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Captação de Metal essencial em bactérias Gram-negativas: fluorescência, radioisótopos, um raio-x e fracionamento da pilha

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DOI:

10.3791/57169

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1 de fevereiro de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Biomedical Sciences Microbiology Theme, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 3Office of the Provost, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

Neste artigo

Resumo

Um protocolo para a extração de um acompanhante de metal de transição periplasmático no contexto dos seus parceiros de ligação nativo e caracterização Biofísica de seu conteúdo de substrato por raios-x, absorção fluorescência e radiometal é apresentada.

Resumo

Vamos demonstrar um método dimensionável para a separação entre o periplasm bacteriana do citoplasma. Este método é usado para purificar a proteína periplasmático para efeitos de caracterização biofísica e transferência de substrato medida entre compartimentos citoplasmáticos e periplasmático. Cuidadosamente limitando o tempo que o periplasm é separado do citoplasma, o experimentador pode extrair a proteína de interesse e ensaio de cada compartimento individual para substrato sem contaminação de transição entre compartimentos. A proteína extraída de fracionamento pode ser mais analisada para determinação da estrutura tridimensional ou perfis de ligação de substrato. Como alternativa, esse método pode ser executado após a incubação com um radiotracer para determinar o total absorção por cento, bem como a distribuição do traçador (e, portanto, transporte de metal) através de diferentes compartimentos bacterianos. Experimentação com um radiotracer pode ajudar a diferenciar entre um substrato fisiológico e substrato artefactual, tais como aqueles causados por mismetallation.

Fluorescência de raio-x pode ser usada para descobrir a presença ou ausência de incorporação de metal em uma amostra, bem como medir as mudanças que podem ocorrer no metal incorporação como um produto das condições de crescimento, as condições de purificação e/ou condições de cristalização. Fluorescência de raios-x também fornece uma medida relativa de abundância para cada metal, que pode ser usado para determinar o pico de absorção de energia metal melhor usar para coleta de dados de espalhamento de raios-x anômala. Captação de radiometal pode ser usada como um método para validar a natureza fisiológica de um substrato detectado por fluorescência de raio-x, bem como apoiar a descoberta de novos substratos.

Introdução

Em bactérias Gram-negativas, citoplasmáticas piscinas de átomos de metais de transição são aumentadas e alimentadas por membrana interna ABC (fita de ligação ATP) os importadores que atenuem metal translocação através da membrana interna. Periplasmático Cluster a-1 substrato proteínas de ligação (a) compõem um grupo de acompanhantes que ligam os átomos metálicos diretamente e balsa-los através do periplasm para entregá-los ao cognato ABC importadores1. Outros Clusters de apresentação são dedicadas ao transporte de substratos, tais como metal quelatado (A-2 de Cluster), carboidratos (Clusters B e D-1) e aminoácidos (grupos B, C, F-2 e F-4); no entanto, independentemente do substrato, a segue um conservado evolutivamente pinça dobra2. O mecanismo proposto generalizado para transferência de substrato SBP inclui a pinça passando por uma série de contorções que se assemelham a uma planta carnívora3. Geralmente, Cluster a-1 a purifica em um formulário de holo (metal-limite), embora o estudo destes apresentação é limitado pela dificuldade em gerar apo (metal-free) formas de proteína para experimentação4. Até à data, estratégias para estudar apo Cluster a-1 foram limitados ao mutagênese, diálise e desnaturação parcial com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) do ácido quelante5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. dados estruturais provenientes dessas experiências sugerem que Cluster a-1 apresentação não pode seguir precisamente o mecanismo de planta carnívora. Atualmente falta da literatura é um método de produção de apo a-1 a Cluster na vivo usando parceiros de ligação fisiológica.

Nós demonstramos pela primeira vez usando o fracionamento celular para purificar YfeA, um Cluster a-1 SBP da Yersinia pestis, agente etiológico da peste, que foi convertido ao formulário apo através da interação com o seu importador cognato fisiológica do ABC YfeBCDE na célula. Mostramos que a YfeA é a forma de apo por espectroscopia de raio-x-energia dispersiva (EDS), também conhecido como fluorescência de raio-x. Também demonstramos a funcionalidade YfeBCDE combinando fracionamento celular com estudos de absorção de metal radioativo altamente sensível para distinguir entre absorção através da membrana exterior de metal e metal importação através da membrana interna. O uso de um dispositivo radioativo permite a detecção de quantidades de pg/L de metais, muito menores do que o limite de detecção para técnicas tais como indutivamente acoplado a espectrometria de massa de plasma (ICP-MS) ou espectroscopia de absorção atómica (AAS). Isto permite a mínima perturbação do sistema a ser estudado. Além disso, os métodos tradicionais listados muitas vezes exigem maiores volumes de amostra, adicional pós-processamento e tempos mais longos reviravolta, que não são típicos para ensaios radiotracer. Assim, usar um radiotracer fornece um método conveniente e simples para monitorar a distribuição de metal e absorção dentro de uma célula. Remanesce ser determinado se uma apo a-1 SBP Cluster produzido usando esse método iria ecoar as observações estruturais de práticas correntes usadas para gerar proteínas apo.

