéticos por fluorescentes extinguer análise (pulso de saturação). Antes disso, determine os coeficientes de resfriamento medindo-se o rendimento de fluorescência mínima e máxima de uma planta de vez. Para este fim, coloca a planta no escuro (por exemplo, em uma gaveta ou caixa escura) por alguns minutos. Em seguida, coloque a planta sob a cabeça de câmara, marque as caixas de medida e ML (medição de luz), na linha abaixo a imagem escolha "Fv/Fm" por Clock dentro do círculo e clique em Fo, Fm na parte inferior da tela.
   Nota: Fo/Fm representa o rendimento do FSII de uma planta de vez. Assim, é o valor para o qual a medição após a aplicação de luz é normalizada. A medição de Fo/Fm atual permanecerá até que novo recorde é ativado. Todos os F e Fm' valores determinados por pulsos de saturação estão relacionados com Fo/Fm e têmpera parâmetros são calculados em conformidade.
7. Encontrar estes resultados na guia relatório e verificar todas as caixas do lado direito que são relevantes para o experimento (por exemplo. Y (II), qP, qN, etc.).
8. Exporte os resultados para uma análise de software por exemplo. Excel clicando no botão export no canto superior esquerdo e salvar sob o nome de arquivo apropriado. Gerar no mínimo cinco PUC por folha e medir várias folhas da mesma planta (não se esqueça de logo escuro adaptar-se a planta novamente após cada medição), bem como várias plantas de uma condição, que pode então ser estatisticamente avaliada.
9. Para análise estatística gerar valores médios e desvios-padrão de todas as PUC e pelo menos três usinas independentes para todos os pontos/condições de tempo e executam um de t-Student para avaliar se os dados forem significativas¹². Os dados são avaliados como significativamente diferentes quando os p-valores são abaixo de 0,05.

4. determinação da densidade de estomas

1. Coletar três folhas Roseta totalmente expandido de três plantas individuais por condição em etanol a 70% em um prato de petri de vidro e para extrair a clorofila. Incubar durante a noite neste solvente à temperatura ambiente ou em 4 ° C.
2. Para o completo afastamento de pigmentos, incubar em solução de hidrato de cloral (hidrato de cloral: água: glicerol = 8: 2: 1 w/v/w) até folhas aparecem completamente brancas.
3. Com a interferência diferencial imagens de microscopia (DIC) da superfície abaxial ampliação de 40 X. Contar os estomas do campo de visão e extrapolar com a ajuda da barra de escala de estomas por mm ². Repita que este procedimento pelo menos 4 folhas por condições. Realizar análise estatística por meio do cálculo do valor médio para todas as folhas de uma condição e com isto calcular o erro.

5. determinação do peso fresco

1. Remova todas as folhas, incluindo pecíolos de rosetas de seis plantas por condição com uma lâmina de barbear. Pesar todas as folhas imediatamente e submeter os dados para análises estatísticas, conforme descrito acima.

