Method Article

Size Matters: Medição do diâmetro da cápsula em Cryptococcus neoformans

DOI:

10.3791/57171

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February 27th, 2018

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1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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A cápsula de polissacarídeo é o factor de virulência primária em Cryptococcus neoformans, e seu tamanho se correlaciona com a virulência da cepa. Medições de diâmetro da cápsula são usadas em testes fenotípicos e para avaliar a eficácia terapêutica. Aqui um método padrão de indução da cápsula é apresentado, e dois métodos de coloração e diâmetro de medição são comparados.

Abstract

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A cápsula de polissacarídeo de Cryptococcus neoformans é o factor de virulência primário e um dos mais comumente estudados aspectos desta levedura patogênica. Tamanho da cápsula pode variar amplamente entre estirpes, tem a capacidade de crescer rapidamente quando introduziu a estressantes ou baixas condições de nutrientes e tem sido positivamente correlacionado com a virulência da cepa. Por estas razões, o tamanho da cápsula é de grande interesse para pesquisadores de c. neoformans . O crescimento da cápsula de c. neoformans é induzido durante os testes fenotípicos para ajudar a compreender os efeitos de diferentes tratamentos nas diferenças entre cepas de levedura ou tamanho. Aqui descrevemos um dos métodos padrão da cápsula da indução e comparar dois métodos aceites de coloração e medir o diâmetro da cápsula: (i) a tinta indiana, uma mancha negativa, usado em conjunto com microscopia de luz convencional e (ii) co-coloração com corantes fluorescentes da parede celular e cápsula seguido por microscopia confocal. Finalmente, mostramos como a medição do diâmetro da cápsula de amostras manchadas de tinta da Índia pode ser automatizado usando análise computacional de imagens.

Introduction

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Afetando um quarto de milhão de pessoas todos os anos e resultando em mais de 180.000 mortes por ano, o Cryptococcus neoformans é uma levedura patogénica, intracelular e o agente causador da criptococose,1,2, 3. mais atingidas são os pacientes HIV-positivos em países pobres que não têm acesso à terapia anti-retroviral, tornando-os suscetíveis aguda para a doença4,5,6. Dados do CDC indicam que na África subsahariana, c. neoformans mata mais pessoas do que a tuberculo....

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Protocol

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Nota: C. neoformans é um patógeno de biossegurança nível 2 (BSL-2) e pesquisadores que trabalham com ela devem tomar as devidas precauções. Detalhada de procedimentos sobre como para com segurança trabalho com patógenos BSL-2 pode ser encontrado no Center for Disease Control (CDC) site, mas é importante notar que todas as pessoas que entram em contacto com o c. neoformans devem ser devidamente treinadas em manipulação os agentes patogénicos e deve usar sempre equipamento de protecção adequado (EPI), geralmente de látex ou luvas de nitrilo. Além disso, rotores em centrífugas devem ser selados para evitar clorofórmio de amostras e todos os derramamento....

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Results

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Para ilustrar a indução da cápsula, coloracao celular, imagens e técnicas de medição, usamos três estirpes de c. neoformans: Coe o laboratório comum, bem caracterizado, H99S30e duas cepas isoladas clinicamente de anteriormente diâmetro da cápsula desconhecido, B18 e B5231.

O fluxo de trabalho de indução da cápsula, coloração e aquisição de imagens usando tinta de India é m.......

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Discussion

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Durante décadas, a cápsula tem sido um grande foco de pesquisa para os micologistas e clínicos interessados em c. neoformans e criptococose devido ao seu papel como um fator de virulência principais para o patógeno. Usando microscopia para medir diferenças no tamanho da cápsula entre estirpes e sob crescimento diferente condições podem fornecer informações importantes sobre o patógeno e suas respostas aos diversos estímulos (ou seja, diferentes condições ambientais, tratamentos com drogas potenciais,

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Disclosures

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O autor, Hoyin Lai, é o gerente de produto na DRVision que publica o software de análise de imagem automático, Aivia.

Acknowledgements

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Agradecemos o programa de doutorado de Biociências moleculares (MOBI) e o departamento de biologia na Universidade meio de estado de Tennessee (MTSU) para fornecer o financiamento para este estudo. O projeto também foi financiado em parte por uma concessão de projetos especiais, atribuída a D.E.N. pela Fundação MTSU.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Capsule Induction
C. neoformans cellsA cepa de laboratório clínico, H99S, foi um presente gentil do Dr. John Perfect (Duke University).  As cepas clínicas, B18 e B52, foram presentes gentis do Dr. Greg Bisson (Universidade da Pensilvânia).
Caldo de Dextrose de Peptona de Levedura (YPD)Fisher ScientificDF0428-17-5
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Isso é feito em laboratório usando receita padrão (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/alta glicose com L-glutamina, sem piruvato de sódioGE Life SciencesSH30022.01
placas de 6 poçosFalconCL5335-5EA
Incubadora vibratóriaThermo Scientific Incubadora de CO2 MaxQ6000
Fisher ScientificIsotemp
CentrifugeThermo ScientificLegend XTR
Staining
MicrocentrifugeThermo ScientificLegend Micro 21R
Tinta da ÍndiaFisher Scientific14-910-56
Calcofluor brancoSigma-Aldrich18909-100ML-F
18B7 anticorpo anti-GXM de camundongo conjugado a Alexafluor 488Um presente gentil do Dr. Arturo Casadevall (Universidade Johns Hopkins) 
PBS com 1% de albumina de soro bovino (BSA)O PBS é a mesma receita listada acima (linha 4) com 1% de BSA adicionado e esterilizado por filtro.
Sigma-AldrichA9418de Albumina
Soro Bovino Fisher Scientific12-550-143
Lamínulas de vidroCorning2855-18#1.5 espessura
Esmalte transparente ou outro selante
Aquisição de Imagem 
Óleo de imersãoCargille 16484
Microscópio de luz com objetiva de imersão em óleoZeissZeiss Axio A1 com um Plano - NEOFLUAR 100x imersão em óleo NA 1.30 objetiva
Câmera de microscópio de luzZeissZeiss Axiocam Câmera ErCD
Microscópio confocal com objetiva de imersão em óleoZeissLSM 700 confocal de varredura a laser equipado com uma objetiva Plan-Apochromat 63X NA 1.4 imersão em óleo DIC M27.& nbsp;
Software para microscópio confocalZen 2009
Câmera de microscópio confocalNikonNikon Ti-Eclipse com um iluminador de epifluorescência Intensilight (Nikon), câmera de microscópio CoolSNAP MYO (Fotometria), objetiva de imersão em óleo Plan Apo 60x NA 1.40 (Nikon) e trocador de ampliação de 1.5x. 
Software de imagem de campo amploNikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Software de edição de imagemPhotoshop (Adobe)
Software de microscópio para medição manualAxiovision (Carl Zeiss)
Software de análise de imagem para medição automatizadaAivia (DRVision Tecnologias)
Software de planilhaExcel (Microsoft)
Lâminas de microscópio Superfrost de não tóxico

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev....

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Cryptococcus neoformansCapsule DiameterIndia Ink StainingFluorescent Dye StainingConfocal MicroscopyLight MicroscopyAutomated Image AnalysisCapsule InductionYeast Cell MeasurementZ Stack Imaging

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