Fracionamento celular é um método estabelecido para a separação de compartimentos celulares para o propósito implícito de sondagem especificamente seu conteúdo em isolamento12. Fracionamento celular é comumente usado para confirmar a localização de uma molécula durante o ciclo celular ou medir a atividade de um determinado compartimento13. Por exemplo, atividade de transporte de metal pode ser analisada por probing compartimentos celulares para substrato metálico. Integração do fracionamento celular permite distinção e comparação entre metal absorção através da membrana externa e transferência de metal através da membrana interna. Estes processos então por sua vez podem ser medidos ao longo do tempo. No caso de purificação de proteínas, os métodos mais comuns de lise celular e separação de componentes solúveis de componentes insolúveis são ruptura mecânica (ou seja, moagem, mistura), homogeneização de alta pressão (ou seja, imprensa de célula de pressão francesa, celular disruptor) e frequências ultra-sônicas (i. e., sonication)14. Uso de frequências ultra-sônicas para lyse pilhas geralmente é mais adequado para pequenos volumes; no entanto, sonication é conhecido para gerar calor excessivo que pode desnaturar proteínas. Para evitar a geração de calor excessivo, frequências ultra-sônicas são normalmente aplicadas em rajadas curtas sequenciais, que podem ser demorado e inadvertidamente degradar as moléculas de DNA em fragmentos menores. Além disso, várias sondas sonication caro podem ser necessárias para experimentos preparativa e analíticos, como cada sonda tem um alcance limitado para o volume de amostra que pode ser processado. Uso de alta pressão para lyse pilhas evita gerar calor excessivo durante a lise celular por componentes de imprensa francesa pressão célula antes da lise de refrigeração ou operando um disruptor de células em um ambiente frio, como uma sala fria. Como sondas sonication, vários conjuntos de componentes de imprensa francesa pressão célula podem precisar de ser comprados para processar uma vasta gama de volumes de amostra. Imprensa de célula de pressão francês assemblies são fáceis de se conectar mas complicado de operar e limpar, pode ser pesada para se mover e são propensa ao entupimento das amostras densas. Vantagens em usar frequências ultra-sônicas e sistemas de alta pressão para lyse pilhas incluem recuperação de amostra alta, capacidade de processar várias amostras com contaminação mínima, e ajustável, força de cisalhamento, o que pode ser adaptado para otimização de lise de uma ampla gama de tipos de amostra. Otimização pode ocorrer, ajustando a frequência ultra-sônica, duração de rajadas, pistão pressão de libras por polegada quadrada (psi) e o número de passes através da imprensa. Uso de ruptura mecânica para lyse pilhas pode ser a estratégia mais tècnica trivial e menos cara para lise celular. Ruptura mecânica pode apresentar desafios na recuperação de amostra e não é o ideal para o processamento de amostras múltiplas. Ruptura mecânica é mais suave para amostras de alta pressão ou frequências ultra-sônicas, mas não é alto throughput e é propensa a Lise ineficiente. Uma significativa limitação experimental de ruptura mecânica, homogeneização de alta pressão e frequências ultra-sônicas, é o rompimento incontrolável da arquitetura celular inteiro tal que após a Lise, todos os componentes da célula aquosa são misturados juntos. Além disso, todos os compartimentos da célula não perturbem ao mesmo tempo; Portanto, conteúdo de compartimentos que lyse cedo pode ser sujeito a forças disruptivas em curso mais de conteúdo de compartimentos que lyse tarde. Fracionamento celular permite tecnicamente simples, barata e eficiente separação baseada no compartimento a de conteúdo da célula, evitando a necessidade de equipamento caro e exposição de amostra para forças duras, sem interrupções.

No caso da SBP, substrato importado é reintroduzido para potencialmente apo proteína e regenera holo proteína durante Lise, antes da cromatografia a jusante ou outras técnicas de purificação. Inclusão de quelante EDTA durante lise apresenta um obstáculo adicional, onde a afinidade de metal como uma primeira etapa de purificação de proteínas não é possível porque EDTA irá tira de metal a partir da resina de cromatografia e evitar a proteína ligando15. Uma solução simples e barata é fracionamento celular por choque osmótica, onde centrifugação diferencial e reagentes comuns de laboratório permitem que o investigador cuidadosamente extrair proteínas suficientes para análise funcional. Fracionamento de choque osmotic utiliza uma mudança de duas etapas na pressão osmótica para separar compartimentos celulares. Em primeiro lugar, um buffer hipertônico faz com que células de Crate como água deixa cada célula e em segundo lugar, um buffer hipotônica faz com que células a inchar como água re-entra em cada célula. Controlando cuidadosamente quanto tempo as células incham, as membranas externas podem ser seletivamente lysed (devido ao acúmulo de pressão osmótica da água entrante), assim, esvaziando seu conteúdo para o buffer. Preservação das membranas internas garante que o conteúdo citoplasmático é retido em spheroplasts e é facilmente separado da periplasmático conteúdo por centrifugação.

YfeA é um poli-específica capaz de ligação de ferro, manganês e zinco átomos16SBP. As proporções relativas de metal incorporado pode ser alterado de acordo com o metal suplementação durante o crescimento e analisada por fluorescência de raio-x como está disponíveis no Advanced Photon Source16 do Laboratório Nacional Argonne. Fluorescência de raio-x permite que o investigador para perfil rapidamente um conjunto amplo de metais sem a necessidade de grandes ou cristais de qualidade de difração e nem pode recolher dados de solução de proteína precipitado ou proteicas.

Fluorescência de raio-x pode rapidamente revelar resultados inesperados tais como, neste caso, o principal substrato de YfeA sendo o zinco e não os substratos fisiológicos documentado ferro ou manganês16. Se usado antes de coletar dados de espalhamento de raios-x, fluorescência de raio-x pode informar o investigador no delineamento experimental, como que energia metal arestas para usar para coleta de dados de espalhamento de raios-x anômala. Só tão útil como determinar a abundância relativa de uma metal, fluorescência de raios-x também pode determinar se um metal está ausente em uma amostra, fornecendo um método rápido de separar os cristais do metal contendo apo proteína da proteína holo e estimar a força do sinal sem a necessidade de demorado de processamento de dados. Após identificar uma amostra com um sinal forte do metal, o comprimento de onda preciso usar para coleta de dados de espalhamento de raios-x anômala pode ser determinado pela verificação de múltiplos comprimentos de onda de dispersão anômala (MAD).

Este protocolo detalhado destina-se a ajudar novos experimentadores com sucesso realizar fracionamento celular e fazer o uso eficaz de hardware de trajetória síncrotron perfil total teor de metais e promover o estudo de proteínas de ligação de metal.

