Summary
Questo metodo descrive il posizionamento degli innesti della vena di interposizione in conigli, la trasduzione degli innesti e il raggiungimento dell'espressione del transgene durevole. Questo permette l'indagine su ruoli fisiologici e patologici di transgeni e loro prodotti proteici nelle vene innestate e il test di terapie geniche per la malattia dell'innesto della vena.
Abstract
Chirurgia di bypass dell'innesto della vena è un trattamento per la malattia occlusiva arteriosa; Tuttavia, il successo a lungo termine è limitata dalla guasto dell'innesto a causa di trombosi, iperplasia intimale ed aterosclerosi. L'obiettivo di questo articolo è quello di illustrare un metodo per posizionare gli innesti bilaterali interposizione venosa in un coniglio, poi trasducendo gli innesti con un vettore di trasferimento del gene che raggiunge l'espressione del transgene durevole. Il metodo consente l'indagine dei ruoli biologici di geni e loro prodotti proteici nell'omeostasi dell'innesto della vena normale. Inoltre permette il testing di transgeni per le attività che potrebbero impedire il guasto dell'innesto di vena, ad es., se l'espressione di un transgene impedisce la crescita di neointimale, riduce l'infiammazione vascolare o riduce l'aterosclerosi in conigli alimentati con una dieta ad alta percentuale di grassi. Durante un intervento chirurgico di sopravvivenza iniziale, i segmenti di destra e di sinistra della vena giugulare esterna sono asportati e messi bilateralmente come invertita innesti di interposizione dell'arteria carotica comune di fine--lato. Durante un secondo intervento di sopravvivenza, effettuato 28 giorni più successivamente, ciascuno degli innesti è isolato dalla circolazione con clip vascolari e i lumen sono pieni (tramite un'arteriotomia) con una soluzione contenente un vettore (HDAd) adenovirale helper-dipendente. Dopo 20 min di incubazione, la soluzione di vettore è aspirata, arteriotomia viene riparato e flusso viene ripristinato. Le vene si raccolgono a intervalli di tempo dettate da singoli protocolli sperimentali. Il ritardo di 28 giorni tra il posizionamento dell'innesto e la trasduzione è necessario garantire l'adeguamento dell'innesto della vena per la circolazione arteriosa. Questo adattamento evita rapida perdita di espressione del transgene che si verifica negli innesti di vena trasformati prima o immediatamente dopo l'innesto. Il metodo è unico nella sua capacità di raggiungere l'espressione del transgene durevole, stabile nelle vene innestate. Rispetto ad altri modelli di innesto di grande vena animali, conigli hanno vantaggi di basso costo e facile movimentazione. Rispetto ai modelli dell'innesto della vena del roditore, conigli sono più grandi e più facile da manipolare vasi sanguigni che forniscono abbondante tessuto per l'analisi.
Introduction
L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica in cui accumulo di lipidi e di infiammazione nella parete del vaso sanguigno portano a restringimento del lume vascolare, attacchi cardiaci, ictus e perdita di arti1,2. Interventi percutanei (ad es., angioplastica e stenting) e terapia medica (ad es., agenti di statine e antipiastriniche) sono trattamenti utili per aterosclerosi; Tuttavia, essi sono spesso inefficaci nel trattamento della malattia ostruttiva severa sia nelle circolazioni coronariche e periferiche. L'innesto di esclusione, utilizzando segmenti di vena autogena, rimane una procedura comune per il trattamento di pazienti con malattia vascolare coronaria e periferica severa e diffusa3,4. Tuttavia, vena innesti collocati in entrambi la coronaria e periferiche circolazioni hanno tassi di pervietà a lungo termine poveri. Nella circolazione coronaria, circa il 10-20% della vena innesti sono occlusi a 1 anno e 50% sono occluse da 10 anni5,6. Nella circolazione periferica, tassi di guasto dell'innesto della vena sono 30-50% a 5 anni7.
La terapia genica è un approccio attraente per la prevenzione di guasto dell'innesto della vena perché può fornire un prodotto del gene terapeutico proprio presso il sito della malattia. Di conseguenza, numerosi studi preclinici hanno testato la vena dell'innesto gene terapia8,9. Tuttavia, essenzialmente tutti questi studi hanno esaminato l'efficacia al tempo punti (2-12 settimane)10,11,12,13,14,iniziali15, 16 , 17. siamo a conoscenza di alcuna prova che gli interventi di terapia genica possono fornire durevole protezione (anni) contro tardo guasto dell'innesto della vena che in genere deriva da neointimale iperplasia e aterosclerosi4. Abbiamo sviluppato un metodo che permette l'espressione del transgene durevole nelle vene innestate e quindi permette la sperimentazione di interventi di terapia genica in ritardo così come primi momenti. Per ottenere l'espressione del transgene durevole, il metodo incorpora HDAd vettori e una strategia di trasduzione in ritardo. Giuseppe vettori forniscono l'espressione del transgene prolungata mancanza di geni virali, impedendo il riconoscimento (e rifiuto) di cellule trasdotte dal sistema immunitario18,19,20, 21. Delayed trasduzione (effettuata 28 giorni dopo il posizionamento dell'innesto) previene la perdita di cellule trasdotte durante il processo di arterializzazione che si verifica all'inizio dopo l' innesto22.
Altri metodi che ottenere l'espressione del transgene terapeutico nella parete dell'innesto della vena si affidano la trasduzione dell'innesto della vena al momento dell'innesto posizionamento10,11,12,15,16 ,17. Quando misurati in serie, utilizzando questo approccio l'espressione del transgene diminuisce rapidamente dopo la trasduzione22,23. Di conseguenza, gli studi che utilizzano questo approccio non hanno esaminato l'efficacia oltre le 12 settimane dopo l'innesto della vena, con più non ha valutato l'efficacia oltre 4 settimane. Al contrario, il nostro metodo raggiunge innesto della vena l'espressione del transgene che persiste stabile per almeno 24 settimane e basato su studi simili effettuati in arterie-probabile continua molto più lungo22,24. Siamo consapevoli di nessun altro vena gene terapia intervento di innesto che raggiunge l'espressione del transgene stabile di questa durata.
Abbiamo usato un modello del coniglio per sviluppare il nostro metodo. Altri hanno utilizzato roditori, conigli, o più grandi animali per testare la vena dell'innesto gene terapia10,11,12,15,16,17,25, 26. Rispetto ai modelli di roditori, conigli sono più costosi e sono soggetti a requisiti normativi più severi. Tuttavia, rispetto ad animali più grandi (ad es., maiali e cani), i conigli sono molto meno costosi da acquistare e casa e molto più facile da gestire. Inoltre, vasi di coniglio assomigliano umani vasi fisiologicamente27, sono sufficientemente grandi, che possono essere utilizzati per testare gli interventi percutanei28,29, e forniscono sufficiente tessuto che più endpoint (ad es., istologia, proteine, RNA) può essere esaminato tramite un singolo vaso sanguigno esemplare22,30. Inoltre, quando i conigli con gli innesti della vena sono alimentati con una dieta ricca di grassi, sviluppano vena innesto aterosclerosi31,32, che è una causa comune dell'arteria coronaria bypass vena innesto guasto4,5 . Questi innesti di vena di coniglio aterosclerotica possono servire come substrato per gli interventi di terapia genica consegnati con questo metodo di test. Il protocollo fornito può aiutare gli investigatori a padroneggiare le competenze tecniche necessarie per ottenere l'espressione del transgene durevole negli innesti di vena di coniglio.
