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Artigo de método

Química amputação e regeneração da faringe nos Turbellaria mediterranea Schmidtea

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⸱

DOI:

10.3791/57168

⸱

26 de março de 2018

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, College of Veterinary Medicine, Cornell University

Neste artigo

Resumo

A Turbellaria mediterranea Schmidtea é um excelente modelo para o estudo de células-tronco e regeneração de tecidos. Esta publicação descreve um método para remover seletivamente um órgão, a faringe, expondo os animais para a química de azida sódica. Este protocolo também descreve métodos para monitorar a regeneração da faringe.

Resumo

Boca é platelmintos que são extremamente eficientes em regeneração. Eles devem esta capacidade a um grande número de células-tronco que podem responder rapidamente a qualquer tipo de lesão. Modelos de lesões comuns nestes animais remover grandes quantidades de tecido, que danifica a vários órgãos. Para superar este dano de tecido largo, descrevemos aqui um método para remover seletivamente um único órgão, a faringe, na Turbellaria Schmidtea mediterranea. Conseguimos isso por animais de imersão em uma solução contendo o citocromo oxidase inibidor de azida sódica. Breve exposição a azida de sódio provoca extrusão da faringe do animal, que chamamos de "amputação química." Amputação química remove a faringe inteira e gera uma pequena ferida onde a faringe anexa para o intestino. Após enxaguar extensa, todos os animais amputados regeneram uma faringe totalmente funcional em cerca de uma semana. Células-tronco no resto do corpo conduzir a regeneração da faringe nova. Aqui, nós fornecemos um detalhado protocolo para amputação de química e descrever métodos histológicos e comportamentais para avaliar o sucesso amputação e regeneração.

Introdução

Regeneração é um fenômeno que ocorre em todo o reino animal, com capacidades regenerativas de regeneração de corpo inteiro em certos invertebrados para habilidades mais restritas em vertebrados1. Substituição de tecidos funcionais é um processo complexo e muitas vezes implica a restauração simultânea de vários tipos de células. Por exemplo regenerar o membro salamandra, osteoblastos, condrócitos, neurônios, músculos e células epiteliais precisa ser substituído2. Estes tipos de células recém-gerado também precisam ser organizado corretamente, para facilitar a nova função de membro. Compreensão destes processos complexos requer técnicas que se concentram na regeneração de tipos específicos de células e a sua integração em órgãos.

Uma das estratégias empregadas para simplificar o estudo das respostas regenerativas é a ablação alvo de certos tipos de célula ou maiores coleções de tecidos. Por exemplo, no zebrafish, expressão de nitroreductase em tipos específicos de células leva à sua destruição após a aplicação de metronidazol3,4. Em larvas de Drosophila , expressar genes pro-apoptotic sob promotores tecido-específica pode seletivamente ablate regiões específicas do disco imaginária5,6. Ambas estas estratégias causam dano rápido mas controlado e têm sido usadas para dissecar os mecanismos moleculares e celulares responsáveis pela regeneração.

Este manuscrito, descrevemos um método para ablate seletivamente um órgão inteiro chamado faringe na Turbellaria Schmidtea mediterranea. Boca é um modelo clássico de regeneração, conhecido por sua capacidade regenerativa prolífica, onde fragmentos mesmo minutos podem regenerar toda animais 7,8. Eles têm uma população grande e heterogênea de células-tronco que consiste de células pluripotentes e restrita a linhagem progenitores9,10,11. Estas células proliferam e se diferenciam para substituir todos os tecidos desaparecidos, incluindo a faringe, sistemas nervosos, digestivos e excretoras e músculo e células epiteliais9,10,12. Enquanto nós sabemos que essas células-tronco iniciar a regeneração, podemos não compreender plenamente os mecanismos moleculares que conduzi-los para substituir todos esses diferentes tipos de células. Definidos métodos ferindo que eliciam respostas precisas células-tronco podem ajudar a delinear este complexo processo.

A faringe é um tubo cilíndrico, grande necessário para a alimentação e contém neurônios, músculos, células epiteliais e secretora13,29. Normalmente escondidos em uma bolsa no lado ventral do animal, que se estende através do único corpo do animal, abrindo em cima sentindo a presença de alimentos. Para seletivamente amputar a faringe, nós mergulhe a boca em uma químico chamado azida sódica, uma anestesia comumente usada em c. elegans14,15,16. Seu uso na boca foi primeiramente relatado por Adler et al., em 2014,12. Em poucos minutos de exposição a azida de sódio, boca extrude seus pharynges, e com agitação suave, faringe desconecta-se do animal. Nos referimos a esta perda completa e seletiva da faringe como "química amputação". Uma semana após a amputação, uma faringe totalmente funcional é restaurado12. Porque a faringe é necessária para a alimentação, regeneração funcional pode ser medida pelo monitoramento do comportamento alimentar. Abaixo, descrevemos o protocolo para amputação de química e para avaliar a regeneração da faringe e restauração do comportamento alimentar.

