Artigo de método

Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

DOI:

10.3791/57194

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19 de maio de 2018

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo aqui apresentado descreve uma plataforma para a identificação de moléculas pequenas para o tratamento de doença hepática. Apresenta-se uma descrição passo a passo detalhando como diferenciar iPSCs em células com características de hepatócitos em placas de 96 poços, para usar as células para a tela para pequenas moléculas com potencial atividade terapêutica.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A capacidade de diferenciar as células-tronco humanas pluripotentes induzidas (iPSCs) em hepatócitos células (HLCs) oferece novas oportunidades para estudar erros inatos do metabolismo hepático. No entanto, para fornecer uma plataforma que ofereça suporte a identificação de pequenas moléculas que potencialmente pode ser usado para tratar a doença do fígado, o procedimento requer um formato de cultura que é compatível com milhares de compostos de triagem. Aqui, descrevemos um protocolo utilizando as condições de cultura completamente definidos, que permitem a diferenciação pode ser reproduzida de iPSCs humana de hepatócitos células em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Nós também fornecemos um exemplo de uso da plataforma para compostos de tela para a sua capacidade para reduzir a apolipoproteína B (APOB) produzido a partir de hepatócitos iPSC-derivados gerados a partir de um paciente de hipercolesterolemia familiar. A disponibilidade de uma plataforma que é compatível com a descoberta de medicamentos deve permitir que os investigadores a identificar novas terapêuticas para doenças que afetam o fígado.

Introdução

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Sucesso na identificação de drogas que podem ser usadas para uma doença rara de destino baseia-se no desenvolvimento de ensaios que podem ser usados para a seleção. Hipótese ou telas no destino (farmacologia inversa) são úteis, mas exigem um conhecimento detalhado da base molecular da doença. Telas fenotípicas (farmacologia clássica) evitam a necessidade de uma compreensão detalhada das vias bioquímicas, mas em vez disso, contam com o desenvolvimento de modelos que espelham com precisão a fisiopatologia da doença. Apesar do entusiasmo para abordagens baseadas em alvo, análises do FDA aprovado primeiro na sua classe de drogas revelam que telas fenotípicas foram muito mais bem sucedido1. O objectivo geral deste método é estabelecer uma plataforma para alto throughput screening que pode ser usado para identificar moléculas pequenas para o tratamento da doença hepática metabólica. Vários modelos de em vitro têm sido descritos incluindo primários hepatócitos, células de hepatoma e de células progenitoras fígado2. No entanto, a maioria destes modelos têm limitações, e há uma necessidade de novos modelos com precisão pode recapitular a fisiopatologia das deficiências hepáticas metabólicas na cultura. Recentemente, as células-tronco pluripotentes humanas combinadas com a edição de gene ter oferecido uma oportunidade para modelar até os mais raros de doenças raras em cultura sem a necessidade de acesso pacientes diretamente3. Enquanto o uso de iPSCs paciente específico como uma ferramenta para descobrir pequenas moléculas para o tratamento de doenças raras do fígado é conceitualmente razoável, existem apenas alguns relatórios demonstrando a viabilidade desta abordagem4. No entanto, nós temos estabelecido recentemente uma plataforma que costumava iPSC-derivado de hepatócitos com sucesso identificar drogas que podem ser realocadas para o tratamento das deficiências no metabolismo do fígado5.

Este protocolo explica o processo de diferenciação humana iPSCs para hepatócitos células em placas de 96 poços e usá-los para selecionar uma biblioteca de pequenas moléculas. Ele também descreve a análise de ponto de extremidade usando hipercolesterolemia como um exemplo de doença hepática metabólica. Esta abordagem deve ser útil para estudar o papel e a aplicação de pequenas moléculas no contexto de doenças infecciosas do fígado, doença hepática metabólica, toxicidade de drogas e outros distúrbios hepáticos.