6. determinação da área foliar de Rosette

1. Use fotos de oito plantas por condição para analisar a área foliar graficamente. Combinar as fotos para uma condição em uma única imagem e salvar como *. jpeg ou *. TIFF.
2. Baixe o software apropriado (tabela de materiais).
   Nota: É, claro, possível aplicar qualquer outro programa capaz de realizar esta tarefa.
3. Abra um arquivo de imagem. Escolha a ferramenta "mão livre seleção." Cercar incluindo pecíolos de uma roseta de folhas. Clique em "Analyze - conjunto de medições" e verificar a "Área", "Min & Max cinza valor," "Densidade integrada" e "Valor médio cinzento." Escolha decimal apropriado lugares, o melhor é dois ou três e clique em "okey".
4. Para obter o mm² em vez de pixels use o comando "set escala". Aplicar a ferramenta de seleção linear para fazer uma seleção de linha que corresponde a uma distância conhecida, por exemplo, o diâmetro de licença que é fácil de calcular a partir da barra da escala das imagens, em seguida, abra a caixa de diálogo Definir escala e digite esta distância definida e unidade de medição. Então volte para "analisar" e clique em "medida".
5. Uma nova janela aparece intitulados "resultados" que contém os dados relevantes para o atual rosette. Repita este procedimento com todas as plantas na imagem e inicializar as medições de área para cada planta nova com Ctrl + M.
   Nota: Para pequenas plantas com folhas não-sobreposição a ferramenta"varinha" pode ser usada para tornar o processo mais fácil e mais rápido. Assim que começam a folhas cobrindo uns aos outros, esta ferramenta não dá resultados confiáveis.
6. Alternativamente, cortar todas as folhas e posicioná-los de forma que um quadro de visão podem ser tomadas e em seguida, use a ferramenta varinha. Leve em consideração que ao usar esse método, são necessários mais plantas.
7. Escolha "Arquivo"-"Salvar como" na janela de resultados e gerar um nome de arquivo apropriado e um local no diretório do computador. O arquivo será salvo automaticamente no formato Excel.

7. preparação do RNA

1. Colha três amostras de dez plantas individuais para cada condição. Extraia o RNA total usando uma planta kit de extração de RNA de acordo com as instruções do fabricante. Determine o RNA concentração, pureza e integridade usando um bioanalyzer. RNA pode ser usado para aplicações a jusante, tais como análise de expressão de qRT-PCR ou gene por , por exemplo, RNASeq¹³.

Observação e análise do crescimento das plantas e especialmente os fenótipos de plantas mutantes dependem de condições ambientais estáveis e reprodutíveis. Estes podem ser fornecidos em câmaras climáticas. Quantidade de luz e especialmente a qualidade depende criticamente a fonte de luz independente, que neste estudo foi fornecida por luzes LED.

A Figura 1 mostra um exemplo de uma câmara climática equipado com painéis de LED. A figura 1A mostra uma captura de tela do painel de controle onde todas as condições climáticas e de luz podem ser ajustadas. Dentro de 24 h vinte diferentes períodos de tempo pode ser definidos. Neste exemplo, condições de dia longo, com 16 h de luz/8 escuro foram programadas. Esta câmara dispõe de quatro níveis que podem ser programados separadamente para que o crescimento da planta em quatro diferentes configurações de luz pode ser estudado exatamente nas mesmas condições ambientais. Nível superior é definida como uma saída espectral imitando a luz do sol, tanto quanto tecnicamente possível, o superior representa certo nível elevado vermelho (660 nm) e a luz azul (440 nm) com reduzida luz branca (3K). O nível inferior esquerdo foi definido como elevados de luz azul e piso inferior direito para predominantemente a luz vermelha. Figura 1B ilustra os LEDs as configurações diferentes como uma visão geral (painel central) e o respectivo zoom-ins (pequenos painéis exteriores). A diferença de qualidades de luz pode ser facilmente vista pelo olho.

Um espectrômetro inbuilt constantemente mede, monitora e ajusta a saída espectral. A Figura 2 mostra o espectro da esquerda nível superior 1.1, que foi criado para imitar a luz do sol. Em comparação com uma lâmpada fluorescente padrão a porção de luz UV e azul é muito maior que7.

Na Figura 3 um exemplo da . thaliana plantas de todos os dias quatro condições, 10, 13 e 17, respectivamente, após a sementeira é retratada. Todas as plantas foram fotografadas utilizando a mesma distância por montar a câmara num tripé. A barra de escala representa 1 cm. Após 10 dias, não há muita diferença no tamanho ou cor pode ser discernida, mas depois de 17 dias um crescimento mais rápido sob luz vermelha é óbvio. Além desta análise visual, realizaram-se várias análises fisiológicas.

