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Imagem de Intravital dois fotões de leucócitos durante a resposta imune em fígado de rato lipopolissacarídeo-tratados

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DOI:

10.3791/57191

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6 de fevereiro de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Estabelecemos um protocolo cirúrgico romance para a imagem latente de dois fotões de fígado de ratos ao vivo com invasão mínima. Com esta técnica, identificamos a estrutura detalhada do fígado durante endotoxemia induzidas pelo lipopolissacarídeo. Nós antecipamos que este método pode ser utilizado para determinar a eficácia de vários tratamentos de reagentes para migração de leucócitos hepática.

Resumo

Sepse é um tipo de infecção grave que pode causar a falha de órgãos e tecidos danos. Embora as taxas de mortalidade e morbidade associada com sepse são extremamente elevado, não direto tratamento ou órgãos relacionados com o mecanismo foi examinado em detalhes em tempo real. O fígado é o órgão chave que gerencia as toxinas e infecções no corpo humano. Neste documento, tivemos como objetivo realizar intravital imagem latente do fígado de rato após indução de endotoxemia para acompanhar a motilidade das células do sistema imunológico, tais como neutrófilos e macrófagos capsulares hepáticas (LCMs). Nesse sentido, nós projetamos um novo método cirúrgico para exposição do fígado com cirurgia minimamente invasiva. Os ratos foram injetados intraperitonealmente com lipopolissacarídeo (LPS), um endotoxina comum. Usando nossa nova abordagem cirúrgica para exposição e intravital imagem do recrutamento rato fígado, que encontramos o neutrófilo em proteína de LPS-tratados LysM-verde fluorescente (GFP) fígado de rato foi aumentado em comparação com isso em tampão fosfato fígado de tratados com solução salina. Após o tratamento de LPS, o número de neutrófilos aumentou significativamente com o tempo. Além disso, estamos com êxito usando ratos CX3Cr1-GFP, visualizado fígados macrófagos residentes chamados LCMs. Portanto, para investigar a eficácia de novos reagentes para controlar a mobilidade imune na vivo, determinando a motilidade e morfologia dos neutrófilos e LCMs no fígado pode permitem identificar efeito terapêutico no órgão falha e tecido danos causados por ativação de leucócitos na sepse.

Introdução

O fígado é o órgão metabólico importante nos mamíferos; Ele atua como uma torre de controle para desintoxicação, hormônios e energia1. Devido à sua importância, os pesquisadores realizaram muitos experimentos in vitro e in vivo para elucidar as alterações no fígado durante a inflamação. A microscopia intravital tem sido usada para capturar imagens ao vivo do fígado2 . Com efeito, fígado de vários métodos de imagem têm sido introduzidos2,3,4,5,6. No entanto, a fim de desenvolver uma abordagem cirúrgica mais simplificada e estabilização do órgão-alvo e as células do sistema imunológico, nós projetamos um protocolo simples que pode orientar pesquisadores para minimizar o seu esforço para a imagem latente intravital.

Neste estudo, introduzimos uma câmara de imagem estável e romance e uma técnica cirúrgica que pode ser usada para minimizar o sangramento e possível infecções. Confirmamos que o fígado permaneceu intacto por mais de 2 h. Com este método, identificamos com êxito morfologias de LCMs7 e neutrófilos sob condição séptica. Desde que esse método minimiza fatores confundimento, físicos e biológicos, tais como inflamação trêmula e inesperada durante o procedimento cirúrgico, prevemos que este método pode ser usado para observar reações agudas de células imunes no fígado em resposta a reagentes como LPS.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê de uso de Yonsei Universidade faculdade de medicina, Coreia e institucional Cuidado Animal. Proteína de LysM-verde fluorescente (GFP; gfp / +) ratos8 e CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 ratos em 8-12 semanas de idade foram utilizados para a imagem latente intravital. Todos os instrumentos cirúrgicos foram esterilizados e desinfetados com álcool a 70%.

1. personalizados rato fígado câmara com apoio de ferramentas de imagem

  1. Fígado de rato de imagem projeto câmara
    1. Fazer uma câmara do seguinte tamanho de fígado de rato de imagem (Figura 1): câmara interna (120 mm comprimento x 160 mm de largura x 30 mm altura), Câmara exterior (100 mm comprimento x largura 100 mm x 24 mm altura), parafusos (altura de 3 mm × 30mm Ф), nozes (Ф 4 mm) e nozes em forma de asa (Ф 4 mm).
    2. Medir o agente de cura e elastômero base na proporção de 1:9 para fazer um total de 120 g de silicone.
    3. Coloque a mistura de silicone líquido em um Erlenmeyer de 250 mL e misture bem. Em seguida, coloque o frasco num exsicador e remover bolhas de ar por cerca de 1h sob vácuo através da bomba.
    4. Despeje a mistura do silicone líquido em uma câmara do mouse personalizados tão alta quanto 10 mm de altura e que cura por um par de dias (figura 1A).
  2. Preparação de slides de cobertura e o fígado cama de fixação
    1. Sobre o frame do metal, anexe o vidro de tampa usando a cola de silicone. Deixe secar por 1 dia (figura 1B).
    2. Para efetivamente manter a água destilada para a lente de imersão de água, uma estrutura de bloqueio de água semipermanente é essencial. Fazer 1 mm arredondamento cola de silicone e endurecê-lo durante a noite.
    3. Misture o agente de cura e elastômero base e em seguida despeje em uma placa de 6 a uma altura de aproximadamente 8-10 mm. realize o processo de endurecimento conforme descrito em 1.1.2-1.1.4.