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Protocolo

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1. cultura de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

  1. Revestimento recombinante humano E-caderina Fc proteína da fusão (E-cad-Fc) ou outras matrizes apropriados para cultura hPSC 6
    1. Dilua E-cad-Fc a 15 μg/mL com Phosphate-Buffered salina de Dulbecco contendo cálcio e magnésio (DPBS (+)).
    2. Casaco pratos de cultura de tecidos de suspensão de 100 mm com 5 mL de diluídos E-cad-Fc e incubar a 37 ˚ c pelo menos 1 h. substrato de remover e substituir com 5 mL de meio (por exemplo, mTeSR1 conhecido como M-médio doravante)7.
      Nota: O meio de cultura utilizado neste protocolo é preparado seguindo protocolos publicados7. No entanto, várias outras preparações de mídia têm sido descritas, ou estão disponíveis comercialmente, que são provável compatível com o procedimento.
    3. Recupere um frasco de iPSCs criopreservado de nitrogênio líquido. Descongelar em 37 ˚ c até um cristal de gelo pequeno permanece. Delicadamente, pipete células para um tubo cônico de 15 mL estéril contendo 4 mL do meio-de-M.
    4. Centrifugar a 300 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e gentilmente re-suspender as células com 5 mL do meio suplementado com 10 µM de Y-27632, um inibidor seletivo de Rho-associado, coiled-coil contendo proteína quinase (ROCK).
    5. Remova o M-médio da etapa 1.1.2 e transferir 5ml de células da etapa 1.1.4 para pratos de cultura de tecidos E-cad-Fc-revestido-100mm suspensão.
  2. Manutenção de iPSCs humano na cultura
    1. Uma vez iPSCs chegar em torno de 80% confluência, remover o meio de cultura e lave uma vez com cálcio e magnésio livre DPBS (-). Aspirar o DPBS (-) e adicionar uma quantidade suficiente de solução de EDTA 0,02% para cobrir as placas e, em seguida, incubar por até 3 min. à temperatura ambiente.
      Nota: Na confluência de 80%, a placa deve conter em torno de 2 x 107 células. É importante não para overgrow as células e para garantir que as células retêm uma morfologia indiferenciada. A pluripotência das células pode ser determinada pela coloração com marcador de células-tronco Tra-1-60 ou equivalente8.
    2. Quando as células começam a liberar, a remoção da solução de EDTA 0,02% e inundar o prato com 10 mL do meio-M a liberar as células. Ajuda o desprendimento de iPSCs pipetando suavemente.
      Nota: O tempo de incubação médio de células desanexar é em torno de 3 min, mas isso precisa ser determinada empiricamente, para cada linha de iPSC. As células devem ser lançadas como pequenos grupos contendo em torno de 5-10 iPSCs por cluster.
    3. Transferi 1/10 das células suspensas por fresca prato de cultura de tecidos suspensão de E-cad-Fc de revestido 100 mm, contendo 5 mL do meio-de-M. Incubar as culturas a 37 ˚ c abaixo dos 4% O25% CO2 e meio de mudança diariamente.
      Nota: Embora iPSCs rotineiramente são cultivadas em condições fisiológicas de oxigênio para promover a pluripotência, iPSCs também podem ser cultivadas usando oxigênio ambiente.

2. diferenciação de iPSCs humana de hepatócitos células em placas de 96 poços

Nota: Esta seção descreve a diferenciação das iPSCs em um formato que é compatível com o rastreio. Usando essa abordagem, é possível induzir iPSCs humana para diferenciar e formar células hepatócito em 20 dias. Enquanto isto é adequado para a maioria dos ensaios, o comprimento da cultura pode ser estendido para melhorar a maturidade das células.