Protocolo

1. bacteriana cultura (dia 1)

  1. Num balão de 200 mL chanfrada, inocular 30 mL de caldo Luria Bertani (LB) com cepa de Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL células de plasmídeo contendo pYFE316.
  2. Adicione 30 µ l de ampicilina 50mg/mL no balão por aspiração com uma pipeta e 200 µ l de ponta. Agitar durante a noite a 225 rpm em 37 ˚ c.

2. complementada M9 Media mínimos preparação (dia 2)

Nota: Esta é adaptada do manual Amresco.

  1. Prepare 6 L de meio líquido, o procedimento a seguir. Em um frasco de 2 L chanfrado, adicionar 10,5 g de media mínimos M9 para 1 L de ultra-pura H2O. Autoclave a 121 ˚ c por 20 min e depois arrefecer à temperatura ambiente.
  2. Adicionar assepticamente as seguintes soluções estéreis suplemento: 1 mL/L de ampicilina 50mg/mL, 10 mL/L de glicose de 20% w/v, 0,1 mL/L de 1 M CaCl2e 2 mL/L de 1m MgSO4. Execute esta etapa em uma câmara de segurança biológica para manter um ambiente estéril. Aquecer a mídia para 37 ˚ c.

3. bacteriana subcultura

  1. Adicione 5 mL/L de cultura durante a noite a M9 media mínimos por aspiração com uma ponta de pipeta e 5ml automatizada. Agite a subcultura continuamente a 225 rpm em 37 ˚ c para 9 h.
    Nota: Durante esta etapa YfeABCDE é overexpressed por autoinduction da sua nativa Y. pestis promotor.
  2. Recupere as células por centrifugação a 4.500 x g, durante 30 min a 4 ˚ c. Ressuspender as células em 50 mL de um gelada tampão fosfato (pH 7,6, 50mm NaCl de 20mm Na2HPO4 ) por aspiração com uma pipeta e ponta de 1 mL e congelar durante a noite no-80 ˚ c.

4. célula fracionamento (dia 3)

  1. Descongele a ressuspensão em 4 ° C e aglomerados de células a 4.000 x g por 20 min no 4 ˚ c. Resuspenda as células em 50 mL de tampão de sal alta gelada (200 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM de NaCl e EDTA 2 mM) aspirando com uma ponta de pipeta e 25 mL automatizada. Incube a suspensão sobre gelo por 20 min, com inversão ocasional para a mistura.
  2. Granule as células a 4.500 x g por 20 min no 4 ˚ c. Ressuspender as células em 50 mL de tampão de sal gelada baixo (pH 8.0 de 10 mM Tris-HCl) por aspiração com uma ponta de pipeta e 25 mL automatizada. Incube a suspensão sobre gelo por 20 min, com inversão ocasional para a mistura.
  3. Pelota as spheroplasts a 4.500 x g por 20 min no 4 ˚ c. Recupere o sobrenadante contendo periplasm. Ressuspender os spheroplasts granulados na solução tamponada fosfato salino (passo 3.2) aspirando com uma ponta de pipeta e 25 mL automatizada e lyse pilhas por três ciclos de pressão francês pilha pressão 1500 PSI.
    Nota: Uma imprensa de célula de pressão francesa pode ser constrangedor operar e usa uma bomba hidráulica para direcionar a lise celular. Tenha cuidado ao acoplar a bomba hidráulica, garantindo o alinhamento adequado do pistão com a imprensa e manter as mãos livres da bomba hidráulica.
  4. Pelota de restos celulares a 50.000 x g por 20 min no 4 ˚ c. Recupere o sobrenadante contendo o citoplasma. Se necessário, as membranas internas e externas podem ser ainda mais fracionada16.

5. proteínas purificação usando FPLC

  1. Imediatamente após o fracionamento, filtre a fração periplasmático usando uma unidade de membrana de 0,45 µm. Use um filtro de seringa Luer lock para facilidade e filtração rápida. Equilibrar uma coluna de troca de ânion 5ml Q usando pH de Tris 20mm 7,6, 0.05% w/v NaN3 carregando buffer em um caudal de 5 mL/min.
  2. Carregar o periplasmático filtrado para a coluna de troca ânion 5ml pre-equilibrada Q usando pH de Tris 20mm 7,6, 0.05% w/v NaN3 carregando buffer em um caudal de 2 mL/min... continuar a lavar a 5ml Q ânion troca coluna usando pH 7,6 do Tris de 20 mM , amortecedor do 0.05% w/v de NaN3 carregamento até alcançar a uma leitura de base de A280 a um caudal de 5 mL/min.
  3. Eluir a proteína acoplada usando pH de Tris 20mm 7,6, 0.05% w/v NaN3, 0 - 1 M NaCl por volumes de coluna de mais de 10 gradiente linear a um caudal de 5 mL/min. Combine frações contendo um pico de280 . APO YfeA elutes entre 200 mM NaCl e 300 mM de NaCl.
  4. Concentre-se o eluato pelo concentrador centrífugo, até que o volume atinge cerca de 5 mL.
  5. Equilibrar uma coluna de filtração de gel de Superdex 200 pg com pH de Bis-Tris 20mm 6.3, 50mm NaCl, amortecedor de 0.05% w/v de NaN3 gel filtração em um caudal de 2,5 mL/min.
  6. Carga do ânion concentrado trocar eluato para a coluna de filtração de gel de Superdex 200 pg pre-equilibrado e purificar usando amortecedor de gel filtração do passo 5.5 em um caudal de 2,5 mL/min. combinar frações contendo um pico de280 correspondente a um ~ 30 proteína de kilodalton (kDa).
    Nota: A referência a seguir é um exemplo de experimento FPLC para demonstrar o protocolo17.