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Protocol
Tutti i protocolli animale e gli studi sono stati approvati dall'Università di Washington Office of Animal Welfare.
1. pre-operazione (per tutti gli interventi chirurgici)
- Anestetizzare il coniglio con 30 mg/kg xylazina ketamina e 1,5 mg/kg per via intramuscolare (IM) nei muscoli paraspinali.
Nota: Cibo e acqua non sono limitate prima della chirurgia. - In attesa di sufficiente profondità dell'anestesia, è possibile impostare le tabelle in preparazione camera e sala operatoria (OR).
- Preparare la stanza di preparazione per la rasatura del collo del coniglio e il posizionamento della porta per via endovenosa (IV) nell'orecchio (solo chirurgia di sopravvivenza). Collocare l'unguento oftalmico, patch fentanil (chirurgia di sopravvivenza), tosatrici, preparazione tampone imbevuto di alcool, 24 G x ¾" catetere, iniezione e nastro chirurgico sul piano di preparazione.
- In sala operatoria, istituiti le apparecchiature di monitoraggio e associati sonde (elettrocardiogramma (ECG), pulsossimetria (SpO2) e temperatura). Preparare la pompa IV con una sacca di IV 100 mL soluzione fisiologica con un ago da 18 G o 19-G e impostare la velocità di flusso come 10 mL/h/kg (solo chirurgia di sopravvivenza). Impostare l'apparecchiatura dell'ossigeno e isoflurano con una punta conica (vena l'innesto o raccolto interventi chirurgici).
- Per proteggere la punta conica al coniglio, ciclo una striscia di garza attorno al tubo che fornisce gas per la punta conica. Questo ciclo dovrebbe circondare il tubo dove si attacca per la punta conica. Le estremità libere della striscia di garza entrambi dovrebbero essere lunga circa 45 cm. Posizionare la punta conica (con annesso garza) sul finale della testa della tabella.
- Accendere l'acqua di circolazione e/o riscaldamento coperta sul tavolo OR aria forzata. Sulla coperta riscaldante, posizionare un asciugamano arrotolato come un supporto per il collo e posizionare la piastra elettrodo dispersivo elettrocauterio.
- Come un analgesico locale, si combinano in una siringa da 1 mL di lidocaina 2% HCl e diluire 1 mL di bupivacaina 0,5% HCl. il virus fino alla concentrazione desiderata (qui, uso 2 x 1011 virale particelle/mL per HDAd) in DMEM sterile e continuare su ghiaccio (solo chirurgia di trasferimento gene).
- Dopo aver raggiunto un'adeguata profondità anestetica, preparare il coniglio per la chirurgia.
Nota: Test per la mancanza di un riflesso di ritiro pedale per garantire un'adeguata profondità anestetica. Continuare a monitorare il riflesso pedale durante la chirurgia.- Applicare unguento oftalmico agli occhi del coniglio.
- Per consentire il posizionamento di una sonda di temperatura rettale, premere con le dita guantate appena sopra il retto e spostare le dita verso l'ano per rimuovere defecatorie dal retto del coniglio.
- Radere il coniglio dalla tacca sternal al bordo della mandibola. Radere un orecchio per il posizionamento del IV e l'orecchio opposto per la somministrazione di fentanil patch (solo chirurgia di sopravvivenza). Radere la dita posteriore sinistra per il posizionamento della sonda2 SpO.
- Per la chirurgia di infusione di vettore, intubare il coniglio. Utilizzare un 4 mm O.D./3 mm I.D. uncuffed tubo endotracheale, infilati sopra un Artroscopio. Posizionare il coniglio in decubito sternale e iper-estendere il collo. Tenere bocca del coniglio spalancata e consente di visualizzare la glottide e laringe piega l'artroscopio. Durante l'ispirazione, inserire delicatamente il tubo endotracheale attraverso la laringe e la trachea.
- Per gli interventi chirurgici di sopravvivenza, posizionare e fissare un catetere di IV 24-G in vena di sinistra dell'orecchio del coniglio e dirla con un foro di iniezione. Applicare una patch di 25 µ g/h fentanil per orecchio destro del coniglio.
Nota: Il protocollo è per un chirurgo posizionato sul lato destro del coniglio. Se il chirurgo sarà sul lato sinistro del coniglio, invertire i lati in questo passaggio per tenere i fili e IV fronte del chirurgo. Se necessario, passare i lati in passi futuri. - Per gli interventi di innesto e raccolto della vena, amministrare l'anestesia generale con una punta conica; per la chirurgia di infusione di vettore, amministrare l'anestesia generale tramite un tubo endotracheale.
Nota: L'intubazione può essere utilizzato per tutti gli interventi chirurgici. Nella nostra esperienza, tuttavia, i rischi di complicazioni da trauma laringeo e trachea durante l'intubazione possono superare i benefici di intubazione. L'intervento chirurgico che include il trasferimento del gene ad un innesto (particolarmente nei conigli di colesterolo-federazione) è l'unico intervento chirurgico in cui intubazione sembra fornire un beneficio netto. - Portare il coniglio in sala operatoria. Posizionare il coniglio in una posizione supina sul tavolo operatorio con l'asciugamano di supporto collo posizionato appena sotto la testa del coniglio. Estendere delicatamente collo del coniglio fino a quando è dritto e circa orizzontale.
- Posizionare la punta conica al coniglio (vena innesto e raccolto ambulatori) o collegare il tubo endotracheale (vettore infusione chirurgia) con O2 a 1 L/min e iniziare isoflurano. Se si utilizza una punta conica, fissarla avvolgendo le estremità delle strisce di garza annesso intorno asciugamano di supporto collo del coniglio. Regolare la concentrazione di isoflurane secondo necessità (in genere 1-2%) per mantenere un livello chirurgico dell'anestesia.
- Centro la piastra elettrodo dispersivo elettrocauterio dietro la schiena del coniglio. Inserire la sonda di temperatura rettale e applicare la SpO2 sonda ed EKG conduce al coniglio.
- Collegare la linea IV Salina alla porta catetere nell'orecchio sinistro del coniglio e avviare la pompa di infusione IV a 10 mL/h/kg. Dopo 1 h, ridurre il tasso di infusione salina a 5 mL/h/kg.
- Legare senza stringere gambe anteriori del coniglio al tavolo operatorio come un sistema di ritenuta.
Nota: Facoltativamente, un piccolo tavolo di plastica può essere posizionato sopra il coniglio per evitare che il chirurgo da premendo sul torace/addome del coniglio e potenzialmente causare aspirazione e malattia da reflusso gastroesofageo. - Iniettare lidocaina/bupivacaina (2 mL, mix 50/50, punto 1.2.4) per via sottocutanea (SQ) nel collo lungo la linea di incisione pianificata, per l'anestesia locale.
- Sono l'Assistente di disinfettare la chirurgica del sito con 3 alternando scrub di clorexidina gluconato e isopropanolo, quindi spruzzare il sito con povidone-iodio. Sono chirurgo scrub, abito e guanto, seguendo principi asettici.
