Quantificação de Estoicometria de Acetilação e Succinilação de Lisinas Proteicas em Sítios Específicos Usando Espectrometria de Massa de Aquisição de Dados Independente

Resumo

Aqui, apresentamos a quantificação imparcial de ocupação acetilação e/ou succinylation proteína site-specific (estequiometria) de um proteome inteira através de uma análise ratiometric de modificações endógenas às modificações introduzidas após quantitativa química acilação usando anidridos rotulado de isótopo estáveis. Em combinação com a espectrometria de massa sensível aquisição de dados independente, obtêm-se medições de ocupação do local exato.

Resumo

Modificação pós-traducional (PTM) de resíduos de lisina da proteína por N._Ɛ- acilação induz mudanças estruturais que dinamicamente podem regular funções de proteínas, por exemplo, alterando a atividade enzimática ou por mediação de interações. Quantificação precisa de ocupação de acilação de proteínas específicas do local, ou estequiometria, é essencial para compreender as consequências funcionais de estequiometria de baixo nível global e individual de alto nível acilação estequiometria da lisina específica resíduos. Outros grupos relataram medição de estequiometria de acetilação de lisina, comparando a proporção de isótopos de peptídeo precursor de acilação abundância endógenos, naturais e exógena, pesada isótopo-rotulado acilação introduzido após quantitativa química acetilação de proteínas usando estável isótopo-rotulado anidrido acético. Este protocolo descreve uma abordagem otimizada, apresentando várias melhorias, incluindo: (1) aumento da eficiência de acilação químicos, (2) a capacidade de medir a proteína succinylation além de acetilação e (3) melhorou a precisão quantitativa devido a interferências reduzidas usando quantificação de íon fragmento de aquisições de dados independente (diâmetro) em vez de sinal de íon precursor de aquisição de dados dependentes (DDA). O uso das áreas de pico extraídos de íons do fragmento para quantificação também excepcionalmente permite a diferenciação de nível de site acilação estequiometria de proteolíticas peptídeos contendo mais de um resíduo de lisina, que não é possível usando o íon precursor sinais para quantificação. Visualização de dados na linha do horizonte, um ambiente de proteômica quantitativa de código aberto, permite a revisão e inspeção de dados conveniente. Juntos, esse fluxo de trabalho oferece quantificação imparcial, precisa e exata de ocupação de acetilação e succinylation site-specific lisina de um proteome inteira, que pode revelar e priorizar sites acilação biologicamente relevantes.

Introdução

N_Ɛ- acilação de resíduos de lisina da proteína é um importante regulador da função da proteína. Acetilação de lisina e outras acilações, como succinylation, malonylation e glutarylation, são pensadas para regular o metabolismo, sinalização celular e outros processos celulares^1,2,3,4 , e têm implicações em distúrbios metabólicos⁵. Numerosos estudos descobriram que as modificações de acila lisina sofrem grandes mudanças-dobra sob diferentes condições em tecidos de mamíferos e célula linhas^5,6,7,8 , bem como bactérias de^10,9,11, no entanto, estas mudanças de dobra relativa não fornecer insights sobre a proporção da proteína total modificada. Estudos relatando as medições de ocupação do sítio de acilação são^13,escassos^12,14, apesar da relevância e necessidade de tais estudos, pois eles fornecem mais detalhes que dobra relativa mudam. Por exemplo, uma mudança de 10 vezes poderia representar um aumento de ocupação do sítio de 0,01 a 0,1%, 1 a 10% ou mesmo 10 a 100%. Medições de estequiometria precisos são necessárias para interpretar o significado biológico de acilação e para prever o impacto sobre a magnitude da proteína estrutural e, possivelmente, alterações funcionais.

Um método anterior para quantificar a ocupação ambiental utiliza pesado isótopo estável química rotulagem de resíduos de lisina não modificado, seguidos por espectrometria de massa para medir a relação entre endógeno acetilação "luz" em comparação com o exógeno, quimicamente-rotulado "pesado" acetil-lisina usando precursor íon intensidades¹². Outro estudo recente por Zhou et al. ¹³ descreveu uma abordagem semelhante para avaliar a estequiometria de acetilação de lisina que também empregou uma acetilação química completa de todos os resíduos de lisina sem modificações em proteínas com isótopo estável de rotulagem, mas usado intensidades de íon fragmento medida pelo DDA. Nakayasu et al. ¹⁴ usado uma abordagem DDA semelhante, mas em vez disso usou a proporção de íons de imônio leves e pesados-acetil lisina para quantificação. Quantificação com base em íons de fragmento, íons imônio ou sequência (MS2), na maioria dos resultados de casos em menos interferências de sinal em relação ao processamento de íons de precursor do peptídeo intacto (MS1). No entanto, quantificação dos íons de fragmento de espectros de MS/MS gerado pelo DDA pode sofrer de deficiências de amostragem estocástica, onde os íons de alta abundância precursor são mais propensos a ser seleccionado para MS/MS e assim, levar a uma amostragem tendenciosa e incompleta de íons de precursor.