6. a proteína cristalização

  1. Concentre-se o eluato de filtração de gel pelo concentrador centrífugo a uma concentração de proteína final de 22 mg/mL.
    1. Calcule a concentração de proteína, dividindo-se a um280 lendo por 1,276 mg/mL. Este coeficiente de extinção teórica foi prevista por ExPASY ProtParam18.
      Nota: Uma A280 amostra leitura de 5.104 AU corresponde a uma solução de 4,000 mg/mL; 5.104 AU ÷ 1,276 mg / mL = 4,00 mg / mL.
  2. Mistura 1,5 µ l de proteína com 1,5 µ l de 30% p/v PEG 4000, 50mm NaCl, pH de Bis-Tris 20mm 6.3, 0.05% w/v de NaN3 em sentado gota ou instalação de gota de suspensão por aspiração com uma pipeta e 10 µ l de ponta.
  3. Incube a cristalização gotas a 293 K para 2-4 semanas.
  4. Cristais na piscina de nitrogênio líquido para a expedição para o síncrotron congelam.

7. x-ray fluorescência (usando o Software de Beamline GM/CA)

  1. Navegue até a guia Hutch uso da subposição energia para definir energia para 10.0 keV.
  2. Navegue até o Scan na guia navegar para a amostra de monte de guia interativo .
  3. Selecione o sinal de fluorescência otimizar. Entrada 4,00 s na rubrica de tempo . Selecione a levar o espectro de fluorescência. Ver os espectro utilizando guia plotar .

8. MAD Scan para pico de absorção de energia de Metal (usando o Software de Beamline GM/CA)

  1. Mova a amostra fora do feixe. Navigate para digitalizar na guia navegar para a tabela periódica Tab selecione a borda K do elemento de interesse.
    Nota: O valor de energia na subposição de energia está em eV.
  2. Navegue até a guia Hutch uso da subposição energia para definir energia com valor no passo 8.1 em keV.
  3. Mova a amostra para o feixe. Navegue até o Scan na guia navegar para guia de Auto entrada 2,00 s na rubrica de tempo .
  4. Selecione Start Scan. Ver os a varredura de MAD utilizando o separador Plot .
    Nota: O valor de energia na subposição pico é em eV, ao invés de keV.
  5. Selecione feito com fluorescência.
  6. Mova a amostra fora do feixe. Navegue até a guia Hutch uso da subposição energia para definir energia valor na etapa 8.4 arredondada para o próximo eV (i.e., pico: 9658,3 eV, defina energia para 9659 eV).
  7. Mova a amostra para o feixe. Recolha dados. Repita a etapa 8.1-8.6 para todos os metais de interesse.

9. analítico protocolo para ensaio de absorção de Metal radioativo

  1. Em um tubo de cultura de 14 mL, 5 mL de LB com cepa de Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3) de inocular-RIPL células de plasmídeo contendo pYFE316. Adicione 5 µ l de ampicilina 50mg/mL, por aspiração com uma pipeta e 10 µ l de ponta. Agite a 225 rpm em 37 ˚ c por 7 h.
  2. Granule as células a 15.000 x g por 1 min à temperatura ambiente utilizando uma centrífuga do tabletop. Lave as células em 1 mL de media mínimos de M9 complementados por aspiração com uma pipeta e 1 mL de ponta. Repeti uma vez.
  3. Em um tubo cónico de 50 mL, células de subcultura em 30 mL suplementado M9 media mínimos por aspiração com uma pipeta e 1 mL de ponta. Agite a 225 rpm em 37 ˚ c para 9 h.
  4. Determine a quantidade de radioactividade necessária para alcançar aproximadamente 100.000 contagens por minuto (cpm).
    Nota: Isto pode variar dependendo do radioisótopo e o instrumento utilizado para a deteção. Por exemplo, uma amostra contendo quilobecquerel 7.4 (kBq) (0.2 microcurie (µCi)) de 52Mn dá uma leitura de 550.000 cpm em um detector de gama automatizada (NaI). Assim, a quantidade de radioactividade necessária para obter uma contagem de 100.000 cpm pode ser determinada através da seguinte equação: (100.000 cpm/550.000 cpm) * 7,4 kBq (0.2 µCi) = 1,35 kBq (0,036 µCi).
    Cuidado: decaimento radioativo resulta na liberação de radiação ionizante, que é perigosa. Quando se trabalha com radioactividade usar sempre a protecção adequada e seguir os princípios de como baixa como razoavelmente possível (ALARA) aumentando a distância e blindagem, reduzindo o tempo de exposição. Somente pessoal treinado deve lidar com radioactividade nos laboratórios especialmente designados, que está licenciado para o uso de materiais radioactivos.
  5. Multiplica a radioatividade necessária calculada no passo 9,4 pelo volume total de subcultura, para determinar a quantidade total de radioatividade necessária. Adicionar este montante (de preferência em um pequeno volume de 50-100 µ l) para o tubo contendo a subcultura que existem 100.000 cpm/mL e o vórtice bem por 30 s.
    Nota: Para 31 mL de subcultura, a quantidade total de radioatividade exigida é 1,35 kBq (0,036 µCi) x 31 mL = 41,3 kBq (µCi 1.12).
  6. Alíquota de 1 mL da subcultura (agora contendo dispositivo radioativo) em centrífuga individuais 1,5 mL tubos por aspiração com uma pipeta e 1 mL de ponta, e lugar em um thermomixer de 37˚C, com utilização do Vortex no 1 × g. Include suficiente tubos que existem três repetições para cada desejado de medição, bem como três repetições adicionais para usar como padrões (Reserve as normas, não realizar o ensaio de fracionamento nos padrões).
    Nota: Análise no 1, 2 e 4 h exigiria totais 12 tubos.
  7. Após a incubação, centrifugar os tubos em 15.000 × g por 30 s Utilizando uma centrífuga de bancada (de preferência resfriada a 4 ˚ c) e descartar os sobrenadantes.
  8. Ressuspender as células em 1 mL de gelada, sal elevado buffer (passo 4.1) por aspiração com uma pipeta e 1 mL de ponta e coloque imediatamente no gelo por 20 min.
  9. As células novamente em 15.000 g × 30 de pelotas s Utilizando uma centrífuga de bancada (de preferência resfriada a 4 ˚ c) e descartar os sobrenadantes.
    Nota: O sobrenadante contém metal de graça não associado.
  10. Ressuspender as células em gelo frio, baixo sal buffer (passo 4.2) por aspiração com uma pipeta e 1 mL de ponta e incubar no gelo por 20 min.
    Nota: É importante aspirar suavemente através de pipeta para esta etapa.
  11. Pelotas as células a 15.000 × g por 30 s e coletar cada dos sobrenadantes em novo 1,5 mL tubos de centrifuga. Agora deve haver seis tubos por ponto do tempo.
    Nota: O sobrenadante contém a fração periplasmático e o sedimento contém a membranosa e fração citoplasmática. Referimos a pelota como a fração citoplasmática.
  12. Medir a radioatividade em cada fração (seis tubos por ponto do tempo), bem como nas normas retiradas em 9.6 passo. Use a quantidade de radioatividade nas normas para determinar a quantidade total de radioatividade originalmente adicionada para cada amostra.
  13. Para determinar a porcentagem de absorção radioativa no periplasm, use a seguinte equação: (média cpm de cpm periplasmático fração/média de normas) x 100.
  14. Para determinar a porcentagem de absorção radioativa no citoplasma, use a seguinte equação: (média cpm do cpm fração citoplasmática/média das normas) x 100.
  15. Para determinar a % de absorção total, use a seguinte equação: ((cpm médio da fração periplasmático + cpm médio da fração correspondente citoplasmática) / (média cpm dos padrões)) x 100.

