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Artigo de método

Equivalentes de tridimensional tecido humano inflamatória da gengiva

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DOI:

10.3791/57157

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3 de abril de 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology, The Nippon Dental University, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Nippon Dental University Hospital

Neste artigo

Resumo

O objetivo do protocolo é construir um modelo de gengiva humana inflamatória em vitro. Este modelo de tecido co cultiva três tipos de células humanas, HaCaT queratinócitos, fibroblastos gengivais e macrófagos THP-1, sob condições tridimensionais. Este modelo pode ser aplicado para investigar doenças periodontais, como gengivite e periodontite.

Resumo

Doenças periodontais (tais como gengivite e periodontite) são as principais causas de perda dentária em adultos. Inflamação na gengiva é fundamental fisiopatologia das doenças periodontais. Atuais modelos experimentais de doenças periodontais foram estabelecidos em vários tipos de animais. No entanto, a fisiopatologia de modelos animais é diferente dos seres humanos, dificultando a mecanismos celulares e moleculares de analisar e avaliar novos medicamentos para doenças periodontais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reconstruir equivalentes de tecido humano inflamatória da gengiva (iGTE) em vitro. Primeiro construímos equivalentes de tecido humano da gengiva (GTE), utilizando dois tipos de células humanas, incluindo fibroblastos gengivais humanos (HGF) e pele humana queratinócitos epidérmicos (HaCaT), sob condições tridimensionais. Criamos um modelo de ferida usando um furador de tecido para fazer um buraco na GTE. Em seguida, humanos monócitos THP-1 misturados com gel de colágeno são injetados no furo do GTE. Por adimistration de 10 ng/mL phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) para 72 h, THP-1 células diferenciadas em macrófagos aos focos inflamatórios da forma no GTE (iGTE) (IGTE também pode ser stumilated com 2 µ g/mL de lipopolissacarídeos (LPS) para 48 h iniciar a inflamação ). IGTE é o primeiro em vitro modelo da gengiva inflamatória usando células humanas com uma arquitetura tridimensional. IGTE reflete grandes mudanças patológicas (immunocytes activition, interações intracelulares, entre fibryoblasts, células epiteliais, monócitos e macrófagos) em doenças periodontais. GTE, GTE ferido e iGTE podem ser usados como ferramentas versáteis para estudar a cicatrização de feridas, regeneração tecidual, inflamação, interação célula-célula e tela potenciais medicamentos para as doenças periodontais.

Introdução

As doenças periodontais são a principal causa de perda dentária em adultos. Gengivite e periodontite é as doenças periodontais mais comuns. Ambos apresentam alterações inflamatórias mediada por biofilme agudas ou crônicas na gengiva. A gengivite é caracterizada por inflamação aguda, Considerando que a periodontite apresenta-se geralmente como uma inflamação crônica. A nível histológico, componentes bacterianas desencadear a ativação de células do sistema imunológico, tais como macrófagos, linfócitos, plasmócitos e mastócitos1,2. Estas células imunes, especialmente os macrófagos, interagirem com as células locais (incluindo células epiteliais gengivais, fibroblastos, células endoteliais e osteoblastos) resultando em lesões inflamatórias no tecido periodontal3,4. Modelos experimentais de doenças periodontais foram estabelecidos em vários tipos de animais, como ratos, hamsters, coelhos, furões, caninos e primatas. No entanto, a fisiopatologia de modelos animais é diferente dos seres humanos, dificultando a mecanismos celulares e moleculares de analisar e avaliar novos medicamentos de doenças periodontais5. Co de cultivo de bactérias periodontais e células epiteliais oral humanas monocamada serviu para investigar o mecanismo das infecções periodontais6. No entanto, culturas de monocamadas de células orais faltam a arquitetura de celulares tridimensional (3D) do tecido intacto; Portanto, eles não podem imitar a situação em vitro .

Aqui, equivalentes 3D tecido humano inflamatória da gengiva (iGTE) são criados para representar doenças periodontais em vitro. Este modelo 3D das doenças periodontais ocupa uma posição intermediária entre as culturas de células monocamadas e modelos animais. Três tipos de células humanas, incluindo HaCaT queratinócitos, fibroblastos gengivais e THP-1 macrófagos, são co cultivados em gel de colágeno e estimulados pela inflamatórios iniciadores para construir iGTE. IGTE intimamente simula as condições na vivo de diferenciação celular, interação célula-célula e ativação de macrófagos na gengiva. Este modelo tem muitas aplicações possíveis drogas triagem e testando novas abordagens farmacológicas em doenças periodontais, bem como para analisar os mecanismos celulares e moleculares na cicatrização de feridas, inflamação e regeneração de tecidos.

