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Formação de ligações covalente DNA adutos por agentes cancerígenos ativados enzimaticamente drogas In Vitro e sua determinação por 32P-postlabeling

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DOI:

10.3791/57177

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20 de março de 2018

1Department of Biochemistry, Charles University

Neste artigo

Resumo

Avaliar a potência dos produtos químicos ambientais e drogas, a ser enzimaticamente adutos bioactivated gerando covalent DNA e intermediários, é um campo importante no desenvolvimento do câncer e seu tratamento. Métodos são descritos para ativação composta para formar que adutos de DNA, bem como técnicas para a sua detecção e quantificação.

Resumo

Adutos de DNA covalente formado por produtos químicos ou drogas com potência cancerígena são julgadas como um dos fatores mais importantes na fase de iniciação de processos cancerígenos. Essa ligação covalente, que é considerada a causa da tumorigênese, agora é avaliada como um dogma central da carcinogénese química. Aqui, são descritos métodos empregando as reações catalisadas pelo citocromo P450 e enzimas de biotransformação adicional para investigar a potência de produtos químicos ou drogas para sua ativação para metabólitos formando esses DNA adutos. Os procedimentos são apresentados descrevendo o isolamento de frações celulares possuindo enzimas de biotransformação (amostras microssomais e citosólica com citocromo P450 ou outras enzimas de biotransformação, ou seja, peroxidases, NADPH: citocromo P450 oxidorredutase, oxidorredutase de H:quinone NAD (P) ou xantina oxidase). Além disso, são descritos os métodos que podem ser usados para a ativação metabólica de substâncias químicas analisadas por estas enzimas, bem como aqueles para isolamento do DNA. Além disso, os métodos apropriados capazes de detectar e quantificar o DNA químico/drogas-derivado adutos, ou seja, diferentes modificações da técnica P-postlabeling 32e emprego de radioativo marcado analisados produtos químicos, são mostrado no detalhe.

Introdução

O metabolismo de xenobióticos (substâncias químicas ambientais ou drogas) ocorre em duas fases1. As fases I e II pretendem processar os compostos hidrofóbicos originalmente (não solúveis em água) mais hidrofílico (hidrossolúvel), tornando-os facilmente excretable via urina, fezes ou suor. Fase I (functionalization) reações incluem oxidação, redução, e hidroxilação catalisada por enzimas como a citocromo P450s (P450s, CYPs), peroxidases (i. e., ciclooxigenase, COX), aldo-keto redutases (AKRs) e microssomais Flavin, contendo monooxigenases (FMO). Fase I inclui também as reações de redução, mediadas por uma variedade de redutases ou seja, microssomais NADPH: citocromo P450 redutase (POR) e citosólica oxidorredutase de H:quinone NAD (P) (NQO1), xantina oxidase (XO) e aldeído oxidase (AO)1 . Na segunda fase (conjugação), que foram anexados na fase de grupos funcionais são costumava conjugado de pequenas moléculas polares para aumentar ainda mais a polaridade. Exemplos de enzimas, consideradas-se a participar na reação de fase II incluem sulfotransferases (quente), N, O- acetiltransferases (NATs), metiltransferases como catecol -O- metiltransferase (COMT), glutationa S- transferases (GST) e uridina difosfato glucuronosiltransferases (UGTs)1. A classificação das enzimas na fase I ou II é, no entanto, não é rígida, e algumas enzimas, indiscutivelmente, podem ser agrupadas em duas categorias.

Enzimas P450 (CE 1.14.14.1) são o hemo que contém proteínas presentes em vários organismos, que participam da biotransformação de muitos produtos químicos, Catalisando a conversão de3,4. As enzimas P450 catalisam a hidroxilação de muitos substratos, com uma reação onde um átomo de dioxigénio é introduzido a molécula de xenobióticos, enquanto o segundo átomo de oxigênio é reduzido à água de forma pela reação que requer dois elétrons [a equação (1 4.3,)]:

RH + O2 + NADH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

As enzimas P450 localizadas na membrana do retículo endoplasmático de células de mamíferos (microssomal P450 sistemas) são membros do sistema multienzyme monooxigenase, que contém mais NADPH: citocromo P450 redutase (POR) e citocromo b5 , o substrato da enzima denominado como NADH: citocromo b5 redutase. Uma teoria geralmente aceita hypothesizes que o doador dos dois elétrons necessários para P450 é o sistema de NADPH/POR. Não obstante, citocromo b5 pode também atuar como um doador de elétrons para P450, nomeadamente como um doador do elétron reduzindo P450 durante segunda redução do seu ciclo de reação, onde atua em conjunto com a NADH: citocromo b5 redutase2,3,4.