  1. Revestimento de placas de cultura de tecidos de 96 poços com matriz de membrana basal de fator de crescimento reduzido
    1. Prepare o estoque diluindo a matriz a 2 mg/mL com gelada meio de cultura de tecido DMEM/F12 estéril. Dividir a matriz em 250 alíquotas μL e armazenar no-80 ˚ c Membros até necessária. Fica frio 10 mL de DMEM/F12 no gelo por 30 min. recuperar um 250 μL parte alíquota do estoque de matriz de 2 mg/mL e degelo no gelo.
    2. Combine a matriz com 10 mL de DMEM/F12 frio, misturando delicadamente com uma pipeta previamente refrigerada tornar-se uma concentração final de 0,05 mg/mL.
    3. Transferi 100 μL de matriz diluído a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Incubar a 37 ˚ c, 4% O25% CO2 pelo menos 1 h. elimine a matriz e substitua com 50 μL de M-médio por bem. Armazenar a 37 ° C, 4% O25% CO2 até que seja necessário.
  2. Células de placa para diferenciação
    1. Cultura de iPSCs em placas de 100-mm até as células aproximam confluência de 80%. Certifique-se de que o prato contém cerca de 2 x 107 células. Determine o número de células por célula citômetro de fluxo ou hemocytometer.
      Nota: Com a experiência, a qualidade das células iPSCs pode ser julgada por microscopia; no entanto, cerca de 98% das células deve expressar pluripotência marcadores como o epítopo TRA-1-60, quando medido pela FACS ou immunostaining. É importante que as células permanecem ativamente dividindo e não estão abandonadas.
    2. Para colher as iPSCs de cada prato 100mm, Aspire o meio de cultura e enxágue com 5 mL de DPBS (-). Substituir o enxágue com 3 mL de solução de desprendimento de células (por exemplo, accutase) e incube por cerca de 2 min a 37 ° C, 4% O25% CO2.
      Nota: É importante seguir o desprendimento das células por microscopia. Fazer não digerir com accutase. O objetivo é liberar as células como pequenos grupos com tratamento mínimo.
    3. Quando as células começam a desanexar, colheita, adicionando 7 mL do meio de M. Pipetar várias vezes para dissociar as colônias de células em pequenos grupos de ao redor 3-6 células (figura 1A).
    4. Colete as iPSCs em um tubo de centrífuga estéril 15 mL e centrifugar a 300 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 5 mL M-médio.
    5. Distribua uniformemente as células em placas de 96 poços revestidos matriz por pipetagem 50 μL de células de suspensão para cada poço. Para configurar cada placa de 96 poços, use uma placa de 100-mm de iPSCs com células em aproximadamente 80% confluência que contém em torno de 5 x 106 células para configurar a diferenciação. Use uma pipeta multicanal para acelerar este processo. Cultura das células durante a noite em 37 ˚ c, 4% O25% CO2.
      Nota: É importante que um número igual de células é depositado em cada poço para garantir diferenciações podem ser reproduzidas.
  3. Induzir a diferenciação das células
    1. Examine as placas de 96 poços por microscopia para garantir que as células cobrem pelo menos 70% da superfície de cada bem. Se a cobertura é inferior a 70%, substitua o meio meio fresco e incubar por um adicional 24h em 37 ˚ c, 4% O25% CO2.
      Nota: Incubar as células para mais de 48 h após chapeamento sem induzir a diferenciação comumente reduz a eficiência de diferenciação. Diferenciação também ocorrerá usando oxigênio ambiente, embora a eficiência pode ser afetado.
    2. Para o dia 1 a dia 2 de diferenciação, substitua o meio de cultura RPMI suplementado com 2% B27 (sem insulina), 100 ng/mL Activin A 10 ng/mL BMP4 e 20 ng/mL FGF2. Adicionar 100 μL de médio por bem e incubar a 37 ˚ c, em ambiente O25% CO2 com uma mudança diária média para 2 dias.
      Nota: Lidar com grandes números de placas de 96 poços requerem o uso de uma pipeta assistida ou robô. pipetas de 12 canais e 96 canais são ideais para mudança de média diária.
    3. Por dia 3 a 5 dias de diferenciação, a substituir o meio de cultura com RPMI suplementado com 2% B27 (sem insulina) e 100 ng/mL Activin A. Culture células em 37 ˚ c, em ambiente O25% CO2 com mudança média diária por 3 dias.
    4. No dia de diferenciação 5, antes de substituir com meio de cultura fresco, tratar cada bem com solução EDTA 100 μL 0,02% por 30 s, em seguida, remover e substituir com meio de cultura fresco.
      Nota: Se a diferenciação a endoderme é eficiente, a monocamada de diferenciar células é propensa a casca da placa. Um breve tratamento com solução de EDTA 0,02% ajuda a aliviar o desprendimento de células. Este tratamento não afeta a diferenciação de hepatócitos.
    5. Para a diferenciação entre os dias 6 a 10, substitua o meio de cultura com RPMI / 2% B27 (com insulina) suplementado com 20 ng/mL BMP4 e 10 ng/mL FGF2 e incubar a 37 ˚ c, 4% O25% de CO2 por 5 dias com mudança de média diária. Nesta fase induz células de se diferenciar em células progenitoras hepática.
    6. Para a diferenciação entre os dias 11 a 15, substitua o meio de cultura com RPMI / 2% B27 (com insulina) suplementado com 20 ng/mL HGF. Incube a 37 ˚ c, 4% O25% de CO2 por 5 dias com mudança de média diária.
    7. Para a diferenciação entre os dias 16 a 20, substitua o meio de cultura com um meio de cultura de células do hepatócito (HCM) suplementado com 20 ng/mL de Oncostatin M (OSM). Incube as celulas em 37 ˚ c, em ambiente O25% CO2 com mudança média diária por 5 dias.
      Nota: Reprodutibilidade da diferenciação entre poços individuais com eficiência pode ser determinada medindo-se o nível relativo de albumina, AFP ou APOB secretada para o meio por ELISA (ver 3.2).