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Protocolo

Este protocolo é projetado para criar modelos de gengivite, modelos de ferimento gengival e equivalentes de tecido gengival humano. Pele humana queratinócitos epidérmicos (HaCaT) foram gentilmente cedidos do Professor Norbert E. Fusenig do Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Alemanha)7. Fibroblastos gengivais humanos (HGFs) foram isolados a partir de tecidos gengivais, de acordo com os protocolos anteriormente publicados8. Foi obtido consentimento previamente, e o estudo foi aprovado de acordo com as orientações definidas pelo Comitê de ética, a Nippon Dental Universidade escola de vida Odontologia em Tóquio (número de autorização: NDU-T2012-35). Protocolo etapas 1-3 devem ser executadas em uma capa de cultura de células.

1. preparação do tecido humano 3D equivalentes da gengiva (GTE) (figura 1A)

  1. Mix-colágeno tipo-A gel com 10% concentrados MEM-alfa e buffer de reconstrução de 10% (2,2 g de NaHCO3 e 4,47 g HEPES em 100 mL 0,05 N NaOH) em um tubo estéril 15 mL por pipetagem. Conservar a solução mista de colágeno no gelo até usado.
  2. Coloca uma placa de 24 inserções 24-poço de cultura (poros tamanho 3,0 µm).
  3. Remova HGFs da cultura superfície usando a solução de EDTA-tripsina 0,25%. Suspender as células em 10 mL de meio de cultura A (alfa-MEM + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Conte as células por um contador de célula Bürker-Türk.
    1. Extrair a quantidade desejada de células (1-5 x105 células/mL) e, em seguida, centrifugar durante 4 min a 190 x g.
    2. Suspenda as células na solução mista de colágeno. Manter a mistura no gelo até o próximo passo.
  4. Adicione 0,5 mL da mistura de célula-colágeno (0.5-2.5 x 105 células/poço) para inserir a cultura sem produzir quaisquer bolhas. Incube a mistura por 10 a 30 min em um ambiente umidificado com 5% CO2 a 37 ° C para coagular a mistura em um gel.
    Nota: Adicione a mistura de colágeno no centro da inserção da cultura, para evitar formação desigual de gel de colágeno.
  5. Adicione 1 mL do meio de cultura para o bem e 0,5 mL para a inserção. Incubar a placa de cultura para 24h ou durante a noite em um ambiente umidificado com 5% CO2 a 37 ° C.
  6. Remova HaCaT células da superfície da cultura usando a solução de EDTA-tripsina 0,25%. Suspender as células em 10 mL do meio B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) e contar as células. Extrair a quantidade necessária de células (1 – 5 x 105 células/mL) com uma pipeta, centrífuga para 4 min em x 190 g. suspender as células em média B.
  7. Remova o meio das inserções de cultura, que contêm a mistura de HGF-colágeno, por aspiração. Adicione 0,5 mL de suspensão de células HaCaT (0.5-2.5 x 105 células/poço) no topo da mistura de HGF-colágeno. Incube as culturas por 24 horas ou durante a noite.
    Nota: Neste ponto do tempo, o meio na cultura bem deve ser A média, enquanto a média na inserção da cultura deve ser médio B.
  8. Substituir o meio de cultura com meio KSR (meio de cultura co) (MEM-alfa + 15% de substituição de soro nocaute + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Adicione 1 mL do meio de cultura para a cultura bem e 0,5 mL para a inserção da cultura. Incube as culturas por 24 – 48 h.
  9. Substituir o meio de cultura com KSR médio + 1% FBS. Adicione 1 mL na cultura bem e 0,5 mL para a inserção de cultura. Incube as culturas por 24 horas ou durante a noite.
  10. Substituir o meio de cultura na cultura bem com 0,7 a 1 mL de meio de KSR. Remova completamente o meio de inserção da cultura (a superfície de cultura deve ser exposta ao ar). Incube as culturas por 1 – 2 semanas. Mude o meio na cultura bem duas vezes por semana.
    Nota: Não deixe que a ascensão de nível média acima da superfície da cultura (a camada superior composta por queratinócitos). Mantenha sempre a superfície de cultura seca.