Mamíferos utilizam várias enzimas P450 (por exemplo, as enzimas das famílias, 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 e 27) para a síntese de compostos endógenos valiosos, como os esteroides e usá-los para o catabolismo de produtos naturais2,3 . As outras CYP mamíferos enzimas, tais como humano CYP1A2, 2 9, 2 19, 2D6 e 3A4, metabolizam substâncias químicas exógenas que são usadas como drogas. 5 , 6 as mais importantes enzimas catalisando o metabolismo de drogas são CYPs da subfamília 3A, principalmente CYP3A4. As conversões de xenobióticos, tais como pro-agentes cancerígenos e pro-substâncias tóxicas, são mediadas por humano CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 e 3A42,5. A maioria destes CYPs está presente no fígado (exceto CYP1A1 e 1B1). Não obstante, os CYPs também são expressos em vários órgãos extra-hepáticas. Tais P450s pode ser de grande importância, principalmente quando participar eles bioactivation metabolismo de substâncias químicas (drogas) e intermediários reativos nestes órgãos7. Vários P450s são induzidas por vários compostos que são seus substratos, embora isto não é necessariamente o caso.

Muitas enzimas P450 desempenham um papel na toxicidade química (drogas). Eles podem converter os xenobióticos não somente em seus metabólitos de desintoxicação, mas também ativá-los para espécies reactivas, que modificam a macromoléculas endógenas que além disso, apresentam diferentes propriedades biológicas, geralmente causando sua toxicidade. DNA, lipídios e proteínas podem ser os alvos para a sua modificação por eletrófilos reativos e radicais gerados a partir de produtos químicos registrados. No caso do DNA, resolvendo várias respostas importante gene e seus mecanismos já são conhecidos2,3,4,5.

As mudanças no DNA podem resultar em uma diminuição no controle do crescimento celular, e esse fenômeno é considerado ser o fator predominante, levando ao desenvolvimento de processos cancerígenos. A geração de DNA covalente adutos com produtos químicos ter potência cancerígena é julgada como um dos passos mais importantes na fase de iniciação de cancerígenos processa8,9,10,11. Foi demonstrado que as relações entre a formação do ADN adutos e tumorigênese ocorra, Considerando que uma diminuição na quantidade de DNA adutos é responsável para Quimioprevenção8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. a formação de substância cancerígena/drogas-derivado adutos de DNA depende de bases individuais do DNA e é afetado por sequências destas bases no DNA. Os reparos de DNA adutos dependem da sua localização (na cadeia do DNA transcrita ou não-transcrita) e tipos de nucleotídeos modificados sequências8,11,12,15, 16.

Neste artigo, descrevemos os procedimentos utilizando a conversão catalisada por enzima de produtos químicos (drogas) para investigar sua potência para ser ativado em metabólitos que modificado o DNA (gerar DNA adutos). Para ligação covalente de DNA, o teste composto geralmente deve ser ativado por reacções oxidativas ou redutoras, dependendo de drogas individuais. Oxidativa ou redutora de ativação de produtos químicos testados é mediada por um sistema enzimático P450 dependente, presente na fração microssomal subcellular ou pela redução com redutases apresentar ambos em microssomas (POR, NADH: citocromo b5 redutase, enzimas P450) e no celulares fracções subcelulares citosólica (NQO1, XO, AO, peroxidase). Metabólitos reativos depois ligam ao DNA formar DNA adutos. Porque as reações oxidativas e redutoras são importantes para ativar vários medicamentos para estas espécies reactivas, são descritos os procedimentos experimentais empregando o sistema enzimático de oxidação/redução. Além disso, os métodos apropriados capazes de detectar e quantificar esses DNA adutos são descritas em detalhes.

Dois procedimentos independentes para determinar se a substância, ativada por sistemas enzimáticos, está vinculado ao DNA são recomendados: a técnica de P-postlabeling 32e utilizando composto radioativo marcado (EG., 3H ou 14 C). Para o primeiro piloto, o ensaio de 32P-postlabeling de triagem é recomendado. A determinação do teor de DNA em soluções, precisamente avaliada, deve preceder a ambos os métodos.