Este romance de fluxo de trabalho⁴ (Figura 1) conceitualmente usa um isótopo estável químico rotulagem abordagem desenvolvida originalmente por Baeza et al. ¹², no entanto o fluxo de trabalho é posteriormente juntamente com diâmetro para coletar os dois precursor e múltiplos abundâncias de íon fragmento sobre a massa detectável variam de^15,16 , fornecendo cálculos precisos de estequiometria.

Áreas de pico de fragmentam de íons que contêm o acilação de interesse local, ou 'diferenciando fragmento íons', são usadas para quantificar a ocupação de acilação ambiental (Figura 2). Íons de fragmento que não contêm a modificação têm valores idênticos leves e pesados m/z e são usados para identificação de peptídeo mas não para quantificação. Horizonte de software¹⁷ é usado para extrair áreas de pico precursor e fragmento. A presença de vários íons de fragmento que contém um site de determinado acilação fornece flexibilidade se interferências são detectadas em alguns dos íons de fragmento. Visualização de dados na linha do horizonte permite a inspeção crítica dos rácios de íon fragmento de luz-para-heavy. Além de análise de dados manual, um pacote de R de código-fonte aberto escrito em casa, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), foi desenvolvido, que usa os precursor íon e fragmento íon dados coletados através de diâmetro e quantifica site-specific acilação estequiometria de peptídeos contendo vários resíduos de lisina, um recurso não é possível com precursor de medições de intensidade de somente íon⁴.

Este protocolo também demonstra o uso de endoproteinase Glu-C, que é específico para a segmentação do C-terminal em resíduos glutâmico e ácido aspártico, em vez de usar a tripsina ou Arg-C protease, como o último muitas vezes gerar muito grande e potencialmente multiplicar acylated proteolíticas peptídeos resultantes da clivagem de tripsina bloqueados em acylated resíduos de lisina. O químico rotulagem procedimento também foi estendido para incluir a utilização de anidrido succínico (Figura 1), permitindo a quantificação de succinylation succinylation de estequiometria. Além de melhorias para a preparação da amostra, a implementação de fracionamento de peptídeo pelo pH off-line, básico, separação de fase reversa (bRP) de peptídeos mais diminuiu as interferências de quantificação, permitindo melhor de convolução da acilação estequiometria em amostras de proteome toda. Juntos, esse método apresenta e destaca várias vantagens: (1) aumento da eficiência de acilação química; (2) medição de estequiometria de succinylation de proteína além de acetilação; e (3) exatidão melhorada de quantificação. A quantificação de melhoria é devido à diminuição da interferências nos sinais de íon fragmento do diâmetro comparado ao sinal precursor DDA, bem como a implementação de pre-fracionamento peptídeo off-line pela bRP.

Protocolo

1. quantitativamente acetificam e/ou proteínas Succinylate usando isótopos-rotulados ácido acético ou anidrido succínico

1. Prepare-se 3 repetições de 100 µ g de amostra de proteína albumina de soro bovino (BSA) em paralelo, a uma concentração de 1 µ g / µ l (total de 100 µ l), utilizando a solução de bicarbonato (TEAB) trietilamônio e ureia (ureia 8 M, 200 mM TEAB, pH 8).
   Nota: É importante usar o buffer de amina livre. As amostras da proteína usadas aqui na seção de resultados representativos são BSA, quantitativamente succinylated BSA, e misturas respectivas render BSA amostras com ocupação de succinylation em 0%, 1%, 10%, 50% e 100%, respectivamente, (cada amostra será preparada em 3 repetições). Este protocolo também foi realizado utilizando proteína lysates de Escherichia coli e⁴de fígado de rato. O protocolo também pode ser aplicado a outras células ou tecidos lisados.
2. Reduza 100 µ l de amostra de BSA (100 µ g) com 8 µ l de 250mm ditiotreitol (DTT) para chegar a uma concentração final de 20 mM DTT e incubar a amostra a 37 ° C por 30 min com agitação a 1.400 rpm.
3. Alquilada a amostra reduzida de BSA com 21,6 µ l de 200 mM iodoacetamide para chegar a uma concentração final de iodoacetamide de 40 mM e incubar a amostra no escuro à temperatura ambiente por 30 min.
   Nota: É importante ter a concentração de iodoacetamide um pouco mais de 2x da concentração de TDT para garantir que tudo reduzido tióis de proteína são alquilados.
4. Prosseguir com a preparação ou anidrido acético -d₆ (passo 1.4.1) ou succínico anidrido -d₄ (etapa 1.4.2) necessários para química acetilação (quantitativa) ou succinylation das amostras.
   1. Determine a molaridade (M) da alíquota 1 g de anidrido acético aquoso -d₆ solução do peso molecular (108.13 g/mol) e densidade (1,143 g/mL a 25 ° C).
      Nota: O pacote de 1g contém 9.248 µmol de anidrido acético -d₆ em 875 volume µ l, produzindo uma solução de 10,57 M usada para por acetilação das amostras.
   2. Prepare uma solução de 5 M de succínico anidrido -d₄ dissolvendo o pó em DMSO anidro imediatamente antes da reação para evitar a hidrólise do reagente. Dissolva 0,24 g de succínico anidrido -d₄ em 461 µ l de DMSO anidro para obter uma solução de 5 M.
5. Executar a acetilação de química quantitativa ou succinylation adicionando 60 µmol de anidrido acético -d₆ (6 µ l da solução de 10,57 M) ou - anidrido succínicod₄ (12 µ l da solução de 5 M), respectivamente e incubar a amostra a 4 ° C por 20 min no vortex.
   Nota: Devido à acidez de anidridos, podem precipitar proteínas. Tome nota e ajustar conforme descrito na etapa 1.6.
6. Adicione 10 µ l de 7,25 M NaOH após a incubação para aumentar o pH a ~ 8 para eliminar qualquer lado-produtos O-acilação. Vórtice brevemente e verificar o pH da amostra por manchar 1 µ l, no papel de pH.
   Nota: Pode ser necessário adicionar mais de 10 µ l de 7,25 M NaOH para atingir pH 8. Além disso, as proteínas potencialmente precipitadas devem re-dissolver.
7. Repita as etapas de ajuste por acilação e pH 1.5 e 1.6 para um total de três vezes. Verifique os valores de pH e anotar o volume da solução básica adicionado por repetição. Trabalho rapidamente durante a acima química acilação passos porque os anidridos vão hidrolisar e perder a reatividade.
8. Após a rotulagem reação e pH ajuste final, adicione 10 µ l de solução de hidroxilamina 50% para reverter O-acilação reações de lado.