Figura 4 segue as diferentes etapas de medições de PAM, que analisa , por exemplo, a capacidade fotossintética. Na Figura 4A um screenshot do vídeo ao vivo é mostrado, que é a configuração para trazer a planta em foco para garantir a qualidade das medições. Ao invés de focar em toda a planta, um pode também escolher uma única folha para analisar. Figura 4B demonstra o atual rendimento fluorescente Ft de planta uma vez iniciada a medida real. Neste caso, cinco áreas circulares de interesse (PUC) foram escolhidas. Os números nas caixas de vermelho ao lado de cada AOI diretamente dá o resultado numérico, o que também pode ser conservado na forma de uma tabela. Para iniciar a medição de parâmetros fotossintéticos Fo, Fm precisa definir. Um screenshot de Ft depois de fazer isso é descrito na Figura 4. Observe que agora o botão "Fo, Fm" não está mais ativo. Para iniciar uma nova medição, "Novo registro" precisa ser clicado para apagar a normalização anterior. Finalmente, a Figura 4 mostra o rendimento quântico efectivo do FSII y (II) depois de dar um pulso de luz saturante ("SAT-pulso"). Quantificação de dados exemplares é mostrada na Figura 5. As plantas crescidas sob luz solar de 200 µM/cm2/s1 (Figura 5A) foram analisadas 12, 21 e 28 dias após a semeadura, respectivamente. Nossos dados demonstram que o rendimento do FSII é significativamente maior em folhas de plantas cultivadas por três semanas, do que por 12 dias. A diferença entre os dias 12 e 28 é ainda significativa, mas o p-valor é maior. Na Figura 4B, foram comparados do FSII rendimentos de plantas cultivadas para diferentes qualidades de luz daqui a duas semanas. Curiosamente, crescimento permanente sob luz contendo uma parcela elevada da luz azul leva a um rendimento significativamente maior do FSII. Um efeito similar foi observado para plantas cultivadas sob enriquecido de luz vermelha, mas o aumento foi um pouco menor.

Diferentes qualidades de luz foram mostradas para efeito de desenvolvimento de estomas14. Portanto, a densidade estomática foi investigada. A Figura 6 demonstra como parece uma folha após a extração do pigmento. Células epidérmicas única podem ser bem distintos, e estoma pode facilmente ser contabilizada. Na figura, estomas individuais são indicadas por um asterisco. Dados detalhados sobre a densidade estomática das plantas das diferentes configurações de luz podem ser encontrados em outro lugar9.

Além de inspeção visual (Figura 3) o peso fresco fornece uma boa medida do progresso de crescimento. Neste exemplo, folhas de plantas cultivadas sob a "luz solar", depois 8, 10 e 12 dias após a semeadura, respectivamente, foram pesadas. Avaliação estatística desses dados pode ser vista na Figura 7. Como esperado, o peso fresco aumenta com o tempo.

Além de peso fresco, a área foliar é uma boa medida para o crescimento. Aqui, o desenvolvimento da planta foi seguido de 10, 13 e 17 dias após a semeadura (Figura 8A). Pelo menos seis plantas individuais foram avaliadas rotineiramente para obter dados estatísticos fiáveis. Para demonstrar a importância de um tamanho de amostra alta, calculou-se a percentagem de erro da média, da análise de dois e seis plantas, respectivamente, (Figura 8B). Isso significa que a porcentagem do desvio padrão no que se refere o valor médio foi determinada. É muito claro que, no caso de um pequeno tamanho da amostra, o erro é 5-10% maior do que no caso de um tamanho maior de amostra. Aumentando o número de plantas que são avaliados, o erro pode ser minimizado, o que torna a interpretação de dados muito mais claras.