O 32P-postlabeling técnica utiliza a hidrólise enzimática de DNA modificado por produtos químicos não-radioativo (substância cancerígena/drogas) para 3´-phosphodeoxynucleosides, fosforilação adicional com fósforo radioativo (32P) no 5´... OH posição e a separação do produto químico-deoxynucleotide adutos de normais (sem modificações) desoxinucleótidos por cromatografia17 (Figura 1). DNA modificado por um composto químico é hidrolisada por uma mistura de endonuclease, micrococcal nuclease e do exonuclease, conhecido como baço fosfodiesterase. A mistura de DNA hidrolisado contendo ambos normais (sem modificações) e modificado desoxirribonucleosídeo 3´-monophosphates é reagida com [γ -32P] ATP na presença de portadora (não-radioativo) ATP e T4-polinucleotídicas quinase em pH 9,5 a forma 5´- 32P-rotulados 3´, 5´-bisphosphates (procedimento "padrão" na Figura 1). O pH alcalino utilizado é capaz de minimizar a actividade enzimática da quinase de T4-polinucleotídicas para dephosphorylate desoxirribonucleosídeo 3´-monophosphates em posição 3´. Separação e resolução de 32P-rotulado adutos de desoxinucleótidos rotulado que não são modificados por químicos é realizado por cromatografia de camada fina permutadora multidirecional (TLC) em polyethyleneimine (PEI) celulose (Figura 2 ). As etapas de eluição de primeiro e segundo (no sentido de D1 e D2), rotulados normais desoxinucleótidos (sem modificações), bem como fosfato [32P] é eluído desde o início da placa de TLC-PEI-celulose usando soluções de água do eletrólito em um pedaço curto de cromatográfica papel aplicado na parte superior da placa de TLC, Considerando que o desoxinucleótidos contendo produtos químicos acoplados exibindo propriedades hidrofóbicas (substância cancerígena/drogas-adutos) são mantidos no início da placa de celulose-PEI ser adicionalmente resolvidos com vários sistemas solventes diferentes em D3 e D4 as direções (Figura 2). Localização de adutos é executada usando autoradiografia tela reforçada; adutos a separados são detectados como manchas escuras de reconhecíveis em películas de raio x. As áreas de manchas são extirpadas da placa e usadas para quantificar a radioatividade por cintilação líquida ou Cerenkov contando. Um fósforo de armazenamento de imagem método que foi adaptado para mapear e quantificar o DNA adutos em cromatogramas detectadas pelo 32P-postlabeling ensaio agora também é usado. 18 máquina the Instant Imager é frequentemente utilizada para tal deteção e quantificação de DNA adutos. Este método fornece mais de 10 vezes maior sensibilidade para a detecção de 32P do que a técnica da tela reforçada autoradiografia19.

Quantidades de DNA adutos são determinados como valores de parente aduto rotulagem (RAL), calculado através da equação (2) como segue:

CPM. em aduto desoxinucleótidos
RAL =---(2)
atividade específica de 32P-ATP (em cpm. / pmol) desoxinucleótidos x pmol

Os valores da APL são a relação de taxas de contagem de desoxinucleótidos aduzidos sobre taxas de contagem do total [aduzidos e normais (sem modificações) desoxinucleótidos] desoxinucleótidos20,21. No entanto, este cálculo baseia-se na igualdade rotular as eficiências de adutos e normal desoxinucleótidos22. O procedimento clássico ("padrão") dos 32P-postlabeling técnica é apropriado para adutos de DNA diferentes (volumosos e/ou não-volumosos adutos), no entanto, a sua sensibilidade não é satisfatória detectar adutos encontrado em pequenas quantidades no DNA. Usando este procedimento, a quantidade de um aduto em 10 desoxinucleótidos7 sem modificações no DNA (0,3 fmol aduto / µ g DNA) é detectável.

Uma variedade de modificações deste clássico 32procedimento P-postlabeling têm sido utilizados para elevar a sensibilidade da técnica. Até 10 a 100 vezes maior sensibilidade de determinação de adutos por 32P-rotulagem foi conseguido usando limitantes níveis de ATP [γ -32P] (o processo de intensificação). 23 , 24 um procedimento adicional, proporcionando que um aumento na sensibilidade do método 32P-postlabeling utiliza uma incubação de digerido DNA contendo adutos com nuclease P1 (de Penicillium citrinum)21 (Figura 1). Esta enzima prefere dephosphorylate sem modificações desoxirribonucleosídeo 3´-monophosphates, Considerando que o desoxinucleótidos com produtos químicos acoplados (nucleotídeos aduzidos) são essencialmente não os substratos desta enzima. Portanto, dephosphorylated desoxirribonucleosídeo 3´-monophosphates (ou seja, deoxyribonucleosides) não são fosforiladas pela quinase T4-polinucleotídicas pelo fosfato [32P] de γ -32P] ATP. No entanto, alguns dos nucleotídeos onde produtos químicos são vinculados (desoxinucleótidos aduzidos), tais como arylamine adutos substituído no C8 de Desoxiguanosina, pode bedephosphorylated por esta enzima. Em contraste, a maioria dos outros adutos (p. ex., adutos substituído no N2 de Desoxiguanosina) não são dephosphorylated por nuclease P1. Esta modificação de 32P-postlabeling faz com que este método consideravelmente mais sensível, aumentando a sua sensibilidade por mais de três ordens de magnitude. Além disso, esta versão de 32P-postlabeling fornece um método onde a maior quantidades de DNA (5-10 µ g) e um excesso de transportadora-livre [γ - 32P] ATP pode ser utilizado.

Um outro método para enriquecer os adutos, descrito por Gupta25, utiliza as propriedades físico-químicas adutos Propriedades de deoxynucleotide volumoso, que podem ser extraídos em n-butanol na presença de um tetrabutilamónio de agente de transferência de fase cloreto de (TBA) (Figura 1) antes da [32P] fosfato etiquetando, Considerando que não modificados desoxinucleótidos mal são extraídos por este solvente orgânico. No entanto, adutos menos hidrofóbico, constituído por exemplo de desoxinucleótidos modificado com metades volumosos não aromáticos ou alquila pequena resíduos, não são efetivamente extraídos com n-butanol. Portanto, eles são essencialmente indetectáveis quando são analisados por esta modificação do método de P-postlabeling a 32.

