Específicos e detecção precisa do Using PCR convencional em amostras de tecido de folhas cítricas cítricas Greening patógeno Candidatus liberibacter spp.

Resumo

Cítrica Greening é uma doença particularmente destrutiva afetando culturas cítricas globalmente. Apresentado aqui é um método simples usando PCR e extração de DNA genômica de tecido foliar de citrinos para a identificação precisa e exacta do patógeno ecologização citros, Candidatus liberibacter spp.

Resumo

Cítrica greening, também conhecida como Greening, é uma doença de citrino destrutiva devastando fazendas cítricas globalmente. Esta doença causa manchas assimétrica folha amarela, veia amarelamento, desfolha, cárie de raiz e, finalmente, a morte da planta cítrica. Quando infectadas, as plantas cítricas têm atrofiado crescimento e produzem flores fora de época. Estas flores raramente produzem frutos, e aqueles que produzem frutas cítricas pequenas, amargas, de forma irregular que não são desejáveis. Esta doença é transmitida pelos asiáticos citrinos psilídeos, Diaphorina citri e o enxerto de tecido infectado de citrino. O patógeno tem um período de incubação longo e variável dentro da planta de citros — às vezes anos, antes que os sintomas apareçam. Tentativas de cultura esse patógeno em vitro foram infrutíferas, possivelmente devido a baixa e desigual concentração do patógeno dentro infectado tecido cítrico, ou porque é difícil replicar o ambiental condições favorável para o crescimento de o patógeno. É muito difícil identificar a doença antes que ela se espalhou, devido ao seu longo período de incubação e a incapacidade dos investigadores à cultura do patógeno. Como resultado, a doença só se torna aparente depois de repente destruindo todo rendimento do agricultor um citrino. Apresentado aqui é um método para a deteção de precisa e específica do patógeno ecologização citros, Candidatus liberibacter spp. usando um kit de extração de DNA genômico e PCR. Este método é simples, eficiente, rentável e adaptável para análise quantitativa. Esse método pode ser adaptado para uso em qualquer tecido de citrino; no entanto, potencialmente é limitada pela quantidade de patógenos presentes no tecido. No entanto, esse método permitirá citros agricultores identificar plantas cítricas infectadas anteriormente e conter a disseminação desta doença destrutiva antes de ele pode espalhar ainda mais.

Introdução

Cítrica greening, também conhecida como Greening, causou uma perda significativa de árvores de citrinos. Um caso representativo é Flórida, onde a doença está prevista para causar uma redução de 70% na produção de caixas de laranja Florida de 244 milhões de caixas na temporada 1997-1998 para 70 milhões de caixas a partir da temporada de 2016-2017¹. Mais de 90% das árvores cítricas na Flórida são infectadas², e estima-se que a indústria de citros Florida perde cerca de 1 bilhão de dólares cada ano devido a doenças cítricas, onde cítrica greening desempenha um papel importante³. Cítrica greening é espalhada principalmente pelos psilídeos cítricos asiáticos invasivo Diaphorina citri, mas também pode ser transmitida por enxertia de tecido infectado. A doença causa amarelecimento das veias, manchas assimétrica folha amarela, desfolha prematura, dieback do galho, cárie de raiz e morte da planta. Importante, a doença causa a planta cítrica produzir flores fora de época, que raramente produzem frutos. A fruta que é produzida por plantas cítricas infectadas é imaturos, verde e amargo sabor⁴.

A finalidade desse método é exatamente e precisamente identificar a bactéria motile Candidatus liberibacter spp., o agente causador da cítrica greening, vivendo dentro do floema de árvores cítricas infectados⁵. DNA genômico é extraído do tecido da folha inteira, que contém a bactéria viva. Este DNA genômico extraído é usado como um modelo para o PCR convencional, onde oligonucleotídeos complementares a sequência de rDNA 16S da bactéria são utilizados para amplificar esta sequência. Oligonucleotídeos complementares a um gene de caixa cítrico são usados como um controle interno de amplificação. Nós escolhemos usar esse método, porque provou ser bem sucedido na anterior pesquisa⁶.