Figura 1: diferentes qualidades de luz são fornecidas por LEDs. A) Screenshot no painel de controle da câmara de LED. Comprimento do dia é definido como 16 h (canto superior direito) e a intensidade da luz é definida como 200 µmol cm-2 s-1. A qualidade da luz é diferente em todos os quatro níveis: 1.1 representa um espectro como semelhante à luz solar como tecnicamente possível, 1.2 representa uma elevada percentagem de vermelhos e azuis comprimentos de onda (RB) luz, 2.1 situa-se predominantemente de azul (B), 2,2 representa principalmente vermelha luz (R). B) o painel do meio mostra uma visão geral de todos os níveis; os painéis exteriores mostram níveis individuais em um zoom maior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: espectro de comprimento de onda entre configurações de luz solar simulada. É mostrado um screenshot do espectrómetro embutido na câmara de LED, que foi posicionado no nível a 1.1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: planta de desenvolvimento ao longo de uma semana. Representante a. thaliana plantas de todas as quatro condições de luminosidade de 10, 13 e 17 DAS. As plantas foram fotografadas com uma câmera reflex digital em um tripé. Barra de escala representa 1 cm para todas as imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Screenshots de passos representativos das medições de PAM de plantas a. thaliana . A) Screenshot do vista "Ao vivo de vídeo", onde o foco da imagem pode ser ajustado. B) atual rendimento de fluorescência Ft antes da aplicação de qualquer pulsos de luz. C) atual rendimento de fluorescência Ft após configuração da Fo/FM D) rendimento de quântica do FSII efetuando depois de definir um pulso de luz saturante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: representação gráfica de rendimento quântico de efetuar do FSII (YII). A) dados de plantas 12, 21 e 28 dias após a semeadura e crescido abaixo dos 200 µmol/cm2/s1 sob a luz do sol simulado ("sol") sujeito a análise de PAM foram avaliados estatisticamente. São mostrados os valores médios de cinco plantas e cinco PUC por dia. Um asterisco indica uma diferença significativa com um p-valor < 0,05 quando comparado com o dia 12 e dois asteriscos indicam diferenças muito significativas com um p-valor < 0,02 de acordo com o teste-t de estudantes. B) dados de plantas cultivadas em 200 µmol/cm2 /s1 sob luz solar simulada (SL), enriquecido azuis (B) ou vermelho (R) luz, respectivamente, foram avaliados estatisticamente. São mostrados os valores médios de cinco plantas e cinco PUC por dia. Calcularam-se diferenças significativas em comparação com a "luz do sol."

Figura 6: imagem representativa dos estomas no lado abaxial da folha da . thaliana . Folhas preparadas como descrito acima e visualmente foram analisadas sob um microscópio óptico com configurações de DIC na ampliação de X 40. Estomas são contadas na área visível de pelo menos 4 folhas por condição. A foto foi tirada com uma câmera digital conectada ao tubus microscópio. O número de estômatos por mm ² é calculado com a ajuda da barra de escala. Estrelas indicam um único orifício. A barra de escala representa 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: representação gráfica de peso fresco de plantas da . thaliana cultivadas no simulado luz solar/200 µmol/cm2/s1. Roseta de folhas foram cortadas de plantas, oito, dez e doze dias após a semeadura. Valores médios em mg de seis plantas por dia são retratados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Avaliação estatística da . thaliana área foliar de plantas cultivadas sob diferentes condições de luz. A) área foliar da. thaliana cultivada para 10, 13 e 17 dias determinou-se graficamente com ImageJ e dados de n = 6 plantas foram avaliadas estatisticamente. A área foliar de todos os seis rosetas de cada condição foi resumida e dividida por seis para obter o valor médio. Com esse valor, calculou-se o desvio-padrão, e isso é representado pelas barras de erro. B) área foliar foi determinada graficamente com ImageJ e dados a partir de qualquer n = 2 ou n = 6 plantas, respectivamente, foram analisados estatisticamente conforme descrito para painel A. Então o erro em percentagem do valor médio foi calculado e representado graficamente. Barras em verde mostram o erro percentual da análise de n = 6, azul Barras de n = 2 plantas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.