Ambas as versões mencionadas anteriormente de 32P-postlabeling aumentar a sensibilidade e a quantificação de DNA adutos enormemente (até três ordens de magnitude), sendo capaz de detectar um aduto por 109,10 normal nucleotídeos (0.3 - 3 amol / µ g DNA). Esses dois métodos são recomendados para testar os produtos químicos para sua eficiência ligar covalentemente ao DNA e, portanto, são descritos neste trabalho em detalhes.

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Protocolo

Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com os regulamentos para o cuidado e o uso de animais de laboratório (311/1997, Ministério da agricultura, República Checa), que está em conformidade com a declaração de Helsinque.

1. isolamento de fracções microssomais e citosol hepáticos

  1. Prepare o fígado fracções subcelulares (microssomas ricas em enzimas P450 ou citosol rica em redutases ou solúveis peroxidases) de ratos por centrifugação diferencial simples (105.000 x g).
    Nota: A pelota e sobrenadante são tidos como microssomas e citosol, respectivamente.
    1. As amostras de fígado (1-10 g) duas lavagens com buffer de 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 contendo buffer de KCl (tampão 1) de 150 mM (maiores volumes de 10 vezes do que o peso do tecido, ou seja, 10-100 mL) e cortar os tecidos em pedaços pequenos (de em torno do tamanho de 2 x 2 mm).
    2. Homogeneizar o tecido na presença desse buffer (> 3 mL de volume/peso/g) em homogeneizador a 4 ° C por 5 min e descarte os pedaços não homogeneizado residuais do tecido por meio de filtração papel de filtro. Centrifugue o homogenate a 600 x g durante 10 minutos a 4 ° C e transferir o sobrenadante para outro tubo de centrifugação.
    3. Re-homogeneizar a pelota no buffer 1 (1 mL por 1 g de tecido), repita a etapa 1.1.3. e descartar a pelota. Centrifugue em pool sobrenadantes a 15.000 x g por 20 min a 4 ° C. Transferi o sobrenadante para outro tubo de centrifugação.
    4. Centrifugue o sobrenadante a 105.000 x g durante 60 minutos a 4 ° C. Recolher o sobrenadante (citosol) e armazená-lo em alíquotas (1-10 mL) a-80 ° C. Caracteriza o citosol para a quantidade de proteína usando o método descrito por Bradford26.
    5. Ressuspender o pellet em tampão de fosfato de sódio de 100 mM, pH 7,4 (> 2 mL de volume/peso/g), centrifugar 105.000 x g por 60 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante. Re-homogeneizar a pelota (microssomas) em tampão de 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 contendo 150 mM KCl e 20% de glicerol (< 5 mL de volume/peso/g) em homogeneizador a 4 ° C. Armazenar microssomas em 0,5 - alíquotas de 1 mL a-80 ° C. Caracteriza microssomas do conteúdo de proteínas usando o método descrito por Bradford26.
    6. Determine a concentração de citocromo P450 em microssomas.
      Nota: A concentração de enzimas P450 em microssomas é medida conforme descrito por Omura e Sato27, determinando a absorção do complexo de P450 reduzida com monóxido de carbono (CO). Monóxido de carbono é um composto tóxico e deve ser manuseado com cuidado e em um capuz.

2. incubação do teste químicos (agentes cancerígenos/drogas) com o DNA na presença de sistemas enzimáticos