2. Digest reagiu amostras da proteína usando Endoproteinase Glu-C

1. Diluir a concentração de ureia a 0,8 M usando 50mm TEAB, pH 8 e normalizar os volumes de amostra.
2. Digerir as amostras da proteína adicionando endoproteinase Glu-C em um 01:50 protease a proporção de proteína do substrato (p/p) e incubar as amostras durante a noite a 37 ° C com agitação a 1.400 rpm.
3. Acidificar e saciar as amostras de digestão da proteína pela adição de ácido fórmico a 1% em volume.
4. Do desalt as amostras usando equilíbrio hidrófilo lipofílico cartuchos de extração de fase sólida. Use um cartucho de adsorvente 30mg por material de amostra, máximo de 5 mg por cartucho^4,18.
   Nota: É importante manter o adsorvente dentro do cartucho molhado durante todo este processo do desalting. Quando necessário, desligue a bomba de vácuo para retardar a passagem do solvente ou a amostra através do cartucho.
   1. Introduza os cartuchos a porta (s) sobre o distribuidor de vácuo de bloco de vidro 24-port e ligue a bomba de vácuo. Deixe a porta (s) não utilizado tampado. Deixe uma ou duas portas un-tampado para manter a baixa pressão sobre o vacuômetro se necessário.
   2. Molhe cada cartucho duas vezes com 800 µ l de 80% acetonitrila (ACN)/0.2% fórmico acid/19.8% água. Certifique-se de solvente nível permanece de 2 a 3 mm acima do nível do adsorvente. Certifique-se do que vacuômetro no colector de lê 16,9 – 67,7 kPa (5-20 em Hg).
   3. Equilibrar cada cartucho três vezes com 800 µ l de ácido fórmico a 0,2% em água. Certifique-se do que vacuômetro no colector de lê 16,9 – 67,7 kPa (5-20 em Hg).
   4. Carrega amostras de peptídeo para o cartucho. Garantir o vacuômetro no colector de lê 6,77 – 8.47 kPa (2-2,5 em Hg), e a taxa de fluxo não deve exceder 1 mL/min.
   5. Lave cada cartucho três vezes com 800 µ l de ácido fórmico 0,2% em água. Certifique-se do que vacuômetro no colector de lê 16,9 – 67,7 kPa (5-20 em Hg).
   6. Remova o cartucho do tubo de vácuo e se estabelecem em um microtubo de 1,5 mL.
   7. Eluir peptídeos uma vez com 800 µ l de água de fórmico acid/19.8% 80% ACN/0.2% e permitir que o solvente incubar com adsorvente para 2-3 min.
   8. Use uma pipeta para empurrar solvente através da camada de adsorvente dentro do cartucho. Repita para a segunda eluição de 400 µ l 80% ACN/0.2% acid/19.8% fórmico água para o microtubo de 1,5 mL mesmo.
5. Seque o eluato por vácuo centrifugação (centrifugação de taxa fixada a 268 x g), normalmente durante 3 h.
   Nota: Se necessário, amostras de eluato secos podem ser armazenadas congelado a-20 ° C até que esteja pronto para prosseguir com o fracionamento.