2. preparação do GTE ferido (figura 1B)

  1. Prepare um perfurador de tecido 1 a 3 mm de diâmetro. Esterilize-a com uma autoclave a 121 ° C por 20 min.
  2. Empurre o perfurador de tecido perpendicularmente GTE sobre 300 µm profundo e um buraco no tecido para simular um ferimento.
  3. Neste passo, use o GTE ferido para investigar a regeneração de tecido e cura ferida. Alternativamente, conserte a GTE usando solução de tampão neutro de formalina 10% para realizar a análise histológica.

3. preparação do GTE inflamatória (iGTE) (figura 1B)

  1. Cultive células THP-1 de acordo com o relatório anterior9.
  2. Mix-colágeno tipo-A gel com 10% concentrados RPMI 1640, buffer de reconstrução de 10% (2,2 g de NaHCO3 e 4,47 g HEPES em 100 mL 0,05 N NaOH) e 10 ng/mL PMA. Manter a solução de colágeno misto no gelo até o uso.
  3. Contagem de 1 – 2 x 106 THP-1 células e centrifugar durante 4 minutos a 190 x g. suspender as células em 1 mL da solução mista de colágeno. Manter a mistura no gelo até o próximo passo.
  4. Adicione a mistura de THP-1-colágeno do 10 a 30 µ l para a área de feridos do GTE. Substituir o meio de cultura para 0,7-1 mL de meio de KSR contendo 10 ng/mL de PMA.
  5. Incube a mistura em um ambiente umidificado com 5% CO2 a 37 ° C por 72 h.
  6. Usar o modelo para investigar a gengivite ou doença periodontal (por exemplo, adicionar o potencial medicamento anti-inflamatório para iGTE para ver seus efeitos sobre a liberação de citocinas10). Alternativamente, omitir PMA-tratamento de 72 h, adicionar 2 µ g/mL de LPS na cultura e incubar o tecido em um ambiente umidificado com 5% CO2 a 37 ° C por 48 h11,12.

4. fixação e toda montagem imunocoloração de GTE e iGTE culturas

  1. Fixação das culturas.
    1. Remova a placa de 24, o meio de cultura. Lave os tecidos 2 vezes com solução salina tamponada fosfato (PBS).
    2. Adicione 1 mL de solução-tampão neutro de formalina 10% para a inserção e 1 mL da cultura bem. Deixe a placa de 24 em um refrigerador a 4 ° C durante a noite.
    3. Remova a solução-tampão neutro de formalina 10% no dia seguinte.
    4. Para toda montagem imunocoloração, lave os tecidos 3 - 4 vezes com PBS após a fixação.
    5. Por hematoxilina e eosina (H & E) coloração e imunocoloração regular, prosseguir com a desidratação, incorporação de parafina e de corte.
      Nota: Para toda montagem imunocoloração, esta etapa pode ser omitida.
  2. Toda montagem de imunocoloração
    Nota: Este protocolo foi modificado na referência 13.
    1. Lavar os tecidos 3 x em PBS 0,5 – 1% Triton, 10 – 30 min cada tempo.
    2. Incubar os tecidos duas vezes por 30 min em tampão de bloqueio (PBS 1% Triton + 10% BSA), à temperatura ambiente.
    3. Lave os tecidos 2 × em tampão de bloqueio, 5 – 10 min cada tempo.
    4. Adicione 50 µ l de solução de anticorpo primário na concentração/diluição necessária para as inserções. Use um filme de plástico plástico fino para encapsular as inserções para evitar a secagem do tecido.
    5. Incubar o tecido durante 1 a 2 dias a 4 ° C.
    6. Lavar os tecidos 3 vezes, por 30 min em PBS 1% Triton + 10% de BSA. Lave novamente 3 vezes, por 5 min em PBS 1% Triton.
    7. Adicionar 50 µ l de anticorpo secundário em tampão de bloqueio (PBS 1% Triton + 10% BSA) e 5 µ l de solução de Hoechst 33342 (mancha de NucBlue ao vivo celular) para cada inserção. Use um filme de plástico plástico fino para encapsular as inserções para evitar a secagem do tecido.
    8. Incubar durante 1 a 2 dias a 4 ° C. Embrulhe a placa de 24 em uma toalha de papel molhada e depois colocá-lo em um bloco de plástico a ser usado ao longo de incubação.
    9. Lavar os tecidos 3 vezes, por 10 min em Tritão de 1% de PBS
    10. Use uma agulha afiada para cortar a membrana da inserção da cultura para obter o tecido. Lugar da membrana para um slide.
      Nota: O tecido deve ser na membrana.
    11. Adicione 2 a 3 gotas de meio de montagem de fluorescência. Cubra o tecido com uma tampa de vidro e a loja a 4 ° C, no escuro até análise.
    12. Ver os tecidos com um laser confocal, microscopia (LSM).