3. pequena molécula triagem

Nota: A seguir descreve o procedimento usado para identificar compostos que podem ser usados para diminuir o nível de APOB no meio dos hepatócitos células derivadas de iPSCs hipercolesterolemia familiar. Uma descrição do modelo e seu uso na identificação de drogas para reduzir o colesterol tem sido descrita em detalhe anteriormente5,9. No exemplo atual, 1.000 compostos da biblioteca de coleção de compostos de Carolina do Sul (SC3) foram projectados. Cada composto foi testado em uma concentração de 2 μg/mL.

  1. Tratamento de iPSC - derivada de hepatócitos com pequenas moléculas
    1. Dilua a mestre biblioteca composta para gerar placas de ações de trabalho com compostos em uma concentração de 20 μg/mL em 2% DMSO e loja-20 ˚ c.
    2. Prepare-se bastante placas de 96 poços de iPSC-derivado de hepatócitos para permitir que cada composto a ser testado.
      Nota: O número de compostos será projectado irá ditar o número de placas de 96 poços que são necessárias. Em geral, um único bem deve estar preparado para cada composto, além de adicionais poços para qualquer controle de amostras. Os poços ultraperiféricas da placa geralmente são evitados para reduzir a possibilidade de efeitos de borda que pode corromper a interpretação. Correspondências podem ser identificadas usando o método de pontuação z sem a necessidade de usar repetições. Se réplicas estão incluídas, é mais apropriado usar o teste t.
    3. Após a conclusão da diferenciação (ver 20, do dia 2.3.7), substituir o meio de cultura com 100 μL de HCM frescosuplementado com 20 ng/mL de Oncostatin M. Incubar a 37 ˚ c, 4% O25% CO2 para exatamente 24 h. recupere o meio de cultura para uma nova placa de 96 poços e loja-20 ˚ c. Use esse exemplo para calcular o nível de APOB no meio antes da adição de drogas.
    4. Adicione 90 μL do HCM fresco suplementado com 20 ng/mL de Oncostatin M em cada poço. Adicione 10 μL de cada composto do estoque trabalho após a mistura por pipetagem. Adicionar DMSO para 0,2% para controlar os poços para coincidir com a concentração final nas amostras tratadas e incubar a 37 ˚ c, ambiente O25% CO2 para exatamente 24 h. recolher o meio de cultura e armazenar a-20 ˚ c. Use esse exemplo para determinar o nível de APOB após o tratamento com compostos.
    5. Opcional - as células restantes podem ser processadas por imunocoloração, viabilidade celular ou análises dos níveis de mRNA usando abordagens padrão.
      Nota: Esta tela foi projetada para identificar drogas que tinham um efeito rápido em níveis APOB. No entanto, dependendo do modelo de doença, ensaios a jusante ou mecanismo de ação de drogas, pode ser benéfico tratar a amostra por vários dias.
  2. Determinar os níveis APOB por ELISA
    1. Determine a concentração da apolipoproteína B (APOB) ambos pré e pós-drogas tratadas das amostras de usando um kit de desenvolvimento humano APOB ELISA seguindo o protocolo do fabricante.
