Fabricação de língua matriz extracelular e reconstituição da língua Carcinoma de células escamosas In Vitro

Resumo

Um método é mostrado aqui para a preparação da matriz extracelular de língua (TEM) com decellularization eficiente. A temperatura pode ser usada como andaimes funcionais para a reconstrução de um modelo de carcinoma de células escamosas (TSCC) língua sob as condições de cultura estático ou mexido.

Resumo

A fim de construir um modelo eficaz e realista para língua escamosas carcinoma (TSCC) em vitro, os métodos foram criados para produzir decellularized língua matriz extracelular (TEM) que fornece andaimes funcionais para construção de TSCC. TEM fornece um nicho em vitro para crescimento celular, diferenciação e migração celular. As microestruturas de nativo da matriz extracelular (ECM) e composições bioquímicas retidas na matriz decellularized fornecem nichos de tecido-específica para ancoragem de células. Fabricação de temperatura pode ser realizada por digestão desoxirribonuclease (DNase), acompanhada de uma séria de pré-tratamento orgânico ou inorgânico. Este protocolo é fácil de operar e garante alta eficiência para o decellularization. A temperatura mostrou favorável cytocompatibility para células TSCC sob condições de cultura estático ou mexido, que permite a construção do modelo de TSCC. Um biorreator self-made também foi utilizado para a condição de mexido persistente para cultura de células. TSCC reconstruída usando TEM mostrou as características e propriedades, assemelhando-se a clínica histopatologia TSCC, sugerindo o potencial em investigação TSCC.

Introdução

A língua tem várias funções importantes, tais como deglutição, articulação e degustação. Assim, o comprometimento da função da língua tem grande impacto na qualidade de vida de^{1 pacientes}. A malignidade mais comum na cavidade oral é a língua carcinoma de células escamosas (TSCC), que normalmente ocorre em pessoas que bebem álcool ou fumam tabaco².

Nos últimos anos, pouco progresso foi alcançado na investigação fundamental na TSCC. A falta de investigação eficiente em vitro modelos permanece para ser um dos maiores problemas. Assim, a matriz extracelular (ECM) acaba por ser uma solução em potencial. ECM é um quadro de rede complexo composto de componentes de matriz altamente organizada, tendo um ECM-como a estrutura e a composição de materiais de andaime seria competentes para pesquisa do câncer. Decellularized ECM perfeitamente pode fornecer o nicho de células de mesma origem em vitro, que acaba por ser a mais significativa vantagem de ECM.

ECM pode ser mantido com componentes celulares, sendo retirados os tecidos através da decellularization, usando detergentes e enzimas. Vários componentes de ECM, incluindo colágeno, fibronectina e laminina na matriz decellularized fornecem um microambiente nativo-tecido-como para culturas de células, promovendo a sobrevivência, proliferação e diferenciação das células³. Além disso, a imunogenicidade para transplante pode ser reduzida a um nível mínimo, com a ausência de componentes celulares em ECM.

Até agora, os métodos de fabricação para ECM decellularized têm sido tentados em diferentes tecidos e órgãos, como coração^4,5,6,7, fígado^{8,9,10 ,11}, pulmão^{12,13,14,15,16,17}e^18,de rim^{19 , 20}. no entanto, nenhuma pesquisa relevante tem ser encontrado em trabalho semelhante na língua com o melhor de nosso conhecimento.

Neste estudo, matriz extracelular de língua decellularized (TEM) foi fabricada tanto de forma eficiente e barata por uma série de tratamento físico, químico e enzimático. A temperatura foi usada para recapitulate TSCC em vitro, mostrando uma simulação apropriada para o desenvolvimento e comportamento TSCC. TEM tem boa biocompatibilidade, bem como a capacidade de guiar as células para o nicho de tecido-específica, que indica que TEM pode ter grande potencial em TSCC pesquisa³. O protocolo mostrado aqui fornece uma escolha para pesquisadores estudando na patogênese ou terapias clínicas de TSCC.

Protocolo

Todo o trabalho animal foi efectuado de acordo com o ato do bem-estar animal, as orientações institucionais e aprovado pela Comissão de uso, Sun Yat-sen University e institucional Cuidado Animal.