3. fracionar Peptides usando off-line Basic-pH fase reversa HPLC

1. Ressuspender o por-acylated e amostras de Glu-C digerido (preparadas conforme descrito nas seções 1 e 2) em 200 µ l de tampão A (formiato de amônio 10 mM em água, pH 10), misturar a amostra durante 10 minutos no vortex a 4 ° C e centrifugar a 17.500 x g durante 10 minutos no quarto te mperature.
   Nota: A amostra resultante do peptídeo está pronta para estar offline fracionado por pH elevado separação^19,20.
2. Programa o método de fracionamento de HPLC off-line dependendo do instrumento e do software utilizado. O seguinte método é específico para um sistema de bomba HPLC binário incluindo um detector de duplo comprimento de onda UV, um mostruário, um coletor de fração e uma coluna C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm tamanho de partícula) que tolera pH 10.
3. Coletar 40 fracções para 2,1 min por fração e combinar cada fração quarta, resultando em quatro fracções em pool final⁴. Um maior número de fracções em pool pode ser usado para reduzir ainda mais a complexidade de amostra em detrimento do tempo de coleta de dados de espectrometria de massa.
4. Seque as frações em pool em um Liofilizador, re-suspender as amostras secas peptídeo em 1 mL de 50% ácido fórmico ACN e 1% em água e transferir para um recipiente de amostra menor. Seca a amostra transferida através de vácuo centrifugação (centrifugação de taxa fixada a 268 x g), normalmente durante 1 h.
   Nota: A baixa pressão de vapor de formiato de amônio pode dificultar a secagem completa. Se quantidades significativas de sal formiato de amônio permanecem como sal precipitado após a secagem, repita a extração em fase sólida.
5. Re-suspenda as amostras em 20 µ l de ácido fórmico a 0,2% em água com retenção indexado tempo (iRT) peptídeo mistura padrão.
   Nota: As amostras agora estão prontas para análise por espectrometria de massa.

4. diâmetro análise de amostras de peptídeo fraccionado

1. Analise as amostras usando um método de diâmetro LC-MS/MS, que pode ser ajustado de acordo com os instrumentos de espectrometria de massa disponíveis. A análise foi realizada através de um sistema HPLC 2D da nano-LC on-line, conectado ao espectrômetro de massa de (QqTOF) quadrupolo ortogonal de tempo--voo.
   1. Programa do software do instrumento para que as misturas do peptide são transferidas para um chip de pré-coluna C18 (200 µm x chip de 6mm C18-CL, 3 µm, 300 Å) e lave a 2 µ l/min por 10 minutos com o solvente de carregamento (₂de H O/0.1% ácido fórmico) para dessalinização.
   2. Separar os peptídeos cromatograficamente na ficha 75 µm x 15 cm C18-CL (3 µm, 300 Å) com um caudal de 300 nL/min com um h 2 usando gradiente típico (e LC-sistema específico) aquosa e solvente ACN amortecedores⁴.
   3. Gere um método de diâmetro variável janela, onde as janelas de massa faixa de largura variável (5 a 90 m/z) são passadas a partir do quadrupolo Q1 para a célula de colisão em passos incrementais na gama completa em massa (m/z 400-1.250).
      Nota: O tempo de ciclo de 3.2 s inclui um scan de íon precursor 250 ms seguido pelo tempo de acúmulo de ms 45 para cada um dos 64 SWATH segmentos^21,22.
2. Identificar peptídeos usando uma análise paralela de amostras pelo DDA MS e construção de bibliotecas espectrais, ou alternativamente, peptídeos podem ser identificados diretamente a partir de dados de diâmetro usando PIQED software²³, que lida com todas as medidas técnicas de processamento de dados, identificação e importação, na linha do horizonte para posterior quantificação.