    2. Preparando as seguintes soluções
      1. Tampão de lavagem, composto de 0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,4. Armazene a 4 ˚ c até o uso.
      2. Tampão de incubação, composto de 0,05% Tween 20 e 0,1% albumina de soro bovino (BSA) em PBS, pH 7,4. Armazene a 4 ˚ c até o uso.
    3. Prepare o anticorpo APOB (mAB 20/17) diluindo a 2 µ g/mL de PBS, pH 7,4. Adicionar 100 μL do anticorpo diluído por bem e incubar a 4 ˚ c durante a noite.
    4. Retire o anticorpo as chapas de ensaio e lave cada uma bem duas vezes com 200 µ l de PBS, pH 7,4.
    5. Adicionar 200 μL/poço de 0,05% Tween 20, 0,1% albumina de soro bovino (BSA) em PBS, pH 7,4 e incubá-los em uma plataforma de agitação por 1h à temperatura ambiente.
    6. Preparar uma curva padrão de 8 pontos usando 0,05% Tween 20 e 0,1% BSA em PBS, pH 7,4, com as seguintes concentrações de APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL e 50 ng/mL.
    7. Dilua as amostras de teste 1:4 com 0,05% de Tween 20 e 0,1% BSA em PBS, pH 7,4.
    8. Após 1 h de bloqueio com tampão de incubação, descartar o buffer e lave as placas de ensaio cinco vezes com 200 μL de 0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,4.
    9. Completamente remover qualquer tampão de lavagem residual e transferir 90 μL das amostras diluídas e os padrões APOB para as placas de ensaio. Incube a temperatura ambiente em um agitador por 1h.
    10. Descartar a amostra e lavar com 200 μL 0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,4 por bem. Repita as lavagens um total de 5 vezes. Adicione 100 μL por poço de mAB LDL 11-biotina 1:1,000 diluído em 0,05% Tween 20 e 0,1% BSA em PBS, pH 7,4. Incube a temperatura ambiente em uma plataforma de agitação por 1h.
    11. Descartar o reagente e lave com 200 μL por bem buffer de lavar 5 vezes. Adicionar 100 μL por poço de anticorpo Streptavidin HRP (1:1, 000 diluição usando buffer de incubação), então incubar a temperatura ambiente em uma plataforma de agitação por 1h.
    12. Descartar o reagente e lave com 200 μL 0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,4 por bem. Repita as lavagens um total de 5 vezes. Completamente Retire o tampão de lavagem residual as chapas de ensaio adicionar 100 μL por poço da solução de substrato Tetramethylbenzidin (TMB) e incubar a temperatura ambiente por 8 min.
    13. Sem retirar o substrato TMB, diretamente Adicione 100 μL por poço da solução de paragem (1N HCl).
    14. Determinar a absorvância a 450 nm, utilizando um leitor de placa.
    15. Uma curva padrão pode ser estabelecida, usando o método de regressão logística de quatro parâmetro e, em seguida, usado para definir a concentração de APOB em cada amostra10.
    16. Examinar a pre-droga: pós-droga proporção de APOB em cada amostra para identificar compostos com potencial para diminuir a APOB níveis no meio.