2. preparação de LPS

  1. Prepare-se estéril 1 × fosfato salino (PBS) para diluir o pó de LPS da Salmonella enterica sorotipo enteritidis. (1 × PBS: 137 mM NaCl, KCl de 2,7 mM, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4).
  2. Pré-aquecer o PBS em banho-maria a 37 ° C e abrir a garrafa de pó de LPS (25 mg) cuidadosamente.
  3. Usando um auxílio de pipeta, despeje a PBS estéril (5 mL) do frasco de pó de LPS e agitar suavemente ou suspender a solução para preparar a solução-mãe.
    Nota: Depois de pó de LPS é liquefeito, num Vortex duro pode causar bolhas. Evite fazer bolhas para minimizar a perda ao fazer alíquotas em tubos de 1,5 mL.
  4. Armazenar a solução estoque de LPS −20 ° C e diluí-la em uma solução de LPS de 1 mg/mL para injeção.
  5. Injecte a solução de LPS de 1 mg/mL (20 mg/kg) no peritônio de um mouse não-anestesiados utilizando uma seringa de 1 mL. Para o animal de controle, injete o mesmo volume de PBS.
  6. Espere por 2h para resposta inflamatória suficiente.

3. preparação do Texas-vermelho Dextran para manchar os vasos sanguíneos

  1. Prepare dois tubos cônicos de 15 mL e 10 mL de PBS estéril.
  2. Diluir o pó vermelho Texas-dextrano (25mg) em 3 mL de PBS e misture bem. Transfira a mistura para um tubo cônico de 15 mL vazio.
  3. Transfira a restante PBS (7 mL) para o tubo cônico de 15 mL, contendo a mistura de dextrano (3 mL).
  4. Conecte a ponta de uma seringa de 10 mL, um filtro de seringa de 0,45 µm. O filtro de seringa deve substituir a agulha.
  5. Filtre a mistura de dextrano (10 mL). Pressione a seringa uniformemente para evitar derramamento.
  6. Dispense a 500 µ l da solução de dextran 2,5 mg/mL no tubo de 1,5 mL de luz-bloqueada e armazená-lo no −20 ° C. Uma vez descongelado, armazená-lo em 4° C.

4. processo cirúrgico

  1. Desinfecte a mesa de cirurgia e todos os instrumentos, usando álcool a 70% antes da cirurgia. Em seguida, definir as ferramentas para a cirurgia de fígado e ajuste a placa de aquecimento a 37 ° C (Figura 2A, B).
  2. Para anestesia, intraperitonealmente Injete os ratos com 30 mg/kg de tiletamina/eficiente e 10 mg/kg de xilazina. Essas soluções podem ser misturadas e diluídas em PBS para injeção simultânea. Confirme anesthetization pressionando suavemente o dedo do mouse.  Prosseguir a próxima etapa quando não há nenhum reflexo.
  3. Aplique pequena quantidade de pomada para evitar o ressecamento da retina do rato.
  4. Remova os pelos do corpo ao redor da área do abdômen usando creme depilatório (Figura 2).
  5. Injete 200 µ l de solução de Dextran Texas-vermelho (concentração de 2,5 mg/mL) através da veia da cauda ou retrô-orbital injeção usando uma seringa de insulina (Figura 2D).
  6. Marque a área subcostal direita com um marcador. A linha deve ser desenhada a partir do processo xifoide até o fim da costela. Corte a epiderme com pinças e tesouras (Figura 2E, F).
  7. Abrir a cavidade abdominal usando microtesoura e pinça e expor o fígado com cuidado. O lobo lateral esquerdo deve ser desenrolado usando cotonetes de algodão (Figura 2, H).
  8. Despeje 500 µ l de PBS estéril na cavidade abdominal para evitar o ressecamento do fígado.
  9. Coloque o mouse na posição de decúbito-direito numa câmara personalizados e aplique uma pequena quantidade de cola de tecido para a cama de silício. Cuidadosamente, anexe o fígado usando cotonetes de algodão (Figura 2I).
    Nota: Porque o tecido do fígado é extremamente friável, não mecanicamente puxe para fora o fígado. Delicadamente ensaiando com cotonetes de algodão.
  10. Poucos segundos depois, molhe o fígado novamente com 500 µ l de PBS estéril para evitar a secagem fora do fígado. Coloque a armação metálica sobre o fígado e fixe-a firmemente com nozes (Figura 2J).