  1. Incubação de teste químicos (agentes cancerígenos/drogas) com o DNA na presença de oxidativos sistemas enzimáticos contendo citocromo P450
    1. Prepare as misturas de incubação contendo, em um volume final de 0,75 mL a 4 ° C, os seguintes compostos e sistemas enzimáticos.
      1. Misturar 100 mM de tampão de fosfato, pH 7,4, (0,375 mL) com sistema de geração de NADPH (10 mM MgCl2, 10mm D-glicose 6-fosfato, 10mm NADP+, 1 U/mL D-glicose 6-fosfato desidrogenase) ou 10 mM NADPH (75 µ l).
      2. Adicionar em microssomas esta mistura ou pura P450 recombinante em Supersomes, que são microssomas isoladas do insetos células transfectadas com uma construção de baculovirus contendo cDNA recombinantes enzimas P450, 50 pmol P450 enzimas em 50 µ l microssomais ou supersomal preparações - hepáticas fracções microssomais isoladas no laboratório, ou de uma fonte comercial.
      3. Adicionar 1 mg DNA de timo de vitelo (0,3 mL de solução - 3,3 mg/mL em água destilada) e agitar um agitador vortex para 5 s.
      4. Finalmente, adicione 7,5 drogas ellipticine teste do mM 0,1 µ l dissolvidas em DMSO e 42,5 µ l de água para atingir um volume de mistura de incubação de 0,75 mL destilada. Produtos químicos de uso rotulado com 3H ou 14C ou produtos químicos sem rótulo, dependendo do procedimento para a deteção do ADN adutos.
      5. Agitar um agitador vortex durante 5 s. Incubar em tubos abertos a 37 ° C por 30-60 min.
      6. Também prepare dois incubação do controle, da mesma forma, mas (i) sem um sistema de activação (amostras microssomais) ou (ii) com ele, mas sem o teste composto.
  2. Incubação do teste químicos (agentes cancerígenos/drogas) com o DNA na presença de sistemas enzimáticos redutoras
    1. Prepare as misturas de incubação contendo, em um volume final de 0,75 mL a 4 ° C, os seguintes compostos e sistemas enzimáticos.
      1. A 4 ° C, misture 100 mM Tris-HCl buffer, pH 7,4, contendo 0,2% Tween 20, (0,375 mL), solução de 10 mM de cofator da enzima redutiva do NQO1 (NADPH) (75 µ l), fração citosólica (frações citosólica hepáticas - isoladas no laboratório ou no caso de usar o citosol frações isoladas de doadores humanos individuais, que eles foram obtidos da fonte comercial contendo 1 mg de proteína (50 μL)).
      2. Adicionar o DNA de timo de vitelo 1 mg (0,2 mL de solução - 3,3 mg/mL de água destilada) e agitar um agitador para 5 s.
      3. Finalmente, adicione 7,5 µ l 0,1 mM teste químico (dissolvido em água destilada, metanol, etanol ou DMSO, dependendo da solubilidade do composto) e 42,5 µ l de água destilada água para atingir um volume de 0,75 mL para a mistura de incubação. Produtos químicos de uso rotulado com 3H ou 14C ou produtos químicos sem rótulo, dependendo do procedimento para a deteção do ADN adutos (veja abaixo).
      4. Purga-se a mistura reacional com argônio para 1 min. agitar um agitador durante 5 s. Incubar em tubos fechados a 37 ° C por 30-60 min.
      5. Também prepare dois incubação do controle, da mesma forma, mas (i) sem um sistema de activação (frações citosólico) ou (ii) com ele, mas sem os produtos químicos do teste.
  3. Extração de misturas de incubação com solventes orgânicos para remover o excesso de produtos químicos do teste
    1. Misture a mistura de incubação em um tubo de ensaio com um tampão com o mesmo volume de acetato de etila (ou éter dietílico ou hexano) adicionando estes solventes. Agite o conteúdo do tubo em uma coqueteleira até formar uma emulsão.
    2. Gire (3 min) a 1.600 x g em uma centrífuga à temperatura ambiente. Se as fases orgânicas e aquosas não são devidamente separados, gire mais uma vez para um longo período ou em uma maior velocidade de centrifugação.
    3. Retire a fase superior, orgânica, coleta com uma pipeta. Se pequenos volumes (< 400 µ l) são usados, utilizar uma pipeta automática equipada com uma ponta adequada. Posta de lado esta fase orgânica.
    4. Repita as etapas 2.3.1., 2.3.2. e 2.3.3. Remover um fluxo de gás nitrogênio residuais solventes orgânicos (pelo menos 5-10 min de remoção são necessários).
  4. Isolamento do DNA de incubação do
    1. Extração de DNA de soluções com fenol/clorofórmio e sua precipitação com etanol
      1. Elimine as proteínas para isolar o DNA de misturas de incubação extraindo proteínas de soluções de DNA com fenol, fenol/clorofórmio (1:1) e clorofórmio pelo procedimento mostrado abaixo.
      2. Combine a mistura de incubação com a mesma quantidade de fenol ou fenol/clorofórmio (1:1), em um falcão ou tubo de Eppendorf com tampa. Agite a mistura até formar uma emulsão.
      3. Gire (3 min) a 1.600 x g em uma centrífuga à temperatura ambiente. Se as fases orgânicas e aquosas não são devidamente separadas, gire mais uma vez para um período mais longo ou a uma maior velocidade de centrifugação.
      4. A fase superior de água com uma pipeta de transferência para um novo tubo de polipropileno. Se pequenos volumes (< 400 µ l) são usados, utilizar uma pipeta automática equipada com uma ponta adequada. Remova a interface de proteína em conjunto com a fase orgânica.
      5. Combine a fase superior de água com a mesma quantidade de uma mistura de fenol e clorofórmio (1:1). Reproduza passos, 2.4.1.2. -2.4.1.4.
      6. Combine a fase superior de água com a mesma quantidade de clorofórmio e repita os passos de 2.4.1.2. -2.4.1.4. Recupere o DNA por precipitação com 2 volumes de etanol frio (-20 ° C). Determine o volume da solução de DNA.