1. preparação de TEM

1. Executar os ratos por deslocamento cervical e remover as línguas usando uma pinça e tesoura cirúrgica estéril.
2. Mergulhe as línguas em etanol a 75% por 3 min, em seguida, coloque cada língua em um 1,5 mL tubo Eppendorf (EP) com 1 mL de fosfato estéril de 10 mM em buffer solução (PBS).
   Nota: A concentração de PBS em todas as etapas a seguir é o mesma que a concentração nesta etapa.
3. Lise de células por congelar descongelar: congelar as línguas em tubos de EP a-80 ° C durante 1 h e depois descongelar as línguas à temperatura de 45 min por 3 ciclos.
4. Carregar a cada língua em um pedaço de sutura cirúrgica, usando uma agulha cirúrgica e enrole a extremidade da sutura com um pequeno pedaço de papel alumínio estéril. Execute a operação em um prato de cultura 3,5 cm ou 6 cm contendo 75% de etanol em condições estéreis.
   Nota: O comprimento adequado de cada pedaço de sutura cirúrgica é de cerca de 20 cm, e o tamanho adequado de cada pedaço de papel alumínio é cerca de 0,3 cm² (1 cm x 0,3 cm). A língua deve ser carregada perto o papel alumínio.
5. Enxague cada língua com 3 mL de PBS estéril em um prato de cultura 3,5 cm ou 6 cm por 30 s. executar esta operação em condições estéreis.
6. Lave a língua com água ultrapura: Adicionar ampicilina em um frasco de boca larga com 250 mL de água ultrapura esterilizada para uma concentração final de 90 µ g/mL. Colocar a língua no frasco que contém uma barra de agitação. Aperte a tampa de garrafa com parte da sutura permanecendo fora da garrafa. Execute esta operação em condições estéreis.
   Nota: Até 5 línguas podem ser colocadas no mesmo frasco na consideração de entrelaçamento da sutura. O papel alumínio é no final da sutura na garrafa para impedir que a língua deslizar fora. As línguas devem ser colocadas 2 cm de altura do fundo da garrafa, ajustando o comprimento da sutura permanecendo dentro da garrafa. Esta nota é também para etapas 1.8, 1.10, 1.12 e 1,16.
7. Coloque a garrafa em um agitador magnético para 12h.
8. Lave a língua com NaCl: Adicionar ampicilina em um frasco de boca larga com 250 mL de estéril 1 M NaCl a uma concentração final de 90 µ g/mL. Mova as línguas e a barra de agitação para a garrafa. Aperte a tampa de garrafa com parte da sutura permanecendo fora da garrafa. Execute esta operação em condições estéreis.
9. Coloque a garrafa em um agitador magnético para 24h.
10. Lise por Triton X-100 de célula: Adicionar ampicilina para uma concentração final de 90 µ g/mL em um frasco de boca larga com 250 mL de estéril 2% Triton X-100 em PBS. Mova as línguas e a barra de agitação para a garrafa. Aperte a tampa de garrafa com parte da sutura permanecendo fora da garrafa. Execute esta operação em condições estéreis.
11. Coloque a garrafa em um agitador magnético por 48 h.
12. Lave as línguas com CaCl₂/MgCl₂: Adicionar ampicilina em um frasco de boca larga com 250 mL de estéril 5 mM CaCl₂/MgCl₂ para uma concentração final de 90 µ g/mL. Mova as línguas e a barra de agitação para a garrafa. Aperte a tampa de garrafa com parte da sutura permanecendo fora da garrafa. Execute esta operação em condições estéreis.
13. Coloque a garrafa em um agitador magnético para 24h.
14. Digestão por DNase: adicionar 1 mL de Hank está equilibrada solução salina (HBSS) para cada tubo de EP. Adicionar DNase em HBSS, respectivamente, a uma concentração final de 300 µM. mover cada língua em cada tubo de EP, com parte da sutura do lado de fora do tubo. Execute esta operação em condições estéreis.
    Nota: Certifique-se de que a parte da sutura que permanece dentro as garrafas nas etapas anteriores também permanece no interior do tubo EP nesta etapa e certifique-se de que a parte da sutura que permanece fora as garrafas nas etapas anteriores também permanece fora do tubo EP nesta etapa.
15. Incube as línguas em tubos de EP a 37 ° C por 24 h.
16. Lave a língua com PBS: Adicionar ampicilina em um frasco de boca larga com 250 mL de PBS estéril para uma concentração final de 90 µ g/mL. Mova as línguas e a barra de agitação para a garrafa. Aperte a tampa de garrafa com parte da sutura permanecendo fora da garrafa. Execute esta operação em condições estéreis.
17. Coloque a garrafa em um agitador magnético para 24h.
18. Armazene a temperatura preparada em PBS estéril, a 4 ° C até o uso.

