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Artigo de método

Seguindo os movimentos de tecido endocárdico através de célula Photoconversion no embrião Zebrafish

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⸱

DOI:

10.3791/57290

⸱

20 de fevereiro de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2UMR7104, Centre National de la Recherche Scientifique, 3U964, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 4Université de Strasbourg

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método para o photoconversion de Kaede proteína fluorescente em células endocárdico dos vivos zebrafish embrião que permite o rastreamento de células endocárdico durante canal atrioventricular e desenvolvimento de válvula atrioventricular coração .

Resumo

Durante a embriogênese, as células passam por mudanças dinâmicas no comportamento da célula, e decifrar a celular lógica por trás destas mudanças é um objetivo fundamental no campo da biologia do desenvolvimento. A descoberta e o desenvolvimento de proteínas photoconvertible grandemente ajudado nossa compreensão dessas mudanças dinâmicas, fornecendo um método para opticamente destacar células e tecidos. No entanto, enquanto photoconversion, microscopia de lapso de tempo e análise de imagens subsequentes provaram para ser muito bem sucedido na descoberta dinâmica celular em órgãos como o cérebro ou os olhos, essa abordagem geralmente não é usada no coração em desenvolvimento devido à desafios colocados pelo movimento rápido do coração durante o ciclo cardíaco. Esse protocolo consiste de duas partes. A primeira parte descreve um método para photoconverting e posteriormente de rastreamento células endocárdico (CDE) durante zebrafish canal atrioventricular (AVC) e desenvolvimento de válvula atrioventricular coração. O método envolve temporariamente parando o coração com uma droga em ordem para photoconversion preciso tomar o lugar. Corações são permitidas para continuar batendo em cima da remoção da droga e desenvolvimento embrionário normalmente continua até que o coração está parado novamente para geração de imagens de alta resolução de photoconverted CDE em um ponto mais tarde o tempo do desenvolvimento. A segunda parte do protocolo descreve um método de análise de imagem para quantificar o comprimento de uma região photoconverted ou não-photoconverted no AVC em embriões jovens mapeando o sinal fluorescente da estrutura tridimensional em um mapa bidimensional . Juntas, as duas partes do protocolo permite examinar a origem e o comportamento das células que compõem o zebrafish AVC e válvula cardíaca atrioventricular e potencialmente pode ser aplicado para estudar os mutantes, morphants ou embriões que tenham sido tratados com reagentes que perturbam o desenvolvimento de AVC e/ou válvula.

Introdução

O peixe-zebra é atualmente um dos mais importantes modelos para estudar processos celulares e do desenvolvimento na vivovertebrados. Isto é principalmente devido a transparência óptica do zebrafish e acessibilidade à genética, o que o torna um poderoso modelo para a aplicação de técnicas ópticas envolvendo geneticamente codificado photoresponsive proteína tecnologias1. Específico para o estudo do desenvolvimento do coração, zebrafish receber oxigênio suficiente através de difusão tal que até mesmo mutantes sem batimento cardíaco podem sobreviver a primeira semana de desenvolvimento, permitindo análises sobre os efeitos de genes de desenvolvimento e perturbado o fluxo de sangue na morfogênese do coração não é possível na maioria dos vertebrados,2.