- Eseguire interventi chirurgici di sopravvivenza in condizioni asettiche. Hanno l'assistente gestire eventuali elementi non sterili e asetticamente passare materiali sterili al chirurgo o asetticamente metterli sul portamoduli drappeggiato.
- Avere il chirurgo di uso asciugamani sterili per manipolare in modo asettico attrezzature non sterili come il microscopio. Avere il chirurgo indossare lenti di ingrandimento chirurgiche: 2x durante l'esecuzione della prima metà della chirurgia.
2. vena chirurgia dell'innesto (sopravvivenza)
- Preparare gli strumenti e il campo sterile.
- Fare l'assistente in confezioni sterili (un drappo di tabella, un drappo di carta e 6 asciugamani) e Trasferire asetticamente i contenuti per il chirurgo.
- Drappo portamoduli. Posizionare il drappo di carta e asciugamani sterili sul tavolo strumento drappeggiato. Con 4 asciugamani, drappo il coniglio, lasciando solo il sito chirurgico sul collo esposto. Posare il telo di carta sopra il coniglio. Un asciugamano verrà utilizzato in seguito, e l'ultimo è una copia di backup.
- Avere l'assistente aprire la confezione sterile strumento e asetticamente passare il vassoio dello strumento per il chirurgo. Disporre gli strumenti sul portamoduli.
- Sono l'Assistente di aprire le seguenti attrezzature e asetticamente passarlo al chirurgo o posizionarla sul tavolo per strumenti: una siringa da 1 mL, una siringa da 3 mL, una siringa da 20 mL, un ago 21G, sutura (PGA) l'acido poliglicolico di 3-0, sutura PGA 5-0 , 7-0 suturare del polipropilene e un catetere IV di 24 G.
- Fissare il cavo di elettrocauterio il telo che copre il coniglio, utilizzando una Kantrowitz forcipe 7.25". Cadere l'estremità del cavo con spina sopra il bordo del tavolo operatorio per essere collegato all'unità elettrochirurgia e attivata dall'assistente.
- Riempire una siringa da 20 mL con soluzione salina sterile da una sacca di soluzione fisiologica o flaconcino tenuto dall'assistente. Utilizzare questa soluzione salina come necessario per evitare la disidratazione del tessuto esposto durante l'operazione.
- Preparare 5 mL di soluzione salina fisiologica eparinizzata aggiungendo 0,1 mL di eparina 5.000 UI/mL a 5 mL di soluzione fisiologica, cioè., eparina di 100 UI/mL, in una piccola ciotola chirurgica. Utilizzare questa soluzione per svuotare l'innesto della vena e dell'arteria carotica regolarmente durante la procedura d'innesto.
- Tagliare un buco nel drappo di carta sopra il sito chirurgico sul collo del coniglio. Uso asciugamano morsetti per fissare gli angoli del foro nel posto in cui gli asciugamani sottostanti.
- Dissezione vascolare
Nota: Utilizzare 2 lenti di ingrandimento chirurgiche x per aiutare con questa parte della chirurgia.- Tagliare la pelle con l'elettrocauterio lungo la linea mediana tra la tacca di sternal e la mandibola (circa 7-9 cm di lunghezza) e la fascetta della pelle del collo del coniglio per gli asciugamani con i morsetti di asciugamano. Verso l'estremità caudale, fare un breve taglio laterale attraverso la fascia con l'elettrocauterio. Senza mezzi termini sezionare sotto la fascia lungo il midline intero utilizzando forbici grandi. Tagliare lo strato Fascia sezionato lungo la linea mediana con l'elettrocauterio.
- Iniziare sul lato destro. Sezionare tra il muscolo sternohyoid sovrastante la trachea e il muscolo a forma di V sternocephalic, per esporre l'arteria carotica comune.
- Accuratamente sezionare un segmento di 4-5 cm dell'arteria carotica comune e dei relativi rami più grandi (in genere 1-2 per lato) liberi dai tessuti circostanti. Estendere la dissezione dalla base del collo prossimalmente all'incrocio del nervo pharyngeal distale. Uso chirurgico silicio loop per facilitare la retrazione dell'arteria carotica durante la dissezione. Lega i più grandi rami dell'arteria carotica comune con suture seta 5-0 prima di tagliare ogni ramo distale.
Nota: Fare attenzione a non disturbare il nervo vago che affianca l'arteria carotica comune, o i più piccoli nervi che attraversano sopra l'arteria. - Ripetere la dissezione sul lato sinistro (punto 2.2.3).
- Utilizzare tessuto-holding pinze per chiudere temporaneamente lo strato di tessuto sottocutaneo. Sezionare la fascia superficiale della pelle sul lato destro fino a quando la vena giugulare esterna è esposta. Sezionare un segmento di 4-5 cm della vena giugulare esterna e libera i suoi rami dal tessuto circostante, legando i piccoli rami con suture seta 5-0 prima di tagliare il ramo.
- Ripetere la dissezione sul lato sinistro (punto 2.2.5).
- Iniettare l'eparina (150 UI/kg) del catetere IV e a filo con 10 mL di soluzione fisiologica.
- Misurare un segmento di 3 cm della vena giugulare esterna sul lato destro e legare l'estremità caudale del segmento con sutura seta 5-0. Consentire la vena a riempirsi di sangue, poi legare le estremità cranica del segmento di vena. Dividere le estremità cranica del segmento della vena giugulare esterna, lavare delicatamente il vaso con soluzione salina eparinizzata (100 U/mL) utilizzando una siringa da 3 mL per un 24-G IV-catetere. Dividere il segmento di vena alla sua estremità caudale. Posizionare il segmento della vena in modo standardizzato, in cui le estremità caudale e craniale sono inequivocabilmente identificabili.
- L'innesto della vena
- Rimuovere le lenti di ingrandimento chirurgiche dal chirurgo e spostare il microscopio operatorio (25 X) in posizione, lasciare che l'assistente.
Nota: Il chirurgo dovrebbe drappo un asciugamano sterile sopra il microscopio. Questo permette al chirurgo di manipolare il microscopio mantenendo la sterilità. - Bloccare l'arteria carotica comune di destra ad ogni estremità del segmento isolato con mini-morsetti, ponendo il morsetto cranico in primo luogo per consentire arteria di riempimento, quindi posizionare il morsetto caudale.
- Tagliare un pezzo di cm × 2 1 di carta rigida (disponibile dalla confezione sterile sutura) e posizionarlo sotto l'arteria carotica comune, per migliorare l'esposizione.
- Eseguire un'arteriotomia appena craniale al morsetto caudale (arteriotomia caudale). La lunghezza di arteriotomia deve essere uguale al diametro dell'estremità cranica del segmento di vena. Inserire la siringa con il catetere IV attraverso arteriotomia caudale e lavare il lume dell'arteria carotica con soluzione salina eparinizzata.
- Suturare cranica fine della vena per l'arteriotomia caudale, con sutura in polipropilene 7-0 con punti di sutura singole (Figura 1).
- Posizionare il primo punto per suturare l'estremità caudale della arteriotomia caudale all'estremità cranica del segmento di vena. Posizionare il secondo punto 180° dal primo punto, suturare l'estremità cranica del arteriotomia caudale all'estremità cranica del segmento di vena.