Resultados

Gel de SDS-PAGE e cromatogramas de filtração de gel foram coletadas para avaliar a qualidade da purificação da proteína de fracionamento periplasm preparativa. A purificação do holo que yfea foi previamente descrito16; no entanto, a purificação do apo YfeA não foi relatada. A estratégia para purificar apo YfeA descrito por esse método usa uma construção recombinante tipo selvagem que não contenha uma marca de afinidade de qualquer tipo, especialmente um que poderia ser usado para proteína immunoblot (i.e., sua marca) e um anticorpo monoclonal que reconhece a que yfea não tem sido descrita. Portanto, a análise de espectrometria de massa foi utilizado para verificar se a purificação de YfeA. Para purificar YfeA por fraccionamento, recomenda-se usar um gradiente de eluição linear por cromatografia de troca de ânion (Figura 1). O gradiente de eluição linear melhora significativamente o enriquecimento de YfeA de fazer cerca de 8% da fração periplasm para 49% do produto de troca de ânion calculado por densitometria (Figura 1). Esta composição é melhorada para 61% por filtração em gel, e o volume de eluição da proteína apo é idêntico ao volume de eluição da proteína holo (Figura 2). Análise de espectrometria de massa verifica a purificação de YfeA através da detecção de 92,5% da sequência de aminoácidos YfeA, 246 espectros de polipeptídeo YfeA totais, 24 peptídeos exclusivos e 50 espectros exclusivo do polypeptide. Como alternativa, para contrastar o produto gradiente linear com o produto de uma eluição de gradiente de passo, YfeA foi purificada por troca de ânion usando uma etapa de lavagem de 50mm NaCl seguido por uma etapa de eluição de 250 mM de NaCl (Figura 1). O gradiente de passo marginalmente enriquece YfeA de compor 17% da fração periplasm para 18% do produto, calculada pela densitometria troca ânion. A eluição de gradiente de passo também enriquece uma banda de contaminante de proteína a espectrometria de massa identificada como contendo múltiplos a Escherichia coli de semelhante peso molecular. Devido a limites de resolução do HiLoad 26/600 Superdex 200 pg, similaridade nos pesos moleculares e estruturas de apresentação a contaminante, gel filtração melhorada marginalmente enriquecimento de YfeA a 20% do produto gel filtração. Um gradiente de eluição linear deve ser inatingível por aniões, é recomendável para explorar várias lavagens passo em incrementos de 25-50 mM NaCl para identificar a concentração de NaCl necessária para remover estes contaminantes.

Holo e purificado apo YfeA se cristalizar nas mesmas condições de cristalização, embora imagens de apo e holo morfologias de cristal de YfeA mostram diferenças em crescimento de cristais de apo e holo Estados YfeA (Figura 3). Verificação de espectrometria de massa, além de dados de difração de raios x (não mostrados) coletados de cristais desenvolvidos proteína purificada por este método confirmaram a purificação e a cristalização do YfeA. A extensão da contaminação do compartimento (zinco citoplasmática revertendo apo a proteína holo na fração periplasm) pode ser avaliada através da captura de espectros de fluorescência de raios-x (Figura 4). Dado que o zinco é o principal substrato vinculado a recombinação YfeA16, espectros de fluorescência de raios-x podem rapidamente diferenciar entre uma amostra de YfeA contendo um sinal forte de zinco proporcional com holo YfeA (Figura 4A), indicativo da Cruz contaminação, ou um sinal fraco zinco sugestivo de apo YfeA e mínima contaminação cruzada (Figura 4B). ICP-MS análise dos meios de comunicação mínimos M9 confirmou que os níveis de metais de transição são na faixa de sub-micromolar (não mostrada); Portanto, deteção de apenas mínimas quantidades de metais de transição deve ser esperada após um bem sucedido fracionamento. Fracionamento de analítico (Figura 5) pode ser usado para medir as taxas de transporte radiometal e capturar dados funcionais. Um minuto 60 instantâneo comparando frações periplasmático e citoplasmáticas de células de Escherichia coli expressando YfeA única, o transportador de YfeABCDE completo e nenhum dos componentes YfeABCDE revela as consequências de expressar uma proteína recombinante única ou um proteína complexa na captação de metal (Figura 6). Células de Escherichia coli não expressando nenhuma proteína recombinante transportaram aproximadamente metade do 52Mn adicionado aos meios de comunicação para o citoplasma com retenção mínima no periplasm. Este controlo negativo representa o transporte de manganês endógena. Células de Escherichia coli expressando YfeA recombinante transportaram aproximadamente um quarto do 52Mn adicionado aos meios de comunicação para o citoplasma com outra moeda retida no periplasm. Retenção do manganês na periplasm e transporte limitado para o citoplasma demonstra a demanda metabólica e gargalo impostas pela produção YfeA na ausência do transportador Yfe. Células de Escherichia coli expressando recombinante YfeABCDE transportador transportaram quase 100% do 52Mn adicionado aos meios de comunicação para o citoplasma com retenção mínima no periplasm. Transporte de manganês aumentada para o citoplasma ilustra a contribuição do transportador no transporte de manganês Yfe.