2. tridimensional (3D) reconstituição de TSCC

1. Construção de modelo estática TSCC
   1. Semente de 1,0 x 10⁶ TSCC células únicas (Cal27) em um prato de cultura de 3,5 cm. Adicione 3 mL de Dulbecco modificado da águia médio/F12 (DF12) contendo 10% fetal de soro bovino (FBS), 90 µ g/mL ampicilina e 90 µ g/mL canamicina.
   2. Células de cultura a Cal27 a 37 ° C por 2 a 3 dias. Certifique-se que as células cobrem pelo menos 60% a área da parte inferior do prato.
   3. Carregar TEM para a monocamada Cal27 a placa de cultura.
   4. Coloque o prato em uma incubadora de CO₂ a 37 ° C por 28 dias.
   5. Atualize o meio de cultura todos os dias durante o processo de cultura de células. A concentração de CO₂ na incubadora é de 5%.
2. Construção de modelo mexida TSCC
   1. Preparação de um self-made minibioreactor mexido
      1. Retire o êmbolo de uma seringa de 10 mL.
      2. Escavar um furo (diâmetro de 1 cm) perto do terminal inferior da haste e carregar uma barra de agitação no buraco.
      3. Cavar um buraco (de 0,5 cm de diâmetro) no centro da rolha de uma garrafa de plástico de boca larga e colocar a haste do pistão através da tampa.
      4. Cortar a metade de um tubo de centrífuga de 50 mL e solda-lo no lado exterior da tampa da garrafa.
      5. Anexe anzóis na haste envolvendo a haste com linhas de pesca, que são amarrados para os anzóis.
         Nota: Até 4 anzóis podem ser anexados a uma haste.
      6. O complexo auto-suficiente antes do uso de autoclave.
         Nota: Fazer não Autoclavar o frasco plástico de boca larga. Use um novo frasco plástico estéril de boca larga, enquanto o cultivo de células.
3. Cultura celular dinâmico
   1. Semente de 1,0 x 10⁶ Cal27 células únicas no self-made minibioreactor. Adicione 150 mL de meio de DF12 que contém 10% FBS, 90 µ g/mL ampicilina e canamicina 90 µ g/mL.
   2. Carregar TEM para o minibioreactor usando anzóis anexados à haste.
   3. Aperte a tampa do frasco e colocar o minibioreactor em um agitador magnético. Ative o minibioreactor a 200 rpm numa incubadora de CO₂ a 37 ° C por 7 a 14 dias.
      Nota: A concentração de CO₂ , a incubadora de CO₂ é de 5%.

Resultados

Este protocolo para a preparação de TEM acaba por ser eficiente e adequada. A temperatura mostrou decellularization perfeito, em comparação com os tecidos de língua nativa. A eficácia do decellularization foi confirmada pela hematoxilina-eosina (HE) coloração (Figura 1A-B). O HE coloração resultados revelados completo desaparecimento da coloração nuclear na temperatura (Figura 1B). Além disso, co...

Discussão

Um protocolo bem estabelecido para a fabricação de ECM decellularized deve manter a composição de ECM nativa ao remover componentes celulares nos tecidos quase completamente²¹. Apesar de protocolos decellularization atualmente relatado que exigem perfusão através de vasculatura para remover materiais celulares por transporte convectivo, agitação mecânica foi adotada aqui, conhecido como um método simples e barato tradicional^{22 , 23 ,<...}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos C57-BL / 6J	Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
Etanol	Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos	HB15-GR-2.5L
Cloreto de sódio	Sangon Biotech	A501218
Cloreto de potássio	Sangon Biotech	A100395
Fosfato de sódio dibásico Fábrica	reagentes	químicos de GuangzhouBE14-GR-500G
Fosfato de Potássio Monobásico	Sangon Biotech	A501211
Tubo EP de 1,5 mL	Axygen	MCT-150-A
Freezer de temperatura ultra-baixa	Thermo Fisher Scientific
3,5 cm	Thermo Fisher Scientific	153066
6 cm	Greiner	628160
Triton X-100	Sigma-Aldrich	V900502
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	746495
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	449164
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Sulfato de magnésio	Sangon Biotech	A601988
Glicose	Sigma-Aldrich	158968
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S5761
Ampicilina	Sigma-Aldrich	A9393
Canamicina	Sigma-Aldrich	PHR1487
Sutura cirúrgica	Shanghai Jinhuan
250 mL frasco de boca larga	SHUNIU	1407
Agitador magnético	AS ONE	1-4602-32
CO2 incubadora	SHEL LAB	SCO5A
Seringa de 10 mL	Hunan Pingan
50 mL tubo de centrífuga	Greiner	227270
Célula Cal27	Academia Chinesa de Ciências, Banco		Linha celular de carcinoma de células escamosas de língua
Célula U2OS	Academia Chinesa de Ciências, Banco		Linha celular de osteossarcoma humano
DMEM / F12	Sigma-Aldrich	D0547
Piruvato de sódio	Sigma-Aldrich	P5280
Ácido livre de hepes	BBI
FBS	Hyclone	SH30084.03
4 ° Refrigerador C	Haier
Purificador de água	ELGA
Hemocitômetro	BLAU	717805

de Placa de cultura de células Placa de cultura de células de Células de Xangai de Células de Xangai A600264