Este método tem a vantagem de ser simples, relativamente barato e capaz de ser realizado em qualquer laboratório de bioquímica normalmente equipado. Além disso, PCR continua a ser o método mais exato e preciso para detectar este patógeno, devido à dificuldade de cultivo deste patógeno⁷e capacidade do patógeno sobreviver e reproduzir-se durante anos dentro de um hospedeiro assintomático⁸. Muitos ensaios PCR de especialidade diferentes foram usados para detectar com sucesso este patógeno; no entanto, PCR convencional permanece o ensaio mais simples para a deteção de preciso e específico, especialmente dentro de hospedeiros assintomáticos⁸.

Protocolo

1. isolar o DNA genômico de tecidos vegetais, usando um Kit de extração de genômica

1. Obter o tecido foliar cítricas cortando uma toda nova folha de uma árvore citros usando a tesoura limpa e coloque a folha em um saco plástico limpo.
   Nota: A bolsa contendo o tecido foliar deve ser colocada em um frigorífico de 4 ° C ou em gelo em um recipiente isolado logo que possível após a coleta para evitar a deterioração.
2. Adicione uma pequena quantidade de nitrogênio líquido para acalmar um almofariz e um pilão. Enquanto eles são de arrepiar, use uma tesoura para cortar um pequeno pedaço de tecido foliar, aproximadamente 1 polegada quadrada em tamanho. Coloque o tecido cortado o almofariz congelá-lo instantaneamente. Adicione mais nitrogênio líquido, se necessário.
   Nota: Luvas isoladas devem ser sempre usadas durante a manipulação de nitrogênio líquido.
3. Triture rapidamente o tecido de planta em um pó fino, usando a argamassa. Continue a moagem até o nitrogênio líquido evapora-se completamente, e continua a ser um pó fino de verde.
4. Brevemente relaxar uma espátula de metal em nitrogênio líquido para 10-15 s e, em seguida, colher o tecido do chão dentro a argamassa em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, utilizando a espátula.
5. Adicione 600 µ l de solução de lise de núcleos (consulte Tabela de materiais) usando um 1000 µ l Pipetar e vortex a amostra para 1-3 s, então incubar em banho de água de 65 ° C por 15 min.
6. Adicionar 3 µ l de solução de RNase o lisado usando uma pipeta de 10 µ l, inverta o tubo 2 - 5 vezes para misturar e incubar a 37 ° C numa incubadora do armário por 15 min.
   Nota: Deixe a mistura arrefecer à temperatura ambiente antes de prosseguir.
7. Adicione 200 µ l de solução de precipitação de proteínas, vórtice em alta velocidade por 20 s e, em seguida, centrifugar por 3 min a 13.000 x g, para formar uma bolinha firme. Enquanto a amostra está sendo centrifugada, adicione 600 µ l de isopropanol de temperatura para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
8. Utilizando uma pipeta de µ l 1000, remova cuidadosamente o sobrenadante da amostra centrifugada, transferindo-o para o tubo de microcentrifugadora fresca 1,5 mL contendo isopropanol. A pelota agora pode ser descartada.
   Nota: Não poluir o sobrenadante com proteína, deixando uma quantidade minúscula de sobrenadante acima a pelota.
9. Inverter o tubo, até que o DNA torna-se visível como uma massa de fios como fio e, em seguida, centrifugar a 13.000 x g por 1 min à temperatura ambiente.
10. Decante o sobrenadante, adicionar 600 µ l de etanol 70% para a pelota, inverta o tubo várias vezes para lavar o DNA e centrifugar a 13.000 x g por 1 min.
11. Cuidadosamente Aspire o etanol, deixando o pellet de DNA solta, em seguida, abra e inverter o tubo, descansando sobre papel absorvente. Ar seco à temperatura ambiente por 15 min.
12. Adicionar 100 µ l de solução de reidratação de DNA ao pellet de DNA secas e, em seguida, incubar o DNA em um banho de água de 65 ° C durante 1 h, enquanto mistura periodicamente tocando o tubo.
13. Coloque 1 µ l de água filtrada em uma microcuvette e inseri-lo em um espectrofotômetro para ser usado como um espaço em branco. Calcule a concentração de DNA presente colocando 1 µ l de amostra sobre o microcuvette, e inserindo o Espectrofotômetro. Concentração de DNA (ng / µ l) pode ser calculado como (₂₆₀- um₃₂₀) × diluição fator × 50 ng / µ l.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. A amostra pode ser armazenada a 4 ° C.