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Figura 1. Purificação de YfeA por fracionamento. A. modelo hipotético para Yfe transportador. B. gel de SDS-PAGE de YfeA purificação da fração periplasm, usando a eluição de gradiente linear de aniões. Gel de SDS-PAGE mostra o enriquecimento da YfeA (30 kDa) através de etapas de purificação. Seta preta indica a posição de migração eletroforética para YfeA. Padrões de peso molecular mostrados à direita. (1) fração de periplasm. (2) Q ânion troca coluna fluir. (3) eluição de pico do coluna de troca de ânion Q. (4) pico de coluna do filtração de gel de pg superdex 200. C. YfeA enriquecimento – bom exemplo. Processamento de imagem do gel SDS-PAGE de B calcula o enriquecimento global de YfeA por densitometria de aumentar de 8% da fração periplasmático para 61% do produto gel filtração. Caixas azuis indicam sinal de YfeA/total usado para cálculos de densitometria. Análise de espectrometria de massa da banda in a box na pista 4 detectado 259/280 YfeA aminoácidos, apresentados em destaque verde. Aminoácidos ácidos presentes no polipeptídeo maduro são representados em texto preto em maiusculas em negrito, e aminoácidos compondo o peptídeo sinal clivados são representados em texto cinzento minúsculas em itálico. D. YfeA enriquecimento - mau exemplo. Gel da SDS-Página de YfeA purificação da fração periplasm, usando gradiente de etapa de eluição de aniões. Gel de SDS-PAGE mostra enriquecimento de YfeA através de etapas de purificação. Seta preta indica a posição de migração eletroforética de contaminante de proteína principal reforçada durante a cromatografia de troca de ânion. Padrões de peso molecular mostrados à direita. (1) pico de coluna do filtração de gel de pg superdex 200. (2) Q ânion troca coluna 250 mM NaCl passo gradiente eluição. (3) fração de periplasm. Processamento de imagem do gel de SDS-PAGE de D calcula marginal enriquecimento global de YfeA por densitometria para um máximo de 20% do produto gel filtração. Caixas azuis indicam sinal de YfeA/total usado para cálculos de densitometria. De análise de espectrometria de massa da banda indicada por uma seta preta na pista 1 detectou 26 peptídeos exclusivos de LivJ (39 kDa), 25 peptídeos exclusivos de EfeO (41 kDa) e 17 péptidos exclusivos de LivK (39 kDa). Todos os três contaminantes são periplasmático Escherichia coli a. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. APO YfeA e holo YfeA gel cromatogramas de filtração. Seta preta indica a posição do volume vazio. Filtração de gel picos para apo YfeA (curva preta) e holo YfeA (curva azul) mostrar a proteína afirma eluir no mesmo volume de eluição, indicando que apo que yfea purificado da fracção periplasm tem um raio hidrodinâmico semelhante como holo que yfea purificado de total conteúdo celular depois pressione francês.

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Figura 3. APO YfeA e morfologias de cristal holo YfeA. Holo YfeA cristaliza-se como um cristal monolítico, enquanto apo YfeA geralmente produz cristais geminadas na mesma condição de cristalização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. APO YfeA e holo espectros de fluorescência de raios-x YfeA. A. espectros de fluorescência de raios-x de holo YfeA que foi purificado de media mínimos M9 com nenhuma curva de suplementação, verde de metal de transição adicionais. Picos característicos são rotulados por manganês, ferro e zinco. B. espectros de fluorescência de raios-x de amostra YfeA produziram no contexto da YfeBCDE. Picos característicos são rotulados por manganês, ferro e zinco. Curva azul. Espectros de fluorescência de raios-x de YfeA purificado a partir do contexto de YfeBCDE e bem sucedido fracionamento da fração periplasm com contaminação mínima de metais de transição citoplasmáticas e/ou holo YfeA proteína. Curva vermelha. Espectros de fluorescência de raios-x de YfeA purificado do contexto do YfeBCDE com malsucedido fracionamento de Lise excessiva e contaminação significativa de metais de transição citoplasmáticas e/ou holo YfeA proteína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5. Generalizada de fluxo de trabalho para fracionamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6. dados de fracionamento de captação de metal radioativo de 60 min. Cada experimento foi realizado três vezes, e as barras de erro indicam desvio-padrão. Barra vermelha. Células de Escherichia coli que não contêm o transportador Yfe transportam cerca de ~ 50% do 52Mn para o citoplasma após 60 minutos e mantêm níveis baixos de periplasmático 52Mn. barra azul. Células de e. coli contendo o transporte de transportador Yfe > 90% dos 52Mn para o citoplasma após 60 minutos e manter níveis baixos de periplasmático 52Mn. barra verde. Células de Escherichia coli que contêm apenas YfeA transportam cerca de ~ 25% de 52Mn para o citoplasma e retêm ~ 25% de 52Mn no periplasm após 60 minutos.