- Posizionare il terzo punto in un punto equidistante dai primi due punti di sutura, sulla parte laterale dell'anastomosi. Posizionare il punto di quarto sul lato mediale dell'anastomosi, equidistante dai primi due punti e di fronte il terzo punto. Posto 4 ulteriori punti (punti 5-8) tra ciascuno dei punti 1-4.
- Eseguire l'arteriotomia cranica sul lato caudale del clip cranica. La distanza tra estremità cranica del arteriotomia cranica e l'estremità caudale della caudale arteriotomia dovrebbe essere lo stesso come la lunghezza del segmento di vena. La lunghezza di arteriotomia cranica è uguale al diametro dell'estremità caudale del segmento di vena.
- Estendere la vena cranialmente dall'anastomosi, ponendola in cima la carotide, senza introdurre alcun colpi di scena. Sciacquare la carotide e vena con soluzione fisiologica eparinata normale tramite arteriotomia cranica. La soluzione salina fluirà attraverso l'arteria, nella vena tramite l'anastomosi caudale e uscirà dall'estremità libera e unsutured della vena. Flushing la vena anche esso impedisce la torsione.
- Suturare l'estremità caudale della vena per l'arteriotomia cranica (Figura 1).
- Posto un primo punto per suturare l'estremità caudale della arteriotomia cranica all'estremità caudale del segmento di vena. Inserire un secondo punto per sutura cranica fine arteriotomia cranica all'estremità caudale del segmento di vena. Completare l'anastomosi come descritto nel passaggio 2.3.5.2. Poco prima che l'ultimo nodo è legato sull'anastomosi cranica, brevemente aprire il morsetto all'estremità cranica del segmento dell'arteria carotica comune sezionato, per consentire retro-sanguinamento che lava via l'aria nella carotide e vena innestata. Quindi, stringere il nodo ultimo.
- Allentare il morsetto cranico per consentire il riempimento dell'innesto della vena con il sangue e quindi allentare il blocco caudale. Brisk pulsazioni dovrebbero essere visto nell'innesto della vena. Applicare una leggera pressione con una garza asciutta per bloccare qualsiasi emorragia presso le anastomosi.
- Legare le due estremità del segmento dell'arteria carotica comune che collega le anastomosi con una sutura seta 3-0 e dividere la carotide a metà strada tra le legature (Figura 1). Applicare alcune gocce di papaverina (3,5 mg/mL) per l'adiacente ad ogni anastomosi dell'arteria carotica.
- Iniettare l'eparina (75 UI/kg) il catetere orecchio IV e a filo con 10 mL di soluzione fisiologica. In questo momento, iniettare buprenorfina (SQ, 0,02 mg/kg) per fornire l'analgesia postoperatoria fino a quando la patch fentanil ha fornito livelli plasmatici analgesico di fentanil.
Nota: Un'iniezione di buprenorfina aggiuntive (SQ, 0,02 mg/kg) può essere necessario 6 h dopo la prima iniezione per mantenere l'analgesia, fino a quando il fentanil plasma raggiunge una concentrazione terapeutica. - Ripetere l'innesto sul lato sinistro (passaggi 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
- Chiudere il tessuto sottocutaneo con sutura PGA 5-0 utilizzando un modello continuo. Chiudere la pelle con sutura PGA 3-0 utilizzando un modello intradermico. Seppellire i nodi su entrambe le estremità.
- Rimuovere le lenti di ingrandimento chirurgiche dal chirurgo e spostare il microscopio operatorio (25 X) in posizione, lasciare che l'assistente.
- Cura, pulizia e recupero post-operatorio
Nota: Lasciare il coniglio recuperare dall'anestesia in un ambiente calmo e tranquillo. Monitorare il coniglio continuamente per la corretta ossigenazione e la temperatura corporea fino a completamente ha recuperato.- Spegnere isoflurano e ossigeno e scollegare la macchina di anestesia del coniglio. Scollegare il tubo di fluidi IV del coniglio, ma lasciare il porto di IV nella vena orecchio per accesso emergente.
- Trasportare il coniglio in una gabbia di recupero e posizionarlo sul suo lato. Fornire supporto termico con un acqua calda coperta (o il riscaldamento ad aria forzata). Dare O2 di punta conica fino a SpO2 è stabile.
- Fino a quando il coniglio può sedersi e deambulare nella sua gabbia, capovolgere il coniglio al suo lato ogni 15 min. Quindi rimuovere la cannula IV di orecchio e tornare il coniglio alla sua gabbia. Restituire il coniglio per la compagnia di altri animali solo dopo che è completamente recuperato dall'anestesia.
- Smaltire qualsiasi rifiuti seguenti protocolli appropriati per biohazard e smaltimento dei rifiuti di sharps.
- Postoperatorio, controllare il coniglio salute e ferita chirurgica ogni giorno. Amministrare la buprenorfina come bisogno per dolore non gestiti dalla patch fentanil. Rimuovere la patch fentanil giorno postoperatorio 3.
3. transcutanea ultrasuono
- Per valutare l'evidenza dell'innesto, eseguire esame ecografico il coniglio non anestetizzato 5-7 giorni dopo la chirurgia di innesto della vena e trasferimento genico.
- Avvolgete il coniglio non anestetizzati saldamente in una coperta e il coniglio supina in un veterinario V-attraverso con il collo esteso. Radere il collo, o se necessario, rimuovere i peli con un agente depilatorio. Applicare il gel per ultrasuoni al collo ed eseguire un esame di ultrasuono.
Nota: Un esame di ultrasuono viene eseguito anche su conigli anestetizzati al momento sia l'operazione di trasferimento del gene che la chirurgia dell'innesto terminale di raccolta per esaminare l'evidenza dell'innesto e per misurare il diametro del lume dell'innesto. L'esame avviene appena prima il lavaggio del collo e viene eseguita in modo analogo per quanto riguarda i conigli non anestetizzati.
- Avvolgete il coniglio non anestetizzati saldamente in una coperta e il coniglio supina in un veterinario V-attraverso con il collo esteso. Radere il collo, o se necessario, rimuovere i peli con un agente depilatorio. Applicare il gel per ultrasuoni al collo ed eseguire un esame di ultrasuono.
4. Gene Transfer ambulatorio effettuato ~ 28 giorni dopo il posizionamento dell'innesto (sopravvivenza chirurgia)
- Prepara gli strumenti e il campo sterile.
- Seguire i passi 2.1.1-2.1.3. nella chirurgia dell'innesto della vena.
- Lasciate che l'assistente aprire le seguenti attrezzature e sia in modo asettico passarlo al chirurgo o posizionarla sul tavolo per strumenti: sei 1 mL siringhe (con ago), una siringa da 3 mL, una siringa da 20 mL, un ago 21G, un ago 19-G, sutura PGA 3-0 , Sutura PGA 5-0, 7-0 suturare del polipropilene, due cateteri IV di 24 G e una sonda di flusso di sangue sterile.
- Seguire i passi 2.1.5-2.1.6. nella chirurgia dell'innesto della vena.