2. realizar PCR em amostras de DNA genômico

1. Combine 10 µ l 2 x PCR Master Mix (ver tabela de materiais), 1 µ l para a frente da primeira demão (pM 10 / µ l), 1 µ l reverso da primeira demão (pM 10 / µ l) (ver tabela 2 para sequências da primeira demão), 100 ng de DNA genômico extraído da amostra e purificado de água (volume final de até 20 µ l) em um 50 µ l do PCR tubo, filme para misturar e brevemente centrífuga.
2. Insira o tubo de PCR o thermocycler e executar em conformidade (ver tabela 1).
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Se necessário, armazene amostra a 4 ° C, após a reação é completa.

3. electrophorese o DNA amplificado em um Gel de Agarose

1. Pesar 0,4 g de pó de agarose e adicioná-lo juntamente com 1 buffer de x TAE a um limpo 200 mL frasco de Erlenmeyer, enchendo até 50 mL.
2. Microondas em alta por 1,5 min, agitando a cada 30 s, até agarose é totalmente dissolvido.
   Nota: Luvas isoladas devem ser usadas durante a manipulação de agarose líquido para evitar queimaduras.
3. Adicionar 2,5 µ l de brometo de etídio 10mg/mL para o líquido do agarose e agitar a mistura e, em seguida, despeje o gel de agarose líquido em um molde de gel de nível. Inserir rapidamente pentes padrão 12-dente gel depois de derramar.
4. Permitir que o gel para esfriar por 20 min em temperatura ambiente e, em seguida, remover o gel de pentes e colocar o gel em uma caixa de gel nível preenchida com 1 x TAE buffer.
5. Utilizando uma micropipeta, carrega as amostras de DNA amplificadas totais em poços. Adicione 5 µ l de DNA da escada (ver Tabela de materiais) em um poço separado de suas amostras.
6. Electrophorese as amostras por 35 min em uma constante de 90 V, retire o gel e coloque em um transiluminador UV.
7. Fotografar e analisar o gel de borda padrão enquanto estiver usando transiluminação UV no 302 nm.

Resultados

Um resultado positivo produz uma banda distinta correspondentes a 500 bp para Candidatus Liberibacter asiaticus Lss/Las606⁶, e/ou uma banda distinta, correspondente a 700 bp para Laa2/Laj5, inserida a β ribosomal 16S operon⁹. A banda de controle interno de amplificação também deve aparecer em 400 bp. Esta banda corresponde a amplificação do gene cítricas caixa ¹⁰e deve apar...

Discussão

É fundamental que todos os passos são seguidos exatamente para alcançar as melhores condições experimentais. Tecido de folha inteira foi usado durante esta demonstração; no entanto, o protocolo pode ser modificado para incluir teoricamente qualquer tipo de tecido de planta. Anteriormente, investigadores extraído DNA genômico de tecido de veia foliar, ao invés de tecido foliar inteira e alcançado semelhantes resultados¹¹. Se a banda correspondente ao gene de citrinos caixa não comparecer, ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Purificação de DNA Genômico Wizard	Promega	A1120	Fonte de Núcleos Soluções de Lise, RNase, Precipitação de Proteínas e Reidratação de DNA
Nitrogênio líquido	Air Products	N/A
Mastercycler pro com painel de controle	Microondas Eppendorf	6321000019
1250 W	Centrífuga	N/A
5424	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 banho-maria digital	Fisher scientific	15-462-15Q
Espátula de metal	Sigma-Aldrich	Z283274
Almofariz e pilão	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Misturador de vórtice	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Estéril 10 μ L pontas	TipOne	1161-3730
Estéril 200 μ L pontas	TipOne	1163-1730
Estéril 1250 μ Pontas L	TipOne	1161-1750
Kit de pipetador de volume variável	VWR	75788-460
Brometo de etídio	Sigma-Aldrich	E1510
Agarose	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Ácido acético	Fisher Chemical	A38-212
Base Tris	Sigma-Aldrich	10708976001
μ cubeta	Eppendorf	6138000018
Bandeja de fundição empilhável e pentes	Carolina	213655
PowerPac Fonte de alimentação básica	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT System	Bio-Rad	1704487EDU
Bioespectrômetro básico	Eppendorf	6135000009
0,2 mL Tubos de PCR	Fisher scientific	AB-0620
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Forward Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Reverse Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Água, grau PCR	Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ Escada de DNA	Thermo Fisher Scientific	10787018