5. Tutorial de análise de dados de exemplo

1. Baixar o software do Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) e criar uma conta de PanoramaWeb (https://panoramaweb.org).
   Nota: Para descrever o uso do horizonte com dados de tutoriais detalhados, consulte (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). Outros algoritmos de software podem ser usados para extrair as aquisições de diâmetro, tais como faixa aberta²⁴, SWATH 2.0 plugin em PeakView²⁵e Spectronaut²⁶áreas de pico íon fragmento leves e pesados.
   1. Baixe o arquivo de dados do Skyline para os resultados representativos succinylated BSA (Figura 3) do Panorama público: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. Na página Web da Panorama, ir para a mesa "Alvo MS Runs" e baixe o arquivo sky.zip, escolha o link DOWNLOAD do lado direito. Extrair a pasta. zip baixado e clique duas vezes no arquivo para abri-lo no horizonte de skyline.sky. Verifique o peptídeo fragmento íon árvore target (painel esquerdo) e os quatro cromatogramas de percentagens definidas de luz succinylation (painéis de direito).
   2. Selecione o menu "View", navegue até "áreas de pico | Replicação de comparação". O painel "Pico áreas – replicar comparação" contendo gráficos de barra aparecerá no lado direito da janela. No painel de zonas de pico, botão direito do mouse e selecione "transições | Single", que mostra a área do pico do íon fragmento para o íon fragmento selecionado. Finalmente, o painel de "Áreas de pico" botão direito do mouse e selecione "ordem | Documento".
   3. No painel de árvore de destino no lado esquerdo da janela, botão direito do mouse sobre o peptídeo "E.LCKVASLRE. T | Rácios de | Oneheavy", que calcula a proporção do íon luz sinal sobre sinal de íons pesados, leve/pesado.
      Nota: Esta não é a mesma proporção de estequiometria de ocupação local de Light/(Heavy+Light).
   4. Observe que a árvore de destino agora relata as relações L/H à direita dos íons fragmento de luz.
2. Determine os "diferenciação fragmento íons" que contêm o acilação de interesse local.
   Nota: Conforme mostrado na Figura 3, caracterizando este exemplo exato, os íons de diferenciação foram determinados como y₇ (maior classificada) e y₈, b₃, b₄. Observe que os íons de fragmento não-diferenciação mostram uma relação de 1 na árvore de destino.
   1. Na árvore de destino do painel esquerdo, sob o 588.30 + + subnó de peptídeo E.LCKVASLRE. T, clique sobre a y7 diferenciando íon fragmento
      K [y₇ ] – 902.49 + (rank1) [5]
      Observe a altura do pico crescente e área.
   2. Na árvore de destino do painel esquerdo, sob o 588.30 + + subnó de peptídeo E.LCKVASLRE. T, clique sobre o íon de fragmento não-diferenciação y₅ um [y₅ ] – 575.31 + (rank 6) [1]. Observe que as áreas de pico e cromatogramas de íon y₅ fragmento permanecem na mesma faixa para todas as amostras.
   3. No painel de árvore de destino, navegar através de outro diferenciando (proporção diferente de 1) e não-diferenciação (proporção de 1) fragmento íons e notar as mudanças e padrões na área de bar gráfico e cromatogramas de pico.
   4. Determinar as áreas de pico exata para os pares de leves e pesados dos íons diferenciadoras para calcularem a estequiometria (para obter detalhes adicionais também ver Meyer et al. ⁴). clique sobre o "modo de exibição | Grade do documento"e a grade do documento irão aparecer. No canto superior esquerdo da grade do documento, clique em "vistas | Transição de resultados"para ver uma tabela de várias coluna com informações de íon fragmento, como sequência do Peptide, Precursor mz, nome de replicar, etc.
   5. Altere o formato de relatório de "pivot" novamente clicando em "Views" na grade do documento e selecionar "Editar modo de exibição" para abrir a janela Personalizar exibição. No canto inferior esquerdo da janela "Personalizar modo de exibição", marque o "nome de replicar pivô" e selecione "Okey" para fechar a janela Personalizar exibição. Observe que agora a janela da tabela de "Documento grade: transição resultados" tem re-arranjadas agrupar o nome replicar, tempo de retenção, área, plano de fundo, colunas de pico Rank por replicam (1%, 10%, 50%, 100% succinylation).
   6. Para o peptide "E.LCKVASLRE. T"na tabela"Documento grade: resultado de transição", encontrar a coluna"Mz Precursor", a coluna"Íon fragmento"e coluna (1% succinylation) área de 1pct_light_sw1. Observe que existem íons dois precursor para este peptídeo, luz (Mz Precursor do 588.30 nas 8 primeiras linhas) e pesados (Mz Precursor de 590.32 nas últimas 8 linhas).
   7. Na coluna "Fragmento íon", encontre as duas linhas para o íon de fragmento de y8 correspondente a luz e os íons pesados precursor. Das mesmas linhas na coluna de área 1pct_light_sw1, grave as áreas e8 para a luz (15.820) e o pesado (1.426.461).
3. Usando esses valores de área do pico, calcular a estequiometria de succinylation, ou a proporção modificado, de acordo com a fórmula abaixo e obter um rácio de estequiometria de 0,01, ou succinylation de 1%, o que corresponde a proporção de luz succinylation neste definido mistura:
   
4. Calcule a relação de estequiometria para succinylation 10% usando os E8 diferenciação fragmento íon pico área valores da coluna de área de 10pct_light_sw1, 144.953 (luz) e 1.188.041 (pesado), para obter uma relação de 0,10, ou 10% succinylation.
5. Calcule a relação de estequiometria para succinylation de 100% usando os E8 diferenciação fragmento íon pico área valores da coluna de área de 100pct_light_sw1, 954.513 (luz) e 16.407 (pesado), para obter uma relação de 0,98, ou 98% succinylation.
6. Da mesma forma, calcule a relação de estequiometria para 1% succinylation usando os b3 diferenciação fragmento íon pico área valores da coluna de área de 1pct_light_sw1, 55.697 (luz) e 3.149.119 (pesado), para obter uma relação de 0,01, ou 1% succinylation.
7. Continuar os cálculos de proporção de estequiometria usando a fórmula para todos os íons diferenciação do fragmento, íons tanto y e b, para obter o succinylation de lisina estequiometria valores para misturas de succinylation de 1, 10, 50 e 100%.

Resultados

Após a aquisição de dados, diferenciando MS2 íons de fragmento foram determinadas dos peptídeos acylated proteolítica, cromatogramas posteriormente extraídos do íon (XIC) foram processadas no horizonte e a luz correspondente e áreas de pico pesados foram exportadas que foram Finalmente, usado para calcular a ocupação do local. Figura 2A mostra uma ilustração conceitual de como o precursor de iões XIC pode aparecer apresentando ambos os sinais de peptídeo leves e pesados, e Figura 2B apresenta um exemplo do fragmento correspondente íon XICs com codificação de cores (vermelho = luz; azul = pesado ) para diferenciar os íons de fragmento que contém as modificações de acilação de lisina.