- Preparare una siringa 1 mL con 1 mL DMEM per lavare l'innesto della vena e dell'arteria e preparare due siringhe-1-mL con soluzione virus (~ 0.5-0.7 dell'innesto di vena/soluzione di virus mL). Lasciate che l'assistente scongelare il virus e diluirlo in DMEM. Preparare una siringa da 3 mL con 0,5 mL di lidocaina/bupivacaina (mix 50/50, punto 1.2.4).
- Seguire il passaggio 2.1.8 in chirurgia dell'innesto della vena.
- Isolamento degli innesti della vena e arterie carotiche adiacente
Nota: 2 x lenti di ingrandimento chirurgiche dovrebbero essere utilizzati per questa parte.- Tagliare la pelle con l'elettrocauterio lungo la linea mediana tra la tacca di sternal e la mandibola (circa 7-9 cm di lunghezza) e la fascetta all'aperto di pelle con morsetti di asciugamano. Applicare 0,5 mL di lidocaina/bupivacaina (mix 50/50, punto 1.2.4) al tessuto sottocutaneo.
- Verso l'estremità caudale, fare un breve taglio laterale attraverso la fascia con l'elettrocauterio. Senza mezzi termini sezionare sotto la fascia lungo il midline intero. Con l'elettrocauterio, tagliare lungo la fascia sezionata lungo la linea mediana.
- Iniziare sul lato destro. Sezionare tra il muscolo sternohyoid sovrapponendo la trachea e il muscolo a forma di V sternocephalic, per esporre l'innesto della vena. Isolare accuratamente l'innesto della vena e 1.5-2.0 cm della carotide adiacente all'innesto su entrambi i lati craniali e caudali.
- Ripetere la dissezione sul lato sinistro seguendo passo 4.2.3.
- Misurare il flusso di sangue negli innesti di vena.
- Riempire la cavità di ferita chirurgica sul lato destro con normale soluzione fisiologica per consentire la trasmissione di onde sonore. Immergere una sonda di flusso 2mm perivascolare (collegata ad un misuratore di flusso di volume) nella soluzione fisiologica nella cavità della ferita e impostare la portata a zero.
- Posizionare la sonda di flusso intorno all'arteria carotica caudale o craniale per l'innesto della vena. Registrare i dati della sonda di flusso con un sistema di acquisizione dati elettronici.
- Ripetere la misura della portata sul lato sinistro dopo il punto 4.3.2.
- Calcolare la pulsatilità basato su portata sistolica di punta, portata minima diastolica e media portata. Anche calcolare la sollecitazione di taglio laminare, sulla base del tasso di flusso e diametro del lume (misurato con ecografia transcutanea).
- Infondere soluzione vettoriale negli innesti di vena
Nota: Un microscopio chirurgico (16x) è utilizzato come necessario per la perforatura, infusione e la riparazione dell'arteria carotica.- Sono l'Assistente di lenti di ingrandimento chirurgiche del chirurgo di rimuovere e spostare il microscopio operatorio in posizione. Sono il chirurgo drappo un asciugamano sterile sopra il microscopio. L'asciugamano sterile permette al chirurgo di manipolare il microscopio mantenendo la sterilità.
- Sono l'Assistente di iniettare l'eparina (150 UI/kg) del catetere IV e irrigare con soluzione fisiologica.
- Utilizzare un driver di grosso ago per piegare l'ago 21 G a circa 80° appena sopra la smussatura (non piegare la smussatura; Figura 2A).
- Bloccare l'arteria carotica comune ad ogni estremità dell'innesto della vena con mini-morsetti, ponendo il morsetto cranico in primo luogo per consentire arteria di riempimento, quindi posizionare il clip caudale. Posizionare la clip caudale circa 10 mm caudale all'anastomosi, per lasciare spazio per l'arteriotomia.
- Mettere due cravatte di seta intorno all'arteria caudale solo all'innesto e legare un singolo nodo alla marinara su ciascuno - senza stringerle.
- La carotide caudale all'innesto la puntura con l'ago 21 G piegato solo cranica della caudale clip vascolari. Fare attenzione a non forare le pareti posteriore o laterale. Fare avanzare l'ago nel lumen e indietro due volte per garantire che il lume è chiaro, quindi estrarre delicatamente l'ago.
Note: Puntura carotica comune può essere aiutata da afferrando il adventitia arterioso con una pinzetta e si sollevano delicatamente la parete frontale mentre si inserisce la punta dell'ago appena caudale fino al punto di sollevamento (Figura 2A). Questo riduce il rischio di colpire la parete posteriore con l'ago. - Con diversi rilievi di garza dispiegato, creare un nido per posizionare la siringa usata per infusioni. Posto questo nido di garza caudale al sito chirurgico.
- Mettere un 24 G IV-catetere sulla siringa con solo DMEM e stringere il catetere sulla siringa appena sufficiente per evitare perdite (la siringa verrà rimossa in seguito a questo intervento chirurgico) e piegare il catetere ~ 4 mm dalla punta affinché la curva tiene a circa 75° dopo il rilascio.
- Inserire il catetere IV arteriotomia carotidea comune fino al punto di curvatura e lavare il lume dell'innesto della vena due volte con 0,5 mL di DMEM. Per ogni ripetizione, riempire l'innesto della vena con DMEM. Quindi rimuovere il DMEM dall'innesto premendo leggermente con un dito guantato all'estremità cranica dell'innesto. Far scorrere delicatamente il dito verso l'estremità caudale dell'innesto per scovare il contenuto luminale tramite arteriotomia.
- Rimuovere la siringa DMEM dal catetere, lasciando il catetere nel vaso. Collegare la siringa contenente la soluzione di virus, assicurandosi che nessuna aria entra il catetere. Spostare che la seta senza bloccare annodata lega giù l'arteria fino a quando sono intorno alla punta del catetere, ma non serrarle.
- Infondere 0,03 mL di soluzione di virus per spingere il restante DMEM fuori il catetere. Rimuovere tutto il fluido dal lume dell'innesto della vena con un dito, premendo delicatamente da craniale a caudale.
- Stringere i due legami intorno alla punta dell'arteria e catetere per sigillare il lume. Iniettare la soluzione di virus fino a quando la vena è dilatata. Appoggiare delicatamente la siringa verso il basso sul nido di garza.
Nota: È fondamentale che l'innesto della vena si espande al suo calibro pre-trasduzione e rimane gonfiato durante l'infusione di virus. In caso contrario, l'importo del trasferimento genico sarà diminuita significativamente. - Lasciare la soluzione contenente virus nel lume dell'innesto della vena per 20 min e quindi sostituire la siringa contenente virus collegata al catetere con una siringa vuota. Fino a quando la nave collassa, delicatamente di aspirare la soluzione contenenti virus dall'innesto. Rimuovere la siringa, lasciando il catetere in posizione. Tagliare e sciogliere i punti di sutura seta e ritirare il catetere dalla nave. Rimuovere il catetere dall'arteria carotica attentamente per evitare di danneggiare l'endotelio.
- Con l'ausilio del microscopio chirurgico, è necessario chiudere l'arteriotomia con sutura in polipropilene 7-0 utilizzando un modello di X (Figura 2B).
- Afferrare la sutura con un porta-aghi, immettere il vaso in basso a destra di arteriotomia e uscire il vaso in basso a sinistra. Attraversare l'apertura all'esterno della nave e fare il secondo passaggio da in alto a destra in alto a sinistra.