O radiometal usada neste trabalho, 52Mn (t1/2 = 5,59 d), foi produzido na UAB ciclotron instalação (Birmingham, AL) pelo bombardeio de prótons em um alvo natural de Cr e purificado como relatado anteriormente,19. Cuidado: 52Mn é um emissor de pósitrons (β+avg = 242 keV, 29,4%) e também emite vários raios gama de alta energia com alta intensidade (Eγ = 744.2, 935.5, 1434.0 keV; Eu = 90.0%, 94,5%, 100%). Por estas razões, o experimento deve ser realizado seguindo os princípios de protecção de radiação de ALARA, conforme descrito acima. Todos os itens designados como resíduos radioactivos devem ser adequadamente contidos, claramente identificados e descartados de acordo com os procedimentos estabelecidos.

Discussão

Fracionamento celular é uma ferramenta útil para sondagem especificamente o conteúdo de um compartimento celular e pode servir como uma ferramenta útil para extrair pequenas moléculas como átomos metálicos, bem como macromoléculas como proteínas. É interessante notar que fracionamento celular não é uma técnica absoluta e pode ser propenso sem atenção cuidadosa a ressuspensão/mistura, temperatura de incubação e tempo de incubação. Mistura incompleta pode resultar no mínima lise membranosa e fracionamento assim negligenciável, fracionamento em temperatura ambiente pode causar rápida lise de ambas as membranas, resultando em contaminação da fração periplasmático com conteúdos citoplasmáticos, e tempos de incubação prolongado também podem resultar em lise excessiva e, portanto, a contaminação de fração. Um compromisso razoável para a realização da lise de membrana externa eficiente e relativamente completo (preservando a membrana interna) é incubação 20 minutos sobre o gelo no buffer de fracionamento hipotônica. Outra consideração é o método de extração, onde dura extração sacudindo ou vórtice pode comprometer a qualidade do extrato como causando a agregação da proteína. É aconselhável misturar suavemente como espátula, inversão ou por aspiração com uma pipeta para manter o material de alta qualidade para análise a jusante. Purificação de fracionamento celular preparativa pode ocorrer com eficiência variável, como evidenciado pela Figura 1. Em um experimento, YfeA começou como 8% do conteúdo periplasmático extraído (Figura 1), enquanto em outro experimento, YfeA começou como 17% do conteúdo periplasmático (Figura 1). Estas diferenças podem surgir de várias razões, tais como condições de expressão variável (adição de EDTA para a mídia de crescimento pode aumentar a expressão dos genes regulados por mecanismos de fome como regulamento de peles do promotor Yfe), o uso repetido do congelado ações permanentes e erro humano. Em vez de ajustar os tempos de incubação, é aconselhável aumentar a preparação. Purificação da fracção periplasm recomenda-se incluir uma eluição gradiente linear da etapa cromatográfica de troca de ânion. Eluição de gradiente um passo é uma estratégia de eluição as utilizações discretas e abrupto alterações na composição da fase móvel (i. e., 0 mM NaCl, 50mm NaCl, 150 mM NaCl, etc.). Uma eluição gradiente linear é uma estratégia de eluição que usa a mudança gradual no mobile fase composição (isto é, 0 mM de NaCl, 5 mM de NaCl, 10 mM de NaCl, etc.). Um gradiente de etapa é útil para a separação de moléculas que têm afinidades diferentes para a fase estacionária, e uma eluição gradiente linear é útil para a separação de moléculas que têm afinidades semelhantes para a fase estacionária. No caso de purificação da proteína sem etiqueta de purificação artificial (para aumentar a afinidade com a fase estacionária), de um compartimento da célula que é rico em proteínas únicas espécies, recomenda-se uma eluição gradiente linear para separar proteínas de noninterest que podem têm afinidades semelhantes à fase estacionária, como a proteína de interesse. Geralmente, um rendimento de 1-2 mg de purificado apo YfeA é esperado de cada litro de cultura expressando YfeA de seu endógeno Y. pestis promotor.

Fluorescência de raios-x é uma técnica que permite que o investigador rapidamente determinar o teor de metais em uma amostra, e informar o investigador sobre incorporação de metal inesperada que seria desconhecida. Embora o EDTA é incluído no buffer de fracionamento hipertônica para remover o metal livre ou vagamente associada, YfeA derivado da fração periplasm pode conter algumas proteínas holo. Dado que o transporte de metal é um processo dinâmico, talvez o conteúdo de proteína de holo origina YfeA que ainda não doou sua carga para YfeBCDE. É interessante notar que a fluorescência de raio-x apenas mede o teor total de metal e não indica se o metal é ordenado em um lattice de cristal, ou especificamente ligado a uma proteína. Para determinar se metal é ordenado em um lattice de cristal e/ou especificamente ligada a uma molécula de proteína, processamento e coleta de dados de espalhamento de raios-x é necessário. Não obstante, fluorescência de raio-x permite a avaliação rápida amostra da contaminação de metal e/ou integração de proteína residual holo. Radiação síncrotron tempo é limitado e nem sempre há tempo para elaborar uma estratégia para a coleta de dados de espalhamento de raios-x em cada amostra, assim a fluorescência de raios-x é uma técnica valiosa para a seleção de muitos cristais e priorizando para que amostras de raio-x devem ser recolhidos dados de dispersão. Além disso, fluorescência de raio-x permite a coleta de dados de amostras que podem não difração de raios-x. Ao coletar dados de fluorescência de raios-x, às vezes o sinal pode ser muito fraco e o espectro resultante uninformative. Para melhorar a força do sinal, para fluorescência de raio-x ou varredura louco, considere aumentar o tempo de exposição e/ou diminuindo a atenuação do feixe de raios-x. Quando uma amostra é identificada para a coleta de dados de espalhamento de raios-x, recomenda-se coletar dados de espalhamento de raios-x em uma parte diferente da amostra do que foi usado para fluorescência de raio-x e MAD digitalização para minimizar os danos de radiação, melhorar a qualidade dos dados coleção e minimizar qualquer potencial de redução do sinal anômalo.