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Protocolo

1. preparação

  1. Preparação da água de planária 17
    1. Manter a boca em uma solução de sal de X Montjuïc 1. Para preparar Turbellaria água, certifique-se soluções de ações individuais de 1 M CaCl2, 1m MgSO4, 1 M MgCl2, 1m KCl e 5 M NaCl em água ultrapura. Filtro-esterilizar com um armazenamento de longo prazo de garrafa-top filterfor de 0,2 µm.
      Nota: Use apenas água desionizada ultrapura (com uma resistividade de 18,2 MΩ a 25 ° C) para preparar Montjuïc sais.
    2. Para preparar um estoque de 1 L de solução de sal de 5 X, combinam-se 5 mL de 1 M CaCl2, 5ml de 1 M MgSO4, 0,5 mL de MgCl2, 0,5 mL de KCl e 1,6 mL das soluções de NaCl 5m em 900 mL de água ultrapura. Para esta solução, adicionar 0,504 g de NaHCO3 e mexa para misturar. Ajuste o pH a 7,0 com ácido clorídrico.
    3. Diluir esta 5 X solução estoque para um 1 X concentração de trabalho em água ultrapura em recipiente estéril como um garrafão de grande capacidade (veja a Tabela de materiais). Use esta solução X 1 para manter a boca assexuada.
      Nota: Como uma alternativa para a solução de sal de Montjuïc, usar água de nascente-comprado localmente ou água ultrapura, contendo um sal de aquário comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) se misturam em uma of0.5 de concentração g/L18.
    4. Para prevenir a infecção bacteriana em cultura estática19, manter a boca em água contendo um antibiótico. Preparar um 50 mg/mL de solução de sulfato de gentamicina em água ultrapura e filtro-esterilizar. Para recipientes onde os animais são mantidos, adicione sulfato de gentamicina a uma concentração final de 50 µ g/mL (diluição 1: 1000).
  2. Preparação de pasta de fígado
    1. Como boca prosperar em uma dieta de orgânicos, fígado, carne grass-fed compra fígado fresco e processo no prazo de 24 h. remover a cápsula membranosa, encapsulando o fígado por descascá-la suavemente. Corte o fígado em cubos de ~ 1 cm e usar uma lâmina para raspar e descartar todas as artérias e veias hepáticas.
    2. Macerar pedaços de fígado usando uma fábrica de alimentos ou um processador de alimentos e passá-lo através de um filtro de comida de malha de arame. Combinar em sacos de pastelaria e dispense em seringas ou 35mm placas de Petri. Antes da alimentação, centrifugue suavemente para remover as bolhas de ar.
    3. Loja alíquotas do fígado a-80 ° C por até um ano e descongelar antes de usar. Após o descongelamento, re-congelar qualquer sobra fígado uma vez, ou armazenar a 4 ° C por até 24 h.
  3. Manutenção de animais
    1. Boca vai crescer e encolher de vários tamanhos, dependendo da frequência de alimentação. Alimente a boca toda semana (uma vez a cada 14 dias). Para culturas de massa a longo prazo, use recipientes de plástico de vários tamanhos (ver Tabela de materiais).
    2. Para alimentar os animais, use uma espátula de metal ou pipeta de transferência plástica para colocar uma gota do tamanho de ervilha de fígado em uma caixa. Permitir que os animais comer por 1-2 h remover alimentos restantes antes de limpar a caixa.
    3. Limpar os vermes duas vezes por semana se alimentado (uma vez diretamente após a alimentação e uma vez dois dias depois), ou uma vez por semana se não for alimentado. Para limpar, drene a água para um copo de plástico derramando cuidadosamente para fora da água, mantendo a boca na caixa. Limpe a superfície da caixa com uma toalha de papel e, em seguida, repita por todos os lados, até que a caixa está limpa.
    4. Água (aproximadamente ¾ do volume de caixa) e adicionar gentamicina para uma concentração final de 50 µ g/mL. Loja de animais em um armário escuro ou numa incubadora de 20 ° C.
  4. Seleção de vermes
    1. Selecione os vermes que foram alimentados com 5-7 dias anteriores.
      Nota: É significativamente mais difícil que amputar pharynges de vermes que foram alimentados recentemente (1-2 dias antes da amputação). Animais alimentados também são mais sensíveis a azida de sódio.
    2. Selecione os vermes que são aproximadamente 6 mm de comprimento. Para estimar o tamanho do worm, transferi-lo para uma placa de Petri com uma pipeta de transferência plástica. Coloque uma régua plana 6 - em ou papel milimetrado de 5 x 5 mm por baixo da placa de Petri e medir o comprimento de verme, enquanto que rastreia.
      Nota: Vermes, menores que 6 mm de comprimento são mais difíceis de amputar.
  5. Preparação de azida de sódio
    1. Prepare uma solução de 100 mM, dissolvendo o pó de azida de sódio em água de planária.
      Atenção: Azida de sódio é tóxica e deve ser manuseada com cuidado. Não descarte a azida de sódio no ralo. Após a utilização, coletá-lo separadamente para disposição como resíduos perigosos.

