Esta comunicação descreve metodologias para isolamento e cultura de macrófagos alveolares dos humanos e modelos murino para fins experimentais.
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Artigo de método
Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os macrófagos alveolares são macrófagos terminalmente diferenciados, pulmão-residente de origem pré-natal. Os macrófagos alveolares são únicos em sua longa vida e o seu importante papel no desenvolvimento pulmonar e função, bem como suas respostas pulmão-localizada a infecção e inflamação. Até à data, nenhum método unificado para identificação, isolamento e manipulação dos macrófagos alveolares com os humanos e ratos existe. Esse método é necessário para estudos sobre essas células imunes inatas importantes em várias configurações experimentais. O método descrito aqui, que pode ser facilmente adoptado por qualquer laboratório, é uma abordagem simplificada para colheita de macrófagos alveolares de líquido de lavagem broncoalveolar ou de tecido pulmonar e mantê-los em vitro. Porque os macrófagos alveolares ocorrem principalmente como células aderentes no alvéolo, o foco desse método é desalojá-los antes da colheita e identificação. O pulmão é um órgão altamente vascularizado, e vários tipos de células de origem mieloide e linfoide habitam, interagem e são influenciados pelo microambiente do pulmão. Usando o conjunto de marcadores de superfície descrita aqui, pesquisadores podem facilmente e de forma inequívoca distinguir outros leucócitos macrófagos alveolares e purificá-los para aplicações a jusante. O método de cultura desenvolvido neste documento suporta ambos humanos e macrófagos alveolares para multiplicação in vitro de rato e é compatível com estudos celulares e moleculares.
Introdução
O microambiente pulmonar é um ecossistema complexo exclusivamente com uma conduta de ar elaborada e vasculatura. O ar inalado viaja através da traqueia e inúmeras ramificações dos brônquios e bronquíolos antes de atingir os alvéolos, onde ocorre a troca de gás de ar-sangue. Devido à interação direta com a atmosfera, a superfície respiratória requer proteção contra os efeitos potencialmente prejudiciais de partículas suspensas no ar e poluentes. Uma série de barreiras físicas, químicas e imunológicas protege os pulmões. Nomeadamente, a implantação dos fagócitos na superfície respiratória serve um sistema importante primeira linha de defesa. Macrófagos alveolares (AMs) ....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) o cuidados de Animal institucional e o institucional Review Board (IRB), no Hospital e centro médico de St. Joseph.
1. isolamento de AMs do líquido de lavagem broncoalveolar murino (BAL)
- Anestesiar um rato C57BL/6 de oito semanas de idade com cetamina (87,5 mg/kg de peso) e xilazina (12,5 mg/kg de peso corporal) coquetel através de uma injeção intraperitoneal. Proceda quando rato atinja a anestesia cirúrgica com perda de reflexos e relaxamento dos músculos.
- Coloque o mouse sobre uma superfície de dissecação com o lado ventral virada para cima. Apl....
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Resultados
A abordagem de fluxo cytometric identificar rato AMs é mostrada na Figura 1. Isso inclui a análise de um conjunto mínimo de marcadores de superfície necessárias na distinção entre AMs de outros fagócitos residentes pulmonar ou pulmão infiltrando. É necessária análise diferencial de identificar positivamente AMs de intersticiais macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, monócitos e macrófagos derivados de monócitos pulmonares que ocorrem nos pulmões. O seg.......
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Discussão
MGA é macrófagos de pulmão-residente de vida longa que povoam os pulmões começando no nascimento e duradouro sobre a extensão de vida inteira26. Seus papéis na fisiologia pulmonar7 e patologia12 e seu potencial para prever de auto-imunidade pulmonar24 foram reconhecidos. Porque AMs tem uma presença de longo prazo em pulmões11,27 e porque eles estão envolvidos na ativaç.......
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Divulgações
Os autores têm sem conflitos de interesse para declarar.
Agradecimentos
Agradecemos a Clare Prendergast para obter assistência com o manuscrito de edição. DKN é suportado por uma pesquisa conceder (#2095) da Fundação Flinn e TM é suportada por concessões do National Institutes of Health (R01HL056643 e R01HL092514). DKN desenvolveu os métodos, projetou o estudo e escreveu o manuscrito; OM assistida com estudos em animais e recolha de amostra clínica; SB assistida com fluxo cytometric análise e classificação de célula; TM supervisionou os estudos e revisão do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução dissociante de células não enzimáticas | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Pomada Puralube Vet | Dechra | 620300 | |
| 22G Cateter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Sutura trançada de seda não absorvível | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| tampão de lise (Kit de RNA PureLink) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoetanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| Classificador de células FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Cetamina (Cetatesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xilazina (Analisado) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μ Filtro de célula M | Corning | 352360 | |
| Bloco Fc Humano | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Contador de Células Automatizado Countess II | Thermo Fisher Scientific | ||
| Solução Azul de Tripano | Thermo Fisher Scientific | ||
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Soro Fetal Bovino | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| linha celular L-929 | American Type Culture | Collection ATCC, CCL-1 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Corning | 30-002-CI | |
| Pyruvate de Sódio | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Frasco de cultura de tecidos | Thermo Fisher Scientific | ||
| prato de cultura de 60 mm | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| tubo cônico de 15 mL | Corning | 352097 | |
| tubo cônico de 50 mL | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa analisador de células | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Software de análise |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugado |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugado |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugado |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugado |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugado |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugado |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugado |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugado |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugado |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugado |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugado |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugado |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugado |
| Anti-CD45 (Humano) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugado |
| Anti-CD11b (Humano) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugado |
| Anti-HLA-DR (Humano) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugado |
| Anti-CD169 (Humano) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugado |
| Anti-CD206 (Humano) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugado |
| Anti-CD163 (Humano) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugado |
Referências
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages devel....
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Reimpressões e permissões