      7. Adaptar-se a concentração de cátions monovalentes por adição de cloreto de sódio de 5 M para a final as concentrações de 0,1 M. agitar vigorosamente. Combinar com 2 volumes de etanol frio (-20 ° C) e misture bem. Arrefecer a-20° C.
      8. Armazenar a-20 ° C até que DNA é precipitado. Quando o DNA está fragmentado durante a incubação do (EG., pela formação de radicais de oxigênio durante a reação de ativação enzimática) ou durante o procedimento de isolamento para o tamanho do DNA que é pequeno (< 1 kb) ou quando o DNA está presente em pequenas quantidades (< 0,1 mg / mL), o tempo de resfriamento tem que ser aumentada e a temperatura diminuiu a-70 ° C.
      9. Gire (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C em uma centrífuga. Se o DNA está presente em baixas concentrações, ou sob a forma de pequenos fragmentos, gire mais uma vez por um período mais longo (30 min). Desprezar o sobrenadante.
      10. Para remover qualquer solutos (ou traços residuais do teste químico) que podem estar presentes no DNA precipitado, lave o DNA com 70% de etanol e éter dietílico. Lavagem de precipitado de DNA com frio (-20 ° C) 70% de etanol. Gire (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C em uma centrífuga. Desprezar o sobrenadante.
      11. Repita a etapa 2.4.1.10. Lavagem de precipitado de DNA com frio (-20 ° C) 70% de etanol. Gire (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C em uma centrífuga. Desprezar o sobrenadante.
      12. Repita a etapa 2.4.1.10. Coloque o tubo num estado vertical em papel absorvente para remover o sobrenadante residual. Lave o sedimento de DNA adicionando 1 mL de éter dietílico para descartar os resíduos potenciais do teste químico do DNA isolado. Gire (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C em uma centrífuga. Desprezar o sobrenadante.
      13. Dissolver o sedimento de DNA no volume apropriado (geralmente em 100-400 µ l a obter uma concentração de DNA de 0.5 - 1 µ g / µ l) de água destilada (ou 0,15 mM citrato de sódio e 1,5 mM de cloreto de sódio). A solução de DNA pode ficar em 4 ° C durante a noite, ou pode ser aquecida a 37 ° C por 10-30 min aumentar a dissolução de DNA.
      14. Antes do armazenamento, separe o DNA em pequenas alíquotas (10-20 µ l), porque repetidos congelamentos e descongelamentos das soluções de DNA pode resultar em uma diminuição no aduto concentrações. Loja a-80 ° C ou mais frio.
        Nota: A determinação espectrofotométrica de DNA: O método simples e exato, que é amplamente utilizado para medir a quantidade de DNA em uma preparação, se a amostra é pura (ou seja, sem uma quantidade significativa de contaminantes, tais como proteínas, fenol ou outros ácidos nucleicos), é a medição espectrofotométrica da quantidade de DNA de UV irradiação absorvida pelas bases (consulte os procedimentos descritos anteriormente)28.
  5. Procedimentos para a deteção do ADN aduto formação
    1. 32 Ensaio de P-postlabeling
      Nota: Hidrólise de DNA utiliza hidrolisado preparado nesta fase para a análise de adutos (2.5.1.), bem como de normais (sem modificações) desoxinucleótidos (2.5.7.).
      1. Dissolver micrococcal nuclease (MN) em água numa concentração de ~ 450 unidades (U) / mL. Dialize contra água destilada e ajustar a 300 U/mL. Dialize solução de fosfodiesterase (SPD) baço e ajustar para 4 U/mL.
      2. Misture MN e SPD para concentrações finais 150 mU / µ l MN e 2,5 mU / µ l SPD (solução de MN/SPD). Levar a solução de DNA contendo 12,5 µ g e evaporar a seco em um evaporador. Dissolver em 6,5 µ l de água destilada.
      3. Adicionar 5,0 µ l de solução de MN/SPD (concentração final de MN é 60 mU / µ l, concentração final do SPD é mU 1 / µ l) e 1,0 µ l tampão de digestão (concentração final de succinato de sódio é de 20 mM, concentração final de CaCl2 é de 8 mM). O volume final da mistura é 12,5 µ l. Mix e permitir que reações por 3 h a 37 ° C.
      4. Remover 2,5 µ l (transferência para outro tubo) para mais de diluição e análise de desoxinucleótidos não modificados (2.5.7).
    2. Processo de enriquecimento da nuclease P1
      1. Para os restantes µ 10,0 l de hidrolisado, adicionar 0,65 µ l de sódio de tampão de acetato (concentração final, 40mm), solução de2 0,65 µ l ZnCl (concentração final 0.1 mM), 1,25 µ l PN1 solução (concentração final, 0.385 µ g / µ l) e 0,45 µ l de água destilada. O volume final da mistura é µ l 13.
      2. Permita que a mistura se reagir durante 30 min a 37 ° C e acabar com a reação com adição de 3 µ l de solução de Tris.
    3. n-processo de enriquecimento de Butanol
      1. Para os restantes µ 10,0 l de hidrolisado de DNA, adicione 215 µ l de solução de formiato de amônio 11,6 mM, pH 3.5 e solução de cloreto de TBA de 10 mM 25 µ l. Extraia com 250 µ l n-butanol (saturado com água) misturando vigorosa. Girar (3 min) a 1.600 x g de camadas separadas e tirar o superior n-camada de butanol. Extrair mais uma vez com 250 µ l n-butanol (saturado com água), girar, tire o superior n-butanol camada e combinam com extrato antigo.
      2. Adicione 400 µ l água (saturado com n-butanol) a este extrato e misture vigorosamente. Gire para camadas separadas e excluir a camada aquosa inferior. Repita este procedimento de lavagem usando 400 µ l de água (saturado com n-butanol). Adicionar 3 µ l de solução de Tris-HCl, pH 9.5, de 250 mM para o n-camada de butanol. Evaporar o n-butanol à secura em um evaporador a temperatura ambiente.
      3. Dissolver o resíduo em 100 µ l n-butanol, evaporar a seco novamente e dissolver o resíduo em 16,0 água µ l.