A Figura 3 mostra os dados resultantes de uma experiência de ocupação, tais como o descrito acima analisar rácios pré-definido de succinylated leve/pesado BSA gerado internamente no 1, 10, 50, ou 100% e a determinação de ocupação succinylation respectivas. Importando dados de ocupação de diâmetro para Skyline permite fácil visualização da árvore de destino, exibindo sequências peptídicas e fragmento íons de íons de precursor de leves e pesados (Figura 3A). Dados do MS-diâmetro de cada rácio definido succinylated BSA immanently revelaram as diferenças relativas na proporção de luz-para-heavy y₇ íon, o íon de fragmento diferenciação mais alto no ranking do jogo do peptide-espectros identificados (indicada em vermelho, Figura 3B). A Figura 4 mostra uma visão geral dos resultados do cálculo de ocupação MS2 que confirmou a ocupação de percentagens de succinylation da entrada da proteína, transformados aqui constituído a BSA de pre-succinylated. Ocupação de succinylation medidos lisina para 20 succinylated proteolíticas peptídeos obtidos de BSA comercial pré-succinylated, succinylated em percentagens definidas (por exemplo, em 0, 1, 10, 50 e 100%) são mostrados na tabela 2. Para cada um dos 20 peptides BSA proteolíticas, espesso o mais elevado, diferenciando MS2 íon fragmento foi utilizado para calcular a ocupação de succinylation (Ksucc) de lisina, como L/(L+H) em %. Em geral, a quantificação MS2-baseado mostrou muito boa precisão na determinação de acilação ocupação mesmo em baixas stoichiometries.

Figura 1: fluxo de trabalho estequiometria. (A) proteínas são incubadas três vezes com anidrido acético -d₆ para acetificam resíduos de lisina não modificado. Na próxima, acetiladas proteínas são digeridas com endoproteinase Glu-C, seguido de fracionamento de HPLC dos peptides proteolíticas usando cromatografia de fase reversa basic-pH. Finalmente, os peptídeos são analisados por LC-MS usando o diâmetro com larguras de janela variável precursor. (B) o mesmo fluxo de trabalho é usado para determinar a estequiometria de succinylation, conforme descrito na alíneaA, exceto o reagente pesado acilação é alterada para succínico anidrido -d₄. Figura adaptada de Meyer et al. ⁴ (J. Alt. Soc. Mass Spectrom., escolha aberta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: exemplo de possíveis dados obtidos e cálculos de estequiometria. (A) luz (L) e íons de precursor MS1 (H) pesadas contendo um lisina acetilada diferem por 3 unidades de massa. XICs são gerados para ligeiros e pesados envelopes isotópicas, indicadas em vermelho e azul, respectivamente. (B) quantificação do MS2 íon fragmento XICs de aquisições de diâmetro pode ser executada usando 'diferenciar' íons pesados e leves fragmento que contêm o site acetilação indicada em vermelho e azul. Íons comuns de fragmento são exibidos em pontilhado preto e não contêm o site de modificação. Figura adaptada de Meyer et al. ⁴ (J. Alt. Soc. Mass Spectrom., escolha aberta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: visualização do Skyline de peptídeo de BSA proteolítica succinylated em níveis de ocupação diferentes. (A) Skyline alvo árvore mostrando o peptídeo proteolítica LCKsuccVASLRE e sua consequente fragmentação íons. (B) Skyline extraído cromatogramas de íon fragmento em níveis variados de ocupação succinylation. O íon de diferenciação ranking mais alto, y₇, aumenta na área do pico, 1, 10, 50 e 100% correlacionando a porcentagem entrada de pre-succinylated BSA (gerado internamente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: avaliando a estequiometria de acilação BSA de BSA de pre-succinylated. Cinco diferentes amostras de BSA em percentagens definidas de modificação pesada (ex., em 0, 1, 10, 50 e 100%) foram submetidas à determinação de ocupação MS2. Ocupação do local para 20 peptídeos de BSA succinylated foram determinados a partir os maior classificado íons de fragmento diferenciador para cinco diferentes amostras de BSA em percentagens definidas de luz modificação (por exemplo, em 0, 1, 10, 50 e 100%). O enredo dos whiskers caixa exibe a distribuição dos 20 Succinil peptides, valores de 50% dos peptídeos estão na 'caixa' (percentil 25% a 75% por cento), a triz superior indica os valores do percentil 75% para o máximo (100%) e o whisker inferior indica os valores do percentil 25% para o mínimo (0% percentil). (J. Alt. Soc. Mass Spectrom., escolha aberta). Quantificação das medições pode ser encontrada na tabela 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tempo (minutos)	% A	% B
0,00	100	0
7,27	92	8
45.27	73	27
49.27	69	31
65.27	61	39
72,27	40	60
80,00	10	90
85.00	10	90
86,00	100	0
120,00	100	0
Taxa de fluxo: 0,7 mL/min
Reserva r: formiato de amônio 10mm em água, pH 10
Tampão b: formiato de amônio de 10 mM em 90% do Grupo ACN e 10% de água, pH 10
Nota: O pH de ambas as fases móveis ajustado para 10 com amoníaco puro

Tabela 1: gradiente para off-line fraccionamento de HPLC de fase reversa basic-pH. Comprimento do gradiente: formiato de amônio 120 min. Buffer r: 10 mM em água, pH 10. Tampão b: formiato de amônio 10 mM em 90% do Grupo ACN e 10% de água, pH 10.