- Prima di serrare la sutura, brevemente rilasciare la clip vascolare cranica per svuotare aria e virus residuo dall'innesto della vena e dell'arteria. Il sangue scorrerà fuori arteriotomia quando il morsetto viene rilasciato.
- Nelle vicinanze l'arteriotomia tirando delicatamente la sutura finisce e legarli insieme a 2 nodi quadrati.
Nota: Tirare la sutura troppo stretta causerà Trefolatura del tessuto che disturba il flusso, aumenterà il rischio di trombosi e potenzialmente introdurre variabili incontrollate.
- Rilasciare la clip vascolare cranica, quindi il clip caudale. Bloccare qualsiasi emorragia utilizzando garza per applicare una leggera pressione.
- Intorno a questo tempo, iniettare buprenorfina (SQ, 0,02 mg/kg) per fornire l'analgesia postoperatoria fino a quando la patch fentanil ha fornito analgesico fentanil i livelli del plasma.
Nota: Un'iniezione di buprenorfina aggiuntive (SQ, 0,02 mg/kg) può essere necessario 6 h dopo la prima iniezione per mantenere l'analgesia, fino a quando il fentanil plasma raggiunge una concentrazione terapeutica. - Ripetere il protocollo di infusione di virus sul lato sinistro, seguenti passi 4.4.5-4.4.15.
- Chiusura della ferita
- Chiudere il tessuto sottocutaneo con sutura PGA 5-0, utilizzando un modello continuo. Chiudere la pelle con sutura PGA 3-0 utilizzando un modello intradermico. Seppellire i nodi su entrambe le estremità.
- Cura, pulizia e recupero post-operatorio
- Seguire il passaggio 2.4.
5. harvest chirurgia (Terminal)
- Prepara gli strumenti e il sito chirurgico.
- Seguire i passi 2.1.1-2.1.3 in chirurgia dell'innesto della vena.
- Lasciate che l'assistente aprire e asetticamente posto sul tavolo dello strumento (o passare al chirurgo): una siringa da 20 mL, un ago 21G, sutura seta 3-0 e una sonda di flusso di sangue sterile.
- Attenersi alla seguente procedura 2.1.5-2.1.6 e 2.1.8 chirurgia dell'innesto della vena.
- Isolamento delle arterie carotiche comuni e gli innesti della vena
- Tagliare la pelle con l'elettrocauterio lungo la linea mediana tra la tacca di sternal e la mandibola (circa 7-9 cm di lunghezza) e la fascetta della pelle del collo del coniglio per gli asciugamani con morsetti di asciugamano.
- Verso l'estremità caudale, fare un breve taglio laterale attraverso la fascia con l'elettrocauterio. Senza mezzi termini sezionare sotto la fascia lungo il midline intero. Tagliare lungo la fascia sezionata lungo la linea mediana con l'elettrocauterio.
- Iniziare sul lato destro. Sezionare tra il muscolo sternohyoid sovrastante la trachea e i muscoli a forma di V sternocephalic per esporre l'innesto carotico e vena comune.
- Sezionare l'innesto della vena destra e dell'arteria carotica comune libero dai tessuti circostanti. Utilizzare i loop di silicone chirurgico per la retrazione dell'arteria e l'innesto della vena durante la dissezione.
- Ripetere la dissezione sul lato sinistro, seguendo la procedura 5.2.3-5.2.4.
- Effettuare misure di flusso seguendo passaggi 4.3.1-4.3.3 nella chirurgia di trasferimento del gene.
- Raccolta degli innesti della vena
- Con sutura seta 3-0, legare l'arteria carotica comune di destra cranica all'innesto. Poi legare la carotide caudale all'innesto.
- Asportare l'innesto della vena destra dividendo la carotide adiacente tra tutte le legature e l'anastomosi adiacente. Rimuovere l'innesto della vena del coniglio e lavare il lume con soluzione fisiologica.
- Tagliare l'arteria carotica e l'anastomosi da entrambe le estremità dell'innesto della vena. Tagliare il tessuto adventitial in eccesso lontano dall'innesto della vena e tagliare l'innesto in segmenti come necessario per le analisi di endpoint di tipo diverso.
- Raccogliere l'innesto della vena sinistra ripetendo i passaggi 5.4.1-5.4.3.
- Iniettare 1 mL di fenitoina/pentobarbital IV per eutanasia il coniglio.
- Smaltire qualsiasi rifiuti seguenti protocolli appropriati per biohazard e smaltimento dei rifiuti di sharps.
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Representative Results
La competenza tecnica di un nuovo operatore deve essere convalidata prima che l'operatore può utilizzare questo metodo per generare dati sperimentali. La prima pietra miliare che deve realizzare un nuovo operatore è la pervietà dell'innesto della vena coerente dopo l'ambulatorio iniziale l'innesto della vena e la trasduzione in ritardo l'ambulatorio successivo. Oltre il 90% la pervietà dopo ciascuno degli ambulatori è auspicabile e realizzabile. L'evidenza può essere valutata in modo non invasivo mediante ecografia transcutanea, che eseguiamo in genere il giorno postoperatorio 5-7. Nei conigli con brevettuale vene, l'esame di ultrasuono rivelerà un grande vaso sanguigno con flusso di sangue caudale--craniale spira su entrambi i lati del collo anteriore (Figura 3A). Se uno degli innesti della vena è occlusa, non ci sarà nessun flusso sanguigno caudale--craniale rilevabile sul lato con l'innesto occluso. Tuttavia, il flusso sanguigno cranico-caudale verrà comunque rilevato nella vena giugulare interna (Figura 3B).
La seconda pietra miliare che deve realizzare un nuovo operatore è efficiente trasduzione delle cellule endoteliali di vena-innesto. Qui, un vettore adenovirale che esprime la β-galattosidasi viene utilizzato per valutare l'efficienza del trasferimento genico endoteliale. Un nuovo operatore nel nostro laboratorio trasdotte innesti della vena con un adenovirus esprimendo la β-galattosidasi (AdnLacZ) utilizzando i metodi descritti. Gli innesti sono stati raccolti 3 giorni dopo la trasduzione e tagliato a spicchi. Alcuni segmenti sono stati macchiati con 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal). En face imaging delle superfici luminale ha mostrato gli innesti della vena con trasduzione efficiente (Figura 4A) e poveri trasduzione (Figura 4B). Per valutare ulteriormente la competenza di un nuovo operatore, β-galattosidasi mRNA negli estratti dell'innesto della vena trasdotte viene anche misurata mediante PCR quantitativa della trascrittasi inversa-mediata e normalizzare il segnale al livello di fosfato della gliceraldeide deidrogenasi (GAPDH) mRNA misurato in innesti della vena stessa.
I livelli di mRNA di β-galattosidasi in innesti di vena trasformata dall'operatore new non erano significativamente differenti dai livelli di mRNA di β-galattosidasi in innesti di vena trasformata da un operatore esperto (Figura 5). Se campioni di mRNA dagli innesti di vena trasformati da un operatore esperto non sono disponibili per il confronto, gli innesti innesto della vena di controllo negativo che mRNA può essere generato da transducing vena con un vettore di controllo non esprimendo (AdNull). Abbiamo trovato che i livelli medi di β-galattosidasi mRNA in vena innesti trasformati da un operatore esperto sono circa 1.000 superiori il segnale di PCR di fondo per β-galattosidasi mRNA misurato negli innesti trasdotte AdNull (Figura 5) .