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Resultados

As células HaCaT exibidas morfologia típica queratinócito sob observação microscópica de contraste de fase (Figura 2A). Scanner elétron microscópico (SEM) imagens mostrou que as superfícies de célula HaCaT estavam cobertas por muitos microvilli. Conexões intercelulares entre células de HaCaT foram mediadas por processos de membrana (Figura 2B). HaCaT células expressaram epitélio gengival marcador K8/1814, ...

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Discussão

Este protocolo é baseado em métodos de criação de equivalentes de tecido gengival e equivalentes de tecido adiposo subcutâneos descritos por anteriores relatórios8,21,22. Embora este seja um método simples e fácil, algumas etapas requerem atenção especial. Por exemplo, a mistura de colágeno deve ser mantida no gelo até o uso para evitar a formação de gel na solução. Ao adicionar a mistura de colágeno para a inserção de cultura, ...

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Divulgações

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado em parte pela sociedade do Japão para o promoção da ciência (JSPS) subsídio para a investigação científica (26861689 e 17 K 11813). Os autores gostaria de agradecer o Sr. Nathaniel Green para revisão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tipo Inc do colagênio I-ANitta Parafazer a derma de GTE
MEM-alfaThermo Fisher Scientific11900073Meio de cultura
Inserção de cultura celular (para placa de 24 poços), tamanho do poro 3,0 μ mCorning, Inc.353096Para cultura de tecidos
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Reagente de cultura de células
DMEMThermo Fisher Scientific31600034Meio de cultura de células
KnockOut Substituição de soroThermo Fisher Scientific10828028Reagente de cultura de células
Perfurador de tecidoShibata system service co., LTDSP-703Para furos de perfuração em GTE
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific31800022Meio de cultura de células
BSASigma-AldrichA3294Para imunocoloração
Hoechst 33342 (coloração de células vivas NucBlue)Thermo Fisher ScientificR37605Para rotular núcleos
Meio de montagem de fluorescênciaDakoPara montagem de amostras após imunocoloração
Anticorpo anti-citoqueratina 8+18 [5D3]abcamab17139Para identificar o epitélio
Microscópio eletrônico de varreduraHitachi, Ltd.HITACHI S-4000Para observar a topografia e composição da superfície das amostras
Microscopia confocal de varredura a laserLSM 700; Fornecedor verificado - Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.LSM 700Para observar a coloração de imunofluorescência das amostras
Anticorpo anti-citoqueratina 19abcamab52625Para identificar epitélio
Anticorpo anti-vimentinaabcamab92547Para identificar fibroblastos e macrófagos ativados
Anticorpo anti-TE-7MilliporeCBL271Para identificar fibroblastos na derme
Anti-CD68 anticorpoSigma-AldrichSAB2700244para identificar macrófagos
Anticorpo CD14 humanoR& D SystemsMAB3832-SPPara identificar macrófagos
Alexa Fluor 594-conjugado anticorpo secundário de cabra anti-coelhoThermo Fisher ScientificA11012Para coloração de imunofluorescência
Alexa Fluor 488-conjugado anticorpo secundário de cabra anti-ratoThermo Fisher ScientificA11001Para coloração de imunofluorescência
EVOS FL Cell Imaging SystemThermo Fisher ScientificPara observar as células de coloração de imunofluorescência da amostra
THP-1de células Riken BRCRCB1189Para fazer iGTE
PMA (Phorbol 12-miristato 13-acetato)Sigma-AldrichP8139Para diferenciar células THP-1
celular Banco

Referências

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