L / L + H em %	L / L + H em %	L / L + H em %	L / L + H em %	L / L + H em %
Ksucc 0%	Ksucc 1%	Ksucc 10%	Ksucc 50%	Ksucc 100%
0.2	1.7	11.1	50,9	99.2
1.2	2.3	12.3	49,4	97,6
2.9	3.8	14	48,6	99.5
0,5	1.8	11,7	50.8	99.5
0.2	1.7	11.1	48.3	98,2
0.2	1.2	11	47,5	96,1
0.3	1.6	12,8	51	99.2
3.7	5.2	14,7	51,9	89,5
1.5	1.8	12.5	47.2	91,1
0.8	1.5	11.3	48,4	96.8
0.2	1.6	13,9	49,7	98,9
0.1	1.1	10.7	48,2	98,6
0.2	0.9	10.3	49,4	99.4
0,5	2.5	17.2	52.3	97,5
0.1	3.5	20,8	51	99
0.3	1.9	10.7	49,6	98,2
2	1.7	10.9	47,7	96.3
0.3	1.2	10	53	98
1.1	1.8	12.9	57.9	94.1
0.2	1.4	11,6	48,6	98.8

Tabela 2: quantificação de medido ocupação de succinylation de lisina de BSA para 20 peptídeos proteolítica succinylated. Succinylated peptídeos obtidos de BSA comercial pré-succinylated, succinylated em percentagens definidas (por exemplo, em 0, 1, 10, 50 e 100%). Para cada um dos 20 peptides BSA proteolíticas, espesso o mais elevado, diferenciando MS2 íon fragmento foi utilizado para calcular a ocupação de succinylation (Ksucc) de lisina, como L/(L+H) em %.

Discussão

Este protocolo fornece um romance e o método preciso para quantificar a acetilação de lisina site-specific e ocupação de succinylation que pode ser aplicada a um proteome inteira. Este método baseia-se na medição de luz endógenos e exógenos peptídeos pesados, o último dos quais é gerados em vitro usando acilação química quantitativa de proteínas com anidrido acético deuterado -d₆ ou succínico anidrido -d₄ (Figura 1). Métodos semelhantes têm usado estável isotópica rotulagem de resíduos de lisina não modificado nativo e realizada a quantificação de ocupação do local com base em qualquer precursor somente íon¹² ou fragmento de íons de DDA aquisições^13,14. O presente protocolo aplica-se várias etapas durante a preparação da amostra para melhorar a eficiência de acilação e estende a rotulagem química para succinylation. Coleta de dados utilizando aquisições de diâmetro obtém tanto íon precursor e fragmento MS2 intensidades de íon na faixa completa detectável em massa, reduzindo assim as interferências de íon fragmento. Análise e quantificação através do horizonte e scripts personalizados desenvolvidos internamente permitem o cálculo de ocupação do local por peptídeos contendo mais de um resíduo de lisina e acilação de mais de um em um site.

Existem vários passos críticos durante a fase de preparação da amostra do presente protocolo que deve ser seguido de perto. Desde que o protocolo inteiro baseia-se na modificação química eficiente de todos os resíduos de lisina, esta etapa é de extrema importância. Anidridos reagem com aminas livre, moléculas buffer ou contaminantes contendo amina da proteína lisado devem ser evitadas. Também durante a etapa de química por acilação, certifique-se que o pH da mistura reacional é ajustado para pH 8 após cada uma da incubação três do com reagente de anidrido como esta reação acidifica a mistura, e podem formar O-acilação-reações colaterais. Além disso, a diluição de 8m que contêm ureia mistura reacional para em torno de 0,8 M de ureia antes da digestão e verificar que o pH está dentro da faixa ideal é importante para a atividade ideal a endoproteinase Glu-C. Outro componente fundamental do nosso protocolo é a etapa de coleta de dados e a introdução de um workflow de diâmetro, que supera qualquer inconsistência de amostragem de dados DDA e que permite a quantificação a nível de íon fragmento MS2. Uma vantagem principal da metodologia de diâmetro é a diminuição de interferências que normalmente são muito mais propensas e problemático quando quantificar o sinal de íon precursor MS1 (como algumas das publicações anteriores têm sugerido).

Várias modificações no fluxo de trabalho podem ser feitas ao preparar amostras altamente complexas. O número de fracções em pool após o fracionamento de HPLC de fase reversa basic-pH off-line pode ser diminuído para reduzir a complexidade das amostras em pool que vai ser adquirido por LC/MS.. Além disso, mais gradientes cromatográfica pode também ser usado durante aquisição para permitir a melhor separação de peptídeo. Alternativamente, várias proteases podem ser usados para a digestão de amostras para produzir uma maior variedade de peptídeos clivados e aumentar a cobertura dos resíduos de lisina da proteína. Testes e otimização podem ser realizados usando BSA comercial contendo percentagens específicas de acetilação ou succinylation.