2. faringe amputação

  1. Lugar de vermes em um diâmetro de 35 mm placa de Petri. Retire toda água Turbellaria do prato usando uma pipeta de transferência plástica.
    Nota: Um máximo de 20 6mm vermes pode ser confortavelmente acomodado em um prato deste tamanho.
  2. Coloque o prato no microscópio e ajustar a ampliação para que vários vermes podem ser visualizados simultaneamente (por exemplo, 10 ampliação de X). Substitua a água Turbellaria com solução de azida de sódio de 100 mM.
    Nota: Para um prato de Petri de 35 mm, aproximadamente 5 mL de azida de sódio é suficiente. A solução completamente deve submergir a boca. Ajuste o volume da solução para pratos maiores, se necessário.
  3. Monitore os animais sob o microscópio e abster-se de mover o prato para o primeiro 3-4 min.
  4. Observar a extrusão da faringe através do microscópio; a faringe vai sobressair da bolsa faríngea e estender totalmente (cerca de 1 mm de comprimento) como mostrado na figura 1B.
    Nota: É importante esperar até a faringe terminou estendendo completamente antes de prosseguir ainda mais. Uma vez que a faringe emerge o animal, extensão completa leva cerca de 1 min.
  5. Use uma pipeta de transferência plástico para esguichar animais ao redor do prato. Sugar os animais para a pipeta e forçosamente liberá-los para o prato duas vezes. Se a faringe é totalmente estendida, este vigoroso pipetagem fará com que a desanexar.
  6. Como alternativa, segure a faringe verticalmente ao longo de seu comprimento, ou horizontalmente ao longo de sua circunferência usando um par de pinças bem (ver Tabela de materiais) como mostrado na Figura 1. Com a faringe comprimida no fórceps, levante o animal para cima em direção do menisco. Como o animal é criado, tensão superficial fará com que a faringe desanexar do animal.
    Nota: Esse método pode ser usado para remover os pharynges de animais menores (1-3 mm de comprimento) onde a agitação vigorosa não é adequada. Evite picar ou caso contrário ferir o corpo do animal.
  7. Usando uma pipeta de transferência, mova animais amputados para um novo prato contendo água fresca planária.
  8. Uma vez transferido, enxágue amputadas animais completamente em água planária, completamente trocando a água três vezes. Transfira para um prato novo contendo água planaria com 50µg/mL de gentamicina.
    Nota: Troca de amortecedor completo durante estes três lavagens é essencial para assegurar a remoção de azida de sódio.
  9. No dia seguinte, substitua a água no prato com água fresca planária contendo 50 µ g/mL de gentamicina. Repetir todos os dias depois disso.

3. avaliação da remoção da faringe após amputação

  1. Examine os animais sob um microscópio (com ampliação de 10-20 X) para determinar se uma mancha escura apareceu após a remoção bem sucedida da faringe, como mostrado na Figura 2A.
  2. Alternativamente, corrigir e branquear os animais de acordo com o protocolo descrito por Pearson et al 20. animais de molho durante a noite em 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou estreptavidina conjugado fluorescente (1: 500 1 mg/mL diluído em 1 X solução salina de tampão fosfato contendo 0,3% Triton-X). Monte animais em slides em 80% glycerol/20% 1 X fosfato Buffered Saline e imagem sob um microscópio fluorescente (Figura 2B).
    Nota: Todas as imagens neste manuscrito foram capturadas em um microscópio fluorescente com um objetivo X 1,0.