Detecção de traçadores radioativos exige quantidades nanomolar de material ou menos, e o uso destes marcadores como agentes de rastreamento molecular fornece um método simples e altamente sensível de sondagem processos celulares. O ensaio de radiometal descrito acima pode ser usado para determinar a absorção de metal total, distribuídos por compartimentos celulares, bem como taxas de absorção. De fato, cada ponto de tempo de dados requer um fracionamento de 40 minutos; no entanto, como cada ponto de tempo for atingido, células são imediatamente peletizadas e incubadas em tampão de sal elevado (Figura 5etapa 1). Radiometal medições da mídia, Descartado buffer de sal elevado (Figura 5etapa 1) e frações periplasmático e citoplasmáticas depois (Figura 5etapa 3) indicam que a incubação alta reserva de sal com êxito remove todos os restante não associado gratuito metal que demorou-se após a centrifugação inicial depois de atingir o ponto de tempo. A centrifugação inicial remove a maioria (até 80%) do metal livre não associado e a centrifugação após incubação no buffer de sal alta também remove adicional restante metal de graça não associado. Qualquer metal de graça não associado persistente não deverá influenciar significativamente o transporte de metal durante o fracionamento de 40 minutos. A influência do fracionamento de 40 minutos no transporte intracelular de metal é uma outra consideração para interpretação dos dados de prudente. Praticamente o protocolo inteiro fracionamento ocorre sobre o gelo, além da centrifugação 30 segundo entre as etapas. Tempo de transporte experimentos curso indicaram que mantém as células a 4 ° C revoga transporte metal20,21,22; de metal Portanto, porque os experimentos ocorre sobre o gelo, o fracionamento de 40 minutos não é esperado para aumentar significativamente os níveis de metal no periplasm do citoplasma e os níveis de metal são esperados para ser representante de pontos de tempo no qual as células foram Inicialmente, centrifugalized.

Determinação da absorção relativa em diferentes compartimentos celulares pode ajudar a informar dados XFS, corroborar a natureza fisiológica de um substrato, bem como habilitar o investigador a sonda ainda mais os detalhes moleculares de um mecanismo. Por exemplo, adição de mutagénese genética para experimentos de captação radiometal fornece um método direto para reforçar os principais resíduos funcionais ou moléculas envolvidas no transporte do substrato. Vantagens de análises e experiências de captação radiometal incluem rápida reviravolta, alta produtividade, alta reprodutibilidade e paralelização de experimentos comparando as condições de crescimento e construções genéticas.

Divulgações

Os autores declaram que têm não há conflitos de interesse.

Agradecimentos

Também foram recolhidos em GM/CA@APS, que tem sido financiado no todo ou em parte com recursos federais do Instituto Nacional de câncer (ACB-12002) e o Instituto Nacional de General Medical Ciências (AGM-12006). Esta pesquisa utilizou recursos de fonte de fóton avançada (APS), uma facilidade do Estados Unidos Departamento de energia (DOE) escritório de ciência usuário operado para o escritório da ciência DOE, pelo Laboratório Nacional Argonne, sob contrato n º DE-AC02-06CH11357. Uso da fonte de fótons avançada foi apoiado pelo departamento de energia dos EUA, escritório de ciência, escritório de energia ciências básicas, sob contrato n º W-31-109-Eng-38.

Nós gostaríamos de reconhecer a UAB Comprehensive Cancer Center - facilidade de compartilhado Proteomics/espectrometria de massa (P30CA13148-38), por sua assistência na análise de espectrometria de massa.

CdR foi apoiado por uma bolsa da Universidade do Alabama em Birmingham escritório de diversidade, equidade e inclusão. L.L.R. foi apoiado pelo departamento de Radiologia da Universidade de Alabama em Birmingham. O departamento de energia, escritório de ciência, isótopo programa suportado 52produção Mn e A.V.F.M. sob concessão DESC0015773.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Produtos químicos
Polietilenoglicol 4000, EMD MilliporeFisherM1097270100
Sal de Ampicilina de Sódio (Pó Cristalino)FisherBP1760-5
AMRESCO M9 Caldo MédioFisherNC9688886
Bis-Tris, Fisher BioReagentsFisherBP301-100
Cloreto de Cálcio Dihidratado (ACS Certificado)FisherC79-500
Dextrose (D-Glicose) Anidro (Pó Granular/ACS Certificado)FisherD16-500
, Sal Dissódico Dihidratado (ACS Cristalino/Certificado)FisherS311-100
BioReagentes Fisher Microbiologia Meio: LB Broth, MillerFisherBP1426-500
Sulfato de Magnésio Heptahidratado (ACS Cristalino/Certificado)FisherM63-500
Azida de Sódio, Pó BrancoFisherBP922I-500
Cloreto de Sódio (ACS Cristalino/Certificado)FisherS271-500
Fosfato de Sódio Dibásico Anidro (Granular ou em Pó/ACS Certificado)FisherS374-500
Cloridrato de Tris (pequenos flocos brancos / biologia molecular)FisherBP153-500
< strong > Nome< / strong >< strong > Empresa < / strong >< strong > Número de catálogo< / strong >< strong > Comentários < / strong >
< strong > Equipamento < / strong >
Cryschem PlateHamptonHR3-158
Unidades de Filtro Centrífugo EMD Millipore Amicon Ultra-15FisherUFC903024
Filtros de Seringa Estéril EMD Millipore Millex: Membrana PVFD DuraporeFisherSLHV013SL
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pgFisher28-9893-36
GE Healthcare HiTrap IEX HP Colunas Pré-embaladasFisher17-1154-01
NomeEmpresaNúmero de catálogo<strong>Comentários
Cells
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLSFisher230280
Ácido Etilenodiaminotetracético

Referências

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