O tubo de coração zebrafish é formado por 24 horas pós fertilização (hpf). Logo após sua formação, o tubo de coração começa a bater uma ativamente. Por 36 hpf, uma constrição clara separa o átrio do ventrículo. Esta região de constrição é chamado o canal atrioventricular (AVC) e células nessa região de alteração de uma morfologia escamosa a morfologia cuboidal3. Começa a morfogênese zebrafish válvula atrioventricular cerca de 48 h pós fertilização. Por 5 dias pós fertilização, dois folhetos da válvula se estendem até o AVC e prevenir o refluxo do sangue do ventrículo para o átrio durante o ciclo cardíaco4. Rastreamento de células durante a formação de AVC e a válvula é um desafio como a batida rápida do coração torna difícil seguir as células através de microscopia de lapso de tempo tradicional5,6. Este protocolo, adaptado do corcel et al, 20167, descreve um método que usa a Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)zebrafish transgênica linha8 , em que a proteína photoconvertible Kaede é expresso em células endoteliais, incluindo o endocárdio. A droga 2,3-butanodiona-2-monoxime (BDM) é usado para interromper temporariamente o coração batendo, permitindo photoconversion exata de CDE entre 36 e 55 hpf e imagens de alta resolução de photoconverted CDE em pontos específicos de tempo no desenvolvimento. Tem sido mostrado anteriormente que CDE photoconverted usando este método pode permanecer distinguível de seus vizinhos não convertidos por cinco dias ou mais após o tempo de photoconversion7. Este protocolo também detalha um método usado para análise de imagem de photoconverted CDE em menos de 48 embriões hpf, que tem sido usada com sucesso para seguir os movimentos do tecido durante o desenvolvimento de AVC (Boselli et al, no prelo)9. Esperamos que os leitores encontraria este protocolo útil para estudar o desenvolvimento de AVC e válvula em embriões normais e em mutantes, morphants ou embriões tratados com drogas. Para um protocolo mais geral relacionadas com o rastreamento de pilha usando photoconvertible proteínas durante o desenvolvimento do zebrafish, por favor veja o artigo por Lombardo et al, 201210.

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Protocolo

1. preparar moldes e montagem do agarose

  1. Crie um molde com as dimensões indicadas na Figura 1 , usando uma impressora 3D ou ferramentas de oficina mecânica tradicional.
  2. Pipete cerca de 1,5 mL de agarose a 1% derretido em um prato de plástico montagem 35mm. Coloque o molde de plástico o agarose líquido, tendo o cuidado de evitar armadilhas de ar entre o molde e o agarose. Coloque o prato em 4 ° C, espere até a agarose endurece (leva cerca de 5 min) e, em seguida, remover o molde plástico.
  3. Para armazenar o prato de montagem para uso posterior, cubra o prato com a sua tampa, em seguida, enrole tanto o prato e a tampa firmemente com parafilme. O prato de montagem pode ser armazenado lado tampa virada para baixo, para até 5 dias a 4 ° C.
  4. Prepare com antecedência alíquotas de 1 mL de agarose de baixo ponto de fusão de 0,7% em 1,5 mL a tubos de Eppendorf para usar no dia da montagem.
    Nota: Os poços de agarose do prato montagem deformarão ao longo do tempo como a água evapora se parafilm não é enrolado os pratos firmemente.

2. obtenção de embriões para o Photoconversion

  1. Incross o Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) linha e crescer aproximadamente 200 embriões em meio de embrião no escuro a 28,5 ° C. Para obter mais detalhes sobre como cruzar linhas de zebrafish, refira por favor o JoVE ciência educação de banco de dados11.
  2. Depois de 5h, mas antes de 24 h, tratar os embriões com 1-fenil-2-tioureia (PTU) para evitar a formação de pigmento (0,003% PTU no meio do embrião).
  3. Cerca de 1h antes do início da photoconversion, embriões de tela sob um estereoscópio fluorescente e selecionados 5 embriões saudáveis que aparecem para expressar a fluorescência verde brilhante. O uso da luz de baixa intensidade ao Visualizar embriões é recomendado para evitar a exposição dos embriões a luz ambiente para evitar photoconverting Kaede em células não-específica.