    4. Rotulagem dos adutos
      1. Adicionar 1 µ l de solução-tampão bicine (rotulagem tampão) e 4,5 µ l de uma mistura contendo 100 µCi [γ -32P] ATP, 45 pmol de ATP frio e 10.0 U de T4-PNK (T4-phosphonucleotide quinase) 16,0 solução µ l de mistura de enriquecimento PN1 ou butanol. As concentrações finais dos reagentes será o seguinte: bicine de 20 mM, 10 mM MgCl2, 10mm dithiotreitol, espermidina 0,5 mM e PNK-0.5 U / µ l T4, ATP de 3 µM. O volume total da mistura é de 20 µ l.
      2. Permita que a mistura se reagir durante 30 min à temperatura ambiente. Aplicar toda a amostra (i. e. 20 µ l) na placa de TLC PEI-celulose (2.5.6.).
    5. Avaliação da eficácia da PN1 ou n -butanol, realçando os procedimentos
      1. Lave a parte inferior do tubo com 50 µ l de água. Misture vigorosamente por 30 s e spin (1 min) a 1.600 x g em uma centrífuga para estabelecer lá não é nenhuma contaminação na tampa. Spot 5 µ l sobre uma placa de TLC PEI-celulose (20 x 20 cm). Cromatografar usando uma solução de 280mm (NH4)2então4 e 50mm NaH2PO4, pH 6,8.
    6. Separação de TLC de desoxinucleótidos aduzidos
      1. Pré-lavagem as placas TLC com água destilada. É recomendado especialmente para pratos caseiros.
        Nota: Esta lavagem deve ser efectuada para remover a cor amarela de placas, uma cor que pode elevar o fundo, particularmente na parte da frente de solvente.
      2. Manchar toda a amostra na placa de TLC PEI-celulose e começar a cromatografia (2.5.4.); limpeza de adutos é executada através do desenvolvimento da placa nas direções D1 e D2 (Figura 2).
      3. Desenvolva a placa em uma direção de D1 (Figura 2). Tampão de fosfato de sódio do uso 1,7 M, pH 6,8, para garantir que o DNA adutos estão permanecendo no início da placa de TLC. De forma análoga, desenvolva a placa em uma direção de D2 usando esse buffer. Para obter informações sobre possíveis buffers para procedimentos, consulte soluções descritas para resolução de vários tipos de adutos de20,28.
        Nota: O desenvolvimento da placa em uma direção D2 pode ser omitido.
      4. Lave a placa em água desionizada após cromatografia por cerca de 5 min em dois banhos consecutivos. Depois disso, seca as placas.
      5. Desenvolver as placas em direção de D3 e D4 usando tampão de formiato de lítio 3,5 M, pH 3.5, contendo 0,5 e 8,5 M ureia para D3 direção M Tris-HCl de buffer, pH 8,0, contendo 0,8 M LiCl e 8,5 M de ureia para direção D4 (Figura 2). Os solventes devem ser ajustados para desenvolver os aduto pontos sobre a placa de TLC. Para obter informações sobre possíveis buffers para procedimentos em desenvolvimento D3 e D4, consulte as soluções descritas para resolução de vários tipos de adutos23,24,25,28.
      6. Para evitar problemas em D4, após o desenvolvimento em uma direção de D4 e uma lavagem de água, desenvolva as placas (ao longo de D4) em 1,7 M de fosfato de sódio, pH 6.0 (geralmente designado como desenvolvimento em direção D5), a parte superior de um pavio de papel (12 x 11,5 cm).
        Nota: A direção de D5 também pode ser omitida. Neste caso, é necessário abrir o tanque de TLC quando o solvente atingiu o topo do TLC e permitir um funcionamento para até 60 min. Este método é ainda melhor do que a adição de um feltro de lubrificação (o método frequentemente usado em muitos laboratórios para excluir quaisquer problemas em D4).
    7. Quantificação de desoxinucleótidos (sem modificações) normais após hidrólise
      1. Diluir uma alíquota do hidrolisado (de 2.5.1. descrevendo a hidrólise de DNA) com água destilada, (i. e., 2,5 µ l da mistura de digestão 2.5.1. ajustado para 250 µ l, e 10 µ l desta solução ajustada a 150 µ l).
      2. Tome um 5 µ l (10 pmol normal desoxinucleótidos) alíquota deste digest, adicione 2,5 µ l 10 mM Tris-HCl de tampão, pH 9.0 e rótulo como em 2.5.4. (o volume final da mistura é de 10 µ l). Deixe reagir durante 30 min à temperatura ambiente.
      3. Tirar um 4 µ l alíquota da mistura e diluir a 750 µ l com 10 mM Tris-HCl, pH 9.0. Mistura e rotação para estabelecer que não há nenhuma contaminação da tampa. Aplica 5 µ l sobre uma placa de TLC PEI-celulose. Desenvolver a placa de TLC, em uma solução de 280mm (NH4)2então4 e 50mm NaH2PO4, pH 6,5. Deixe para secar depois TLC.
      4. Use autoradiografia é executada por aproximadamente 45 min à temperatura ambiente para localizar os quatro sem modificações deoxynucleotide bis-fosfatos. Corte para quantificação por cintilação líquida ou Cerenkov contando.
    8. Cálculo do parente aduto rotulagem (RAL)
      1. Determine os valores de contagem nas manchas de aduto e as contagens em alíquota de rotulado desoxinucleótidos (normais) sem modificações.
        Nota: Este último tem que ser determinado por 180.000 acusações menos material do que o anterior, uma figura que é o fator de conversão a aplicar para a contagem de desoxinucleótidos (normais) não modificados para avaliar os valores RAL de aduto níveis. RAL de DNA adutos é calculado de acordo com a equação (2) mostrada acima.
    9. Deteção de vinculação do teste de substâncias cancerígenas ou drogas de DNA usando drogas radioativo marcado
      1. Avalie a 3H ou 14C radioactividade de DNA modificado com produtos químicos pela contagem de cintilação líquida.
      2. Adicione 10-50 µ l da solução de DNA a 3 mL de uma solução de cintilação no frasco de cintilação. Misture bem. Medir a radioatividade usando o contador de cintilação.