4. avaliação da regeneração da faringe, medindo o comportamento alimentar

  1. Preparação do fígado
    1. Transferi a quantidade necessária de pasta de fígado para uma microcentrifuga ou tubo cônico. Gire rapidamente para remover as bolhas de ar. Estimar o volume do fígado e em seguida, adicione água planária para 1/5 do seu volume e 2% do volume total de corante alimentício vermelho. Por exemplo, a 1000 µ l do fígado colar, adicionar 200 µ l de água planária e 24 µ l de corante alimentar.
    2. Usando um pilão de plástico, a ponta da pipeta ou espátula de metal, misture bem até o corante alimentício é uniformemente distribuída na pasta de fígado. Rotação de novo brevemente. Pasta de fígado pode ser armazenada a 4 ° C por 24 horas ou congelada em alíquotas a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.
    3. Se testando até 25 animais, prepare 25 µ l de pasta de fígado por prato (aproximadamente 1 µ l de pasta de fígado por animal).
  2. Alimentação de animais
    1. Sete dias após amputação química, transferi os animais para uma nova placa de Petri. Se o teste de 10-15 animais, use um prato de 35mm; mais de 15 animais devem ser testados em uma placa de Petri 60mm. Manter os animais no escuro, imperturbável, por aproximadamente 1h antes da alimentação.
    2. Usando a tesoura, aumente a largura da ponta da pipeta P200 por aparar aproximadamente ½ cm fora a extremidade estreita. Pipetar 25 µ l de pasta de fígado vermelha no prato.
      Nota: Aparar o fim faz pipetagem a pasta de fígado viscosa mais fácil. Para impedir que o fígado flutuando na superfície, toca a ponta para o fundo do prato durante o fornecimento.
    3. Permitir que os animais se alimente durante 30 min.
    4. Marca o número de animais que tenham comido por colocar os animais em um fundo branco ou sob um microscópio com ampliação de 10-20 X.
    5. Após a alimentação, retire o prato de fígado e limpar.

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Resultados

Exposição a azida de sódio interrompe a motilidade normal da boca, fazendo com que os animais se esticar e se contorciam. Estes movimentos forçar a faringe que emergem do lado ventral do animal, e após aproximadamente 6 min em solução de azida de sódio, a ponta branca da faringe pode ser vista (figura 1B-painel esquerdo). Poucos minutos depois, os animais ativamente contraem e estendem totalmente a faringe, empurrando-o com força fora do corp...

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Discussão

Este protocolo descreve um método da ablação seletiva da faringe usando a azida de sódio. Outros estudos de ablação alvejado na boca têm usado modificada cirurgia para remover fotorreceptores21 ou tratamento farmacológico para ablação de neurônios dopaminérgicos22. Uma vantagem significativa de amputação química sobre os métodos existentes é que não requer cirurgia. A estrutura rígida da faringe em comparação com o resto do corpo Turbellaria facilita a sua remoção completa ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Alejandro Sánchez Alvarado, que apoiaram a otimização inicial e desenvolvimento desta técnica. Trabalho no laboratório de Carolyn Adler é suportado por fundos de start-up da Universidade de Cornell.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cloreto de Cálcio Di-hidratado (CaCl2)Fisher ChemicalC79-3Montjuï c solução salina
Sulfato de magnésio anidro (MgSO4)Fisher ChemicalM65-3Montjuï c solução salina
Cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl2)Acros/VWR41341-5000Montjuï c solução salina
Cloreto de potássio (KCl)Acros Organics/VWR196770010Montjuï c solução salina
Cloreto de sódio (NaCl)Acros Organics/VWR207790050Montjuï c solução salina
Bicarbonato de Sódio (NaHCO3)Acros Organics/VWR123360010Montjuï c solução salina
Nalgene copolímero de polipropileno autoclavável lowboy com torneiraThermoFisher Scientific/VWR2324-0015Armazenamento de água planária
Instant Ocean Sea SaltSpectrum BrandsAmazonPlanaria water
Gentamicin SulfateGemini Bio-products400-100PPlanaria water
Razor bladesElectron Microscopy Sciences71970Picar fígado
Sacos de confeitaria descartáveis-16", pacote de 12alíquotas de fígadoWiltonAmazon
Seringas de 5 mLBD/VWR309647alíquotas de fígado
placas de Petri-35mm/60mmGreiner Bio-One/VWR82050-536/82050-544
Recipientes de plástico (vários tamanhos)ZiplocAmazonHabitação planárias em cultura estática
Azida desódio SigmaPipeta de transferência S2002
Pinça Globe Scientific138030
- Pinça Dumont, Estilo 5Microscopia Eletrônica Ciências 72700-D (0203-5-PO)
Triton X-100SigmaT8787
DAPI ThermoFisher62247
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugadoThermoFisherS11223
GlicerolFisher BioReagentsBP229-1

Referências

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