3. incorporação

  1. Prepare-se 10 mL de mídia de montagem: 0,02% tricaina e 50mm BDM no meio do embrião.
  2. Adicionar 2 mL de meio de montagem para o prato de montagem e permitir a 15-30 min para a solução de agarose se espalham.
  3. Entretanto, derreta uma alíquota de 1 mL de agarose de baixo ponto de fusão (LMP) 0,7%, colocando o tubo em um bloco de calor de 70 ° C por cerca de 5 min.
    1. Esperar o LMP agarose esfriar um pouco e, em seguida, adicione 25 µ l de solução de metanosulfonato de 8 mg/mL e 40 µ l de solução 1M de BDM ao tubo de agarose de baixo ponto de fusão. Mix pipetando para cima e para baixo, então transfira o tubo para um bloco de calor de 38 ° C para manter o agarose LMP em estado líquido.
  4. Em uma Petri prato com meio de embrião, cuidadosamente dechorionate os embriões pré-selecionados sob o microscópio estereoscópico usando fórceps, tomando cuidado para não danificar os embriões.
  5. Transferi os embriões para um prato separado contendo 2 mL de mídia de montagem.
    1. Quando os corações dos embriões são interrompidos (leva cerca de 5-10 min), transferência de embriões para a montagem do prato e organizar embriões em poços usando fórceps para que eles mentem em um ângulo de 25 graus, coroa apontando em direção à parte mais profunda do poço, gema voltada para cima.
    2. Quando os embriões são mais ou menos no lugar, remova a mídia, incorporar os embriões em ~ 200 µ l de 0,7% LMP agarose contendo tricaina e BDM e reajustar as posições dos embriões, inclinando os embriões à esquerda ou à direita conforme necessário.
  6. Esperar até os conjuntos de agarose LMP (leva cerca de 5 min) e, em seguida, adicionar o meio de montagem para o prato. Os embriões estão agora prontos para ser photoconverted.
    Nota: A tricaina e o BDM são usados para anestesiar os embriões e parar o coração dos embriões, respectivamente. Meios de montagem podem ser preparados no dia anterior de imagem, mas certifique-se de proteger os meios de comunicação de luz.
    Nota: O posicionamento correto dos embriões é importante para permitir um caminho claro do laser para as células que deseja photoconvert. Posicione a cabeça do embrião perto do início do poço para que a luz do laser não tem de viajar para longe para alcançar o embrião, e para que os embriões podem ser facilmente desmontados depois de photoconversion.

4. Photoconversion

  1. Em um microscópio confocal na posição vertical (como Leica SP8) equipado com um 405 nm, 488 nm e fonte de laser 561 nm, localizar o embrião do coração usando transmitidos luz branca (brightfield) e uma lente objetiva (como Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objectivo). Verifique se há fluorescência vermelha de Kaede usando o laser nm 561 (ou seja, laser DPSS 561, na intensidade de ~ 5%, detector fixado em 728-589 nm). Em seguida, visualize o endocárdio usando laser 488 nm (ou seja, 30 mW várias linhas laser de argônio na intensidade de ~ 5%, detector fixado em 502-556 nm).
  2. Entra no modo de "FRAP" sobre o software de aquisição de microscópio. Selecione ~ 1% da potência do laser para ambos 488 nm e 561 nm de lasers.
  3. Concentre-se no avião de interesse, selecione uma região de interesse (ROI), em seguida, photoconvert células usando a 405 nm diodo do laser com potência de 25% do laser, varredura sobre o ROI três vezes. Kaede insuficiente deveria photoconverted no ROI, digitalizar a 405 nm laser sobre a área três vezes novamente. Repita este passo para todos os ROIs.
  4. Retornar para o modo "TCS SP8" sobre o software e adquirir uma z-pilha, usando a 561 nm e 488 nm lasers sequencialmente. Certifique-se de selecionar a opção 'bidirecional' para aumentar a velocidade de imagens.
    Nota: Quanto tempo demora para photoconvert e imagem que varia de cada embrião. Batida do coração é conhecida por ser importante para o desenvolvimento de válvula do coração normal, então evite manter o coração parou durante mais de 30 min, mesmo que isso signifique que você não tem tempo para photoconvert todos os 5 embriões.
    Nota: Durante o processo de photoconversion, utilizar detectores de PGTO, enquanto após a photoconversion, é recomendável usar detectores de híbrido definidos como 'contando' modo. Isso ocorre porque os detectores híbridos são mais sensíveis e são capazes de produzir imagens de melhor qualidade, mas são facilmente danificados pela superexposição.

5. desmontar os embriões photoconverted

  1. Depois photoconversion, use uma pipeta de vidro para pressionar para baixo apenas ligeiramente acima da cabeça do embrião para quebrar o agarose LMP e, em seguida, aspire suavemente o embrião.
    1. Ejete o embrião da pipeta vidro um-35mm de