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Resultados

Usando os protocolos descritos aqui para a utilização de ativação catalisada por enzima (ou seja, P450, peroxidase, redutase) para investigar a potência dos produtos químicos (agentes cancerígenos/drogas) para ser metabolizada e intermediários resultando em suas ligações covalentes ligação ao DNA (geração de DNA adutos), fomos capazes de resolver (i) um romance mecanismo da ação farmacológica do ellipticine agente anticâncer (para uma revisão, ver,29,...

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Discussão

Neste trabalho, está demonstrado uma metodologia amplamente acessível para estudar a potência dos produtos químicos para ser bioactivated e intermediários metabólicos, resultando na geração de DNA covalente adutos. Esta é uma questão crucial, porque a avaliação da potência de produtos químicos ambientais ou drogas de sua ativação enzimática de metabolitos gerando covalent DNA adutos é um campo importante no desenvolvimento do câncer e seu tratamento. Agora, a modificação do DNA por agentes cancerígenos, considerada a cau...

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Divulgações

O autor não tem nada para divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi suportado pela Fundação de ciência Checa (GACR, concessão 17-12816S).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
TrisSigma-Aldrich252859
Cloreto de potássioSigma-AldrichP9541
Acetato de sódioSigma-AldrichS2889
FenolRoth0032.8
Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamilicoRothA156.1
EtanolPenta70390-11000
DNA do timo da panturrilhaSigma-AldrichD4522
NADHSigma-AldrichN7004
NADP+Sigma-AldrichN5755
NADPHSigma-AldrichN7505
D-glicose 6-fosfatoSigma-Aldrich7647001
D-glicose 6-fosfato desidrogenaseSigma-AldrichG6378
SupersomesCorning Gentest456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Microssomas hepáticos humanosCorning Gentest452172
Tween 20Sigma-AldrichP1379
HipoxantinaSigma-Aldrich77662
2-HidroxipirimidinaSigma-AldrichH56800
Acetato de etilaSigma-Aldrich437549
Éter dietílicoSigma-Aldrich179272
Nuclease microcócica de Staphylococcus aureusSigma-AldrichN3755
Baço fosfodiesterase do baço de bezerro,Calbiochem524711
Nuclease P1 de Penicillium citrinumSigma-AldrichN8630
BicineSigma-Aldrich163791
DL-DithiotreitolSigma-AldrichD0632
EspermidinaSigma-AldrichS2626
Cloreto de tetrabutilamônioSigma-Aldrich86870
n-ButanolSigma-Aldrich437603
T4-polinucleotídeo quinaseUSB Corp70031Y
[γ-32P]ATPHartman Analytic GmbHFP-201
Placas TLC de celulose impregnada com PEIMacherey-Nagel801053
Packard Instant Imager A202400PackardG120337
EllipticineSigma-Aldrich285730
3-Nitrobenzantronapreparada (sintetizada) como mostrado na ref. 40
Tipo II

Referências

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