Uma limitação para este protocolo é superestimação de ocupação local potencialmente ligeiro devido a desaparecidos outras modificações de lisina, como metilação ou ubiquitination, etc, no mesmo local⁴. Calculado a partir das áreas de pico de modificações de acila leves e pesados, L/(L+H), a ocupação do local é baseada na suposição de que o nível total de modificação em um site de lisina consiste apenas endógena acilação 'luz' (L) e quimicamente rotulada 'pesada' acilação (H). No entanto, a ocupação de acilação total real em um local na vivo pode incluir outras modificações além da acetilação e/ou succinylation. Além disso, a relatado isotópica pureza dos reagentes comprados anidrido acético -d₆ (99%) e succínico anidrido -d₄ (> 98%) podem contribuir para uma superestimação pequena de até 2% (Succinil) ou 1% (acetil) do acilação endógena nível⁴. Juntos, esses overestimations ligeiras adicionem à dificuldade em quantificar a sites com menos de 1% ocupação. Grande abundância as diferenças entre o completo quimicamente peptídeos acylated e os acylated nativo peptídeos também contribuem para erros potenciais de quantificação de ocupação de local, especialmente para baixo acylated endógeno peptídeos²⁷. Um estudo recente por Weinert et al. ²⁷ encontradas que diminuição da abundância diferenças entre peptídeos por-acetilado completas podem reduzir o erro de quantificação²⁷.

Quantificações de estequiometria obtidas usando este protocolo podem identificar hotspots de acilação importante em uma hipóteses de proteínas e de forma particular para experiências biológicas de acompanhamento, tais como o mutagenesis local-dirigido de determinados locais de interesse. Este protocolo também poderia revelar efeitos combinados de sites de estequiometria de acilação baixo que poderiam exercer influências indiretas ou sutis na estabilidade estrutural de proteínas e localizados ambientes celulares. Além disso, a implementação do presente protocolo para medir acetilação e succinylation e outras modificações de acilação de lisina possível além da acetilação excepcionalmente ofereceria insights sobre os efeitos de acilação dinâmico sobre proteínas sob diferentes condições biológicas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
anidrido acético aquoso-d6	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	175641-1G	1% de pureza isotópica
de anidrido succínico-d4	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	293741	2%
endoproteinase de grau de sequenciamento de pureza isotópica Glu-C	Roche, Indianápolis, IN, EUA (através da Sigma)	10791156001	proporção de protease 1:50 para proteína de substrato (wt:wt)
Cartuchos de extração em fase sólida (SPE) Oasis HLB	Waters Corp., Milford, MA, EUA	WAT
HPLC acetonitrila	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, EUA	Água de grau BJAH015-4
HPLC	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, EUA	BJAH365-4
iodoacetamida	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	I1149-25G
ditiotreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	D9779-5G
FLUKA ácido fórmico (FA) para espectrometria de massa	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, EUA	C988C27	~98%
ureia	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	PI29700
albumina de soro bovino (BSA)	Pierce, Rockford, IL, EUA	88341
bicarbonato de trietilamônio (TEAB)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	T7408-100ML
dimetilsulfóxido anidro (DMSO)	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, EUA	43998
hidróxido de sódio (NaOH)	EMDMillipore, Burlington, MA, EUA	SX0590
Solução de hidroxilamina a 50% em água	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	438227-50ML
LC-MS grau de água	Burdick e Jackson, Muskegon, MI, EUA	BJLC365-4
LC-MS acetonitrila	Burdick e Jackson, Muskegon, MI, EUA	BJLC015-4
Eppendorf Themomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha	T1317-1EA
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	SPD131DDA-115
Waters 1525 sistema de bomba de HPLC binária	Waters Corp., Milford, MA, EUA	WAT022939
Waters 2487 Detector UV de comprimento de onda duplo	Waters Corp., Milford, MA, EUA	WAT081110
Waters 717plus Autosampler	Waters Corp., Milford, MA, EUA	WAT022939
Waters Fraction Collector III	Waters Corp., Milford, MA, EUA	186001878
Agilent Zorbax 300Extend C18 coluna	Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, EUA	770995-902
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer	Labconco, Kansas City MO, EUA	7751000
padrão de peptídeo de normalização de tempo de retenção indexado (iRT)	Biognosys AG, Schlieren, Zurique, Suíça	Ki-3002-2
Sistema de HPLC 2D Ultra Plus nano-LC	Sciex LLC, Divisão Eksigent, Framingham, MA, EUA	modelo # 845
tempo de voo quadrupolo ortogonal (QqTOF) Espectrômetro de massa TripleTOF 5600	Sciex LLC, Framingham, MA, EUA	por cotação
tempo de voo quadrupolo ortogonal (QqTOF) Espectrômetro de massa TripleTOF 6600	Sciex LLC, Framingham, MA, EUA	por cotação
Chip de pré-coluna C18 (200 μ m &vezes; Chip ChromXP C18-CL de 6 mm, 3 μ m, 300 &)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00006
Plugin SWATH 2.0 no PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, EUA	download de software Sciex
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zurique, Suíça	Chip Sw-3001
C18-CL (75 µ m x 15 cm ChromXP, 3 µ m, 300 &)	Sciex LLC, Framingham, MA, EUA	804-00001