5. intravital imagem latente do fígado com microscopia de dois fotões

  1. Executar o software ZEN (Carl Zeiss) para ligar o laser, definir o comprimento de onda de 880 nm e o conjunto verde e canais de vermelhos. Ajuste a potência do laser de acordo com a intensidade de fluorescência (Figura 3A). Informações de filtro de emissão são a seguinte: verde/Alexa488, 500-550 nm e vermelho/Alexa 555, 575-610 nm.
  2. Coloque a câmara no palco da imagem latente e o 20 X lente objetiva de imersão de água próximo a tampa de vidro.
  3. Conserte o aquecedor de borracha de silicone sob o corpo do mouse para manter a sua temperatura de corpo (Figura 3B).
  4. Largue a 500 µ l de água destilada no frame do metal e puxe a lente objetiva perto do fígado (Figura 3).
  5. Ajuste o foco e determinar a profundidade e a altura da área de imagem.
  6. Imagem de conduta.
  7. Para a imagem latente a longo prazo, injete metade da dose de mistura tiletamina/eficiente e xilazina cada hora durante a imagem latente. É essencial manter a temperatura do corpo dos ratos a 37 ° C durante esta etapa. Sempre ficar de olho para o mouse, desde o tempo de anesthetization difere de cada rato.
    Nota: Este método não é adequado para recuperação após a cirurgia e a imagem latente. Eticamente, sacrificamos o mouse imediatamente após a cirurgia.
  8. Verificar os reflexos de pedal para cada 30 min para anesthetization estável.

6. análise de dados

  1. Abra o software de análise de dados Volocity e importar os dados brutos na biblioteca para o software.
  2. Remova o ruído da imagem de acordo com a situação e tirar um instantâneo.
    Nota: Para obter suavizar imagens, use o filtro 'Fino' ou 'Mediana'. Além disso, use o recurso de 'Melhoramento' para fazer imagens borradas ou escuras mais claras.
  3. Ajuste os itens editados para 100% e a exportação como arquivos JPEG ou TIFF para imagens de instantâneo e AVI para filmes.

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Resultados

Foi criada uma câmara de imagens simples e muito estável. Parte inferior da câmara estava coberta com silicone, que impediu a escorregar do rato corpo e órgãos. Além disso, porque o silício tem a quantidade adequada de elasticidade, poderia impedir esperado danos induzidos pela pressão do slide tampa (figura 1A, C). Segunda, tecido-cofre cola (sulfite de Vet) foi aplicada a fim reparar o fígado extraído na cama do silicone em forma de círculo...

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Discussão

O fígado tem sido ativamente estudado por muitos grupos3,10, devido à importância da sua função. Por exemplo, Heymann et al sugeriram um método delicado usando agarose. Embora esse método foi encontrado para ser altamente precisos, a configuração de agarose leva tempo. Todavia, com nossa metodologia, todos os procedimentos podem ser efectuados dentro de 30 min, minimizando outros fatores de confundimento. Em segundo lugar, estabilizar o fígado é extremamente impo...

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Divulgações

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Agradecimentos

Este estudo foi suportado por um fundo de nacional pesquisa Fundação de Coreia (NRF) financiado pelo governo da Coreia (MSIP; concessão n. º 2016R1A2B4008199, Y-m. H.) e o Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (número de concessão: HI14C1324).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Câmara projetada para instrumentosde célulaTamanho personalizado
Slide de tampa de metalInstrumentosTamanho personalizado
Vidro de coberturaEletrônica Microscopia Sciences#72204-03
Sylgard 184 Kit de elastômero de siliconeDow Corning
Frasco ErlenmeyerDURAN21 216 36
Placa de cultura celular (tipo plano)HYUNDAI Micro Co.H31006
DessecadorADARSH55204
High Q BOND SE 5 mLBJM LABPara fazer barragem semi-permanente
Aquecedores flexíveis de borracha de siliconeOmegaSRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
Fonte de alimentação DCToyotechDP30-03A
Solução salina
tamponada com fosfatoLipopolissacarídeos (LPS) de Salmonella enteria sorotipo enteritidisSigma-AldrichL6011
Texas Red DextranThermo Fisher ScientificD1830
15 mL Tubo cônico de polipropileno
de alta clareza		FALCON14-959-49B
0,45 μ filtro m (filtro de seringa Minisart)Sartorius16555k
1,5 ml Micro Tubo, âmbarAxygenMCT-150-XPara seringa de bloqueio de luz
1 mLVacina da CoréiaKV-S01
Seringa de 3 mLVacina da CoréiaKV-S03
Seringa de 10 mLVacina da CoréiaKV-S10
Seringa de insulina de 0,3 mLBecton Dickinson324900
Creme de depilação 100 mLBody natur
CotoneteABDI
Zoletil 50 5 mLVirbac
Rompun 10 mLBayer
Placa de aquecimentoInstrumentos de célula vivaPH-S-10Controlador DC de tamanho personalizado
Instrumentosde célula viva-301
Microdissecação TesouraHarvard Apparatus72-5418
TesouraRobozRS-5882
FórcepsRobozRS-5137
Vet bond3M1469SB
ZEN software (Black Edition)Carl Zeisspara LSM 7 MP
LSM 7 MPCarl Zeiss
Programa de Análise VolocityPerkinElmer
viva de célula viva de Programa

Referências

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
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  4. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
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