Figura 1 . Il posizionamento di un invertito esterna destra vena giugulare a destra comune dell'arteria carotica innesto con anastomosi del fine--lato. L'innesto della vena (blu) viene suturata all'arteria carotica comune (rosso) alle due anastomosi. Presso ogni anastomosi, punti (bianco x) sono numerate nell'ordine in cui sono collocati. Per entrambi le anastomosi, cucire 1 suturare l'estremità caudale della arteriotomia alla vena giugulare esterna. Cucire 2 suture cranica fine arteriotomia alla vena giugulare esterna. Punto 3 è posizionato sulla parte laterale dell'anastomosi in un punto equidistante dai primi due punti di sutura. Punto 4 viene inserito sul lato mediale dell'anastomosi, equidistante dai primi due punti e di fronte al punto 3. Quattro ulteriori punti (punti 5-8) sono collocati a metà strada tra i quattro punti esistenti. Il segmento dell'arteria carotica tra le anastomosi è legato ad entrambe le estremità con punti di sutura in seta 3-0 (frecce) e diviso (linea tratteggiata) a metà strada tra le legature. Innesti di sinistra-parteggiato vengono eseguiti in modo simile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . La creazione e la chiusura di un'arteriotomia carotidea. (A), il adventitia dell'arteria carotica comune è afferrata vicino l'innesto della vena con una pinzetta e trazione verso l'alto viene applicata alla parete dell'arteria. Questo crea una superficie verticale, permettendo l'ago 21G piegato da inserire approssimativamente parallelo al lume del vaso, diminuendo il rischio di perforare la parete posteriore dell'arteria. (B) l'arteriotomia viene suturata con polipropilene 7-0 in un modello X. Il primo passaggio di sutura entra il lume dell'arteria nella parte inferiore destra dell'arteriotomia (sito 1) ed esce il lume in basso a sinistra (sito 2). La sutura attraversa quindi l'arteriotomia. La passata successiva ri-entra il lume in alto a destra (sito 3) ed esce il lume in alto a sinistra (posto 4). Lieve trazione sulle estremità della sutura (le estremità uscire dal sito 1 e sito 4) chiude l'arteriotomia. Le estremità della sutura sono legate con 2 nodi quadrati. I solidi cerchi blu indicano le posizioni dove la sutura penetra la parete arteriosa. Le linee blue continue indicano dove la sutura passa di fuori della parete arteriosa; linee blu tratteggiate indicano che la sutura si trova all'interno del lume. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Immagini ecografia transcutanea del collo di coniglio, valutare l'evidenza dell'innesto della vena 5-7 giorni dopo l'innesto. (A) brevetto innesto della vena (rosso) con flusso sanguigno in direzione caudale--craniale viene indicata (freccia). (B) occluso della vena dell'innesto. Nessun flusso sanguigno caudale--cranica (che apparirebbe rosso) viene rilevato. La vena giugulare interna (blu) con flusso sanguigno in direzione cranio-caudale è indicata (asterisco). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . L'espressione del transgene beta-galattosidasi in innesti di vena. 28 giorni dopo l'innesto, gli innesti della vena di coniglio erano microlavorati in un'incubazione di 20 min di vettori adenovirali esprimendo la β-galattosidasi all'interno dei lumen degli innesti di vena chirurgicamente isolato. Gli innesti della vena sono state raccolte 3 giorni dopo la trasduzione e macchiato con 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside. (A) En face immagine della superficie luminale di un segmento di vena risultati trasduzione efficiente. (B) En face immagine della superficie luminale di un segmento di vena risultati trasduzione del povero. Barra della scala = 1,0 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Espressione del transgene di beta-galattosidasi (β-gallone) mRNA nei segmenti dell'innesto della vena. 28 giorni dopo la disposizione degli innesti di interposizione della vena giugulare in carotidi di coniglio, gli innesti sono state trasdotte con un vettore adenovirale esprimendo la beta-galattosidasi (AdnLacZ) o con un vettore adenovirale di controllo che non esprime un transgene (AdNull ). Gli ambulatori sono stati completati da un operatore esperto (chirurgo 1) o un nuovo operatore (chirurgo 2). Gli innesti della vena trasformati con AdnLacZ erano tutti raccolti 3 giorni dopo la trasduzione. RNA Estratto da innesti trasdotte con AdNull e raccolto 14 giorni dopo la trasduzione inoltre è stata analizzata, come controllo negativo. L'espressione del mRNA della beta-galattosidasi è stato quantificato mediante PCR quantitativa della trascrittasi inversa-mediata, con valori normalizzati a deidrogenasi di fosfato della gliceraldeide mRNA misurato negli estratti stessi ed espresso in unità arbitrarie (AU). Le barre indicano valori medi; valori di p sono da somma-rank test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Punti critici in questo protocollo comprendono la gestione dell'anestesia, anticoagulazione manipolazione chirurgica della vena arteria/innestato e misure emodinamiche della vena innestata. Corretta gestione dell'anestesia è critico in questo modello di chirurgia multipla di sopravvivenza che include due operazioni relativamente lunghe (in genere 3-3.5 h per l'innesto bilaterale della vena e 1.5-2.5 h per trasduzione dell'innesto bilaterale). Abbiamo amministrato l'anestesia con una punta conica e con intubazione endotracheale e trovato che l'intubazione migliorato la sopravvivenza dopo la chirurgia di trasduzione dell'innesto, possibilmente perché la ventilazione di pressione positiva impedisce l'atelectasia e associati insufficienza respiratoria. Conigli sono difficili a intubate e correlate a intubazione delle vie aeree il trauma può causare lo stridore post-operatorio. Tuttavia, le sfide e le complicazioni dell'intubazione sono un piccolo prezzo da pagare per il beneficio eliminando gran parte della morbilità perioperatoria e della mortalità connesso con l'intervento di innesto della vena.
L'anticoagulazione è essenziale al fine di prevenire la trombosi delle vene innestate, che può verificarsi dopo uno degli ambulatori di sopravvivenza. La trombosi sembra essere un evento postoperatorio iniziale, perché gli innesti di vena che sono brevetti sull'esame di ultrasuono transcutanea 5-7 giorni postoperatorio sono quasi sempre brevetti al momento della raccolta. Per prevenire la trombosi dopo il primo intervento chirurgico (i. e., l'innesto della vena), IV l'eparina viene somministrata prima della raccolta la vena giugulare esterna prima. Basato sull'emivita plasmatica dell'eparina nei conigli (1-2 h), una mezza dose aggiuntiva dell'eparina IV viene somministrata prima della raccolta la vena giugulare esterna controlaterale. Inoltre, fino al completamento di entrambe le anastomosi arterovenose di un innesto della vena individuale, abbiamo lumi dell'arteria carotica e l'innesto della vena circa ogni 8 minuti con soluzione salina eparinizzata. Per evitare la trombosi dell'innesto, si dovrebbe prestare attenzione per non danneggiare la vena dell'innesto-soprattutto l'endotelio-durante la raccolta e l'innesto. Questo include delicata manipolazione della vena con strumenti chirurgici e lasciando un sottile strato di tessuto adiposo adventitial attaccato alla vena. Abbiamo anche amministrare una singola dose di papaverina d'attualità alla carotide innestate, per prevenire o vasospasmo inversa, che potrebbe contribuire a trombosi.