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Resultados

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Geração de hepatócito - como células: A Figura 1 descreve a cronograma das mudanças que ocorrem durante a diferenciação das iPSCs humano para hepatócitos células. A cultura de iPSCs em E-Cad-Fc fornece aproximadamente 2mm colônias de diâmetro que expressam o marcador pluripotentes OCT4 (figura 1A-B). A morfologia das células cultivadas em uma matriz de E-caderina...

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Discussão

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Alvo baseado descoberta de drogas, onde as moléculas pequenas são identificadas que influenciam a atividade de uma proteína específica, tem sido o foco de muitos esforços de rastreio existentes. Embora essa abordagem forneceu inúmeros produtos farmacêuticos, telas com base em reverter um fenótipo, farmacologia clássica, têm sido mais bem sucedidos na identificação de compostos de primeira classe que foram clinicamente eficaz1. Uma desvantagem para descoberta de drogas fenotípica é que ele depende ...

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Divulgações

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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 e HG006398 de S.A.D.). Gostaríamos de agradecer o Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop e Jing Ran pelas suas contribuições.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de cultura de tecidos estéreis de 100 mm x 20 mm PlacasCorning 430167
100 mm x 20 mmde tecidos deCorning
 Corning3595
Anti-humano AlbuminaDakoA 0001
Anti-humano FOXA2 (6C12)Novus BiológicoH00003170-M12
Anti-humano HNF4 alfaSanta CruzSC-6556
Anti-humano Oct-3/4 anticorpoSanta CruzSC-9081
Anti-humano SOX17R & DAF1924
Anti-humano TRA-1-60 FITC conjugadoMilliporeFCMAB115F
Activin A Proteína Humana Recombinante InvitrogenPHC9563
Suplemento B-27, menos insulina Invitrogen0050129SA
B-27 Suplemento, sem soro Invitrogen17504044
BMP4 Proteína Humana Recombinante de Células PHC9533Invitrogen
StemPro  Accutase InvitrogenA1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Feasibility Assay Promega7572
DPBS+(cálcio, magnésio)Invitrogen14040-133
DPBS-(sem cálcio, sem magnésio)Invitrogen14190-144
DMEM/F-12, HEPES deAPOB 11330057
Mabtech3715-1H-20
Fator de Crescimento de Fibroblastos 2 (FGF2)InvitrogenPHG0023
Meio de Cultura de Hepatócitos (HCM Bullet Kit) LonzaCC-3198
(HGF)InvitrogenPHC0321
L-GlutaminaInvitrogen25030081
MEMInvitrogen 11140076
Oncostatina M (OSM) Proteína Humana Recombinante InvitrogenPHC5015
Penicilina-Estreptomicina Invitrogen15140163
Meio de células-tronco pluripotentes livre de alimentador: mTesR1 STEMCELL technologies5850
Matriz de Membrana de Basement de Fator de Crescimento Reduzido InvitrogenA1413301
RPMI 1640 Médio, HEPES Invitrogen22400105
StemAdhere Matriz Definida para hPSC (E-cad-FC)Primorigen BiosciencesS2071
TMB-ELISA Solução de SubstratoThermo Scientific 34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugadoMilliporeFCMAB115F
Versene (EDTA) 0,02% Lonza17-711E
Y-27632 inibidor de ROCKSTEMCELL Technologies72302
de cultura de suspensão estéril Placa de cultura 96 poços 430591 Reagente de Dissociação Kit desenvolvimento de ELISA humano InvitrogenFator de Crescimento de Hepatócitos Solução de Aminoácidos Não Essenciais

Referências

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