Meticolosa attenzione alla tecnica chirurgica è necessaria durante la vena aortocoronarico. Per evitare il sanguinamento alle anastomosi, trombosi dell'innesto e l'introduzione di variabili emodinamiche incontrollate, i due arteriotomies deve essere di lunghezza appropriata. Se un'arteriotomia è troppo corto, la parete di ostial dell'innesto della vena sarà ridondante presso il sito dell'anastomosi, creando lacune che consentono lo spurgo. Se l'arteriotomia è troppo lungo, che allunga la vena per coprire l'arteriotomia porterà la vena innesto pareti nelle immediate vicinanze, rendendo difficile per il chirurgo evitare la sutura della vena avversaria innesto pareti insieme (essenzialmente garantendo postoperatoria trombosi). Inoltre, se il lume dell'innesto della vena è ridotto perché la vena è stata allungata per coprire un'arteriotomia eccessivamente lungo, una stenosi verrà creata che aumenta la sollecitazione di taglio, predispone a trombosi33e potenzialmente altera come variabili di risultato neointimale crescita e vascolare che ritocca34,35. Inoltre, è importante evitare di introdurre l'innesto della vena, che potrebbe provocare restringimento del lume o flusso anomalo di colpi di scena. Al fine di evitare la torsione dell'innesto, abbiamo sempre allineare il segmento di vena lungo la superficie ventrale dell'arteria carotica comune e garantire che non siano attorcigliate nella vena. A causa del potenziale per variabile tecnica chirurgica alterare emodinamica dell'innesto della vena, e poiché alterata emodinamica può influire sulle variabili di risultato indipendentemente dal trattamento, misuriamo regolarmente diametro dell'innesto e del flusso di sangue prima dell'infusione di vettore e alle il tempo del raccolto. Utilizziamo questi valori per calcolare la sollecitazione di taglio e pulsatilità. Gli innesti della vena con misure emodinamiche fuori predeterminati intervalli possono essere esclusi oggettivamente da ulteriori analisi, diminuendo la variabilità sperimentale e aumentando il potere statistico.
Come abbiamo sviluppato questo metodo, abbiamo fatto diverse modifiche. Inizialmente, abbiamo tentato di trasferimento del gene dell'innesto della vena durante l'operazione di innesto. Tuttavia, in queste circostanze, l'espressione del transgene è stato quasi completamente perso da 3 giorni dopo gene transfer22. L'espressione del transgene è stato rapidamente perso se il segmento di vena era trasdotte in situ e poi innestato o se la vena è stata innestata in primo luogo e quindi trasdotte. Solo ritardando trasduzione fino a dopo l'innesto della vena aveva adattato per la circolazione arteriosa (abbiamo aspettato fino a 28 giorni dopo l'innesto per eseguire il trasferimento del gene, anche se un ritardo più breve potrebbe essere possibile), è stata la rapida perdita di espressione del transgene evitato22 . Abbiamo anche convertito dall'anestesia nosecone-consegnato all'anestesia endotracheale tubo-consegnato per il secondo intervento chirurgico (trasferimento del gene) dopo aver sperimentato morti intraoperatorie e postoperatorie. Inoltre, dopo l'incontro con polmonite di aspirazione apparente in un coniglio postoperatorio, abbiamo iniziato a collocare un piccolo tavolo di plastica sopra addome del coniglio (sotto i teli sterili). La tabella è stata posizionata per impedire che il chirurgo inavvertitamente appoggiato sull'addome del coniglio, potenzialmente stimolante aspirazione e malattia da reflusso gastroesofageo. Abbiamo non avuto nessun altro evento di aspirazione dopo il posizionamento della tabella. Tuttavia, perché questo posizionamento ha coinciso con il passaggio alla intubazione endotracheale, noi non possiamo essere sicuri quale intervento è responsabile per l'eliminazione di eventi di aspirazione.
Questo metodo presenta anche limitazioni. Negli Stati Uniti, l'uso di conigli invece di roditori richiede la conformità con i requisiti del laboratorio Animal Welfare Act del 1966. Di conseguenza, gli investigatori utilizzando conigli (o altri animali contemplati dalla presente legge) devono avere ben attrezzate sale operatorie e gli anestesisti esperti e fornire un elevato livello di controllo post-operatorio e la cura. La seconda limitazione è che 2 interventi chirurgici sono necessari al fine di garantire il transgene persistente espressione22. Il secondo ambulatorio aumenta il costo di esperimenti ed espone ogni coniglio per un ulteriore insieme di potenzialità operativa e complicanze perioperatorie. Tuttavia, non siamo consapevoli di qualsiasi altro approccio di trasferimento di gene che raggiunge l'espressione del transgene durevole negli innesti di vena. Il terzo limite di questo metodo è che richiede competenza nella costruzione di vettori di Jessica e preparazione degli stock HDAd alto-titolo. Molti laboratori hanno esperienza con la prima generazione adenoviral, lentivirale e adeno-associato di vettori virali (AAV), ma relativamente pochi gruppi hanno esperienza con Jessica e in genere sarebbero necessario instaurare una collaborazione per ottenere questo know-how. L'applicabilità clinica del metodo può anche essere limitata. Per gli esseri umani, un secondo intervento chirurgico aumenterebbe il rischio sia di costo che di complicazione. Inoltre, rispetto alle vene safena umane (utilizzate per interventi chirurgici di bypass coronarici e periferici), coniglio vene giugulari esterne hanno pareti molto sottili. È possibile che il muro di ispessimento e rimodellamento che si verifica dopo l'innesto della vena giugulare esterna un coniglio nella circolazione arteriosa potrebbe essere attenuato se l'innesto della vena ha già una parete più spessa. Infine, negli esperimenti in questo modello dura fino a 6 mesi, nessun delle vene innestate hanno sviluppato una stenosi22. Pertanto, questo metodo non sembra modellare tutti i processi biologici che contribuiscono a guasto dell'innesto della vena.
In conclusione, il metodo utilizza un robusto modello animale della malattia vascolare umano (conigli) per generare innestate vene in cui transgeni stabilmente sono espressi per periodi prolungati di tempo (almeno 6 mesi)22. Stabile espressione dei transgeni negli innesti di vena rivelerà loro ruoli in vena normale omeostasi del trapianto e chiariranno il loro potenziale per la terapia genica dell'innesto di vena. Il metodo potrebbe essere migliorato e reso più clinicamente applicabile tramite lo sviluppo di tecniche che consentono la consegna percutanea di vettori per l'innesto della vena, evitando così il secondo intervento chirurgico. Queste tecniche potrebbero essere basati su catetere36,37, o si potrebbero integrare appositamente preparati vettori sono iniettati in una vena periferica e quindi finalizzate alla parete dell'innesto della vena, per esempio da campi magnetici38. Il metodo consentirebbe anche test di vettori diversi da Jessica per la terapia genica dell'innesto della vena, tra cui vettori lentivirali e vettori AAV nonché vettori non virali. 39 , 40 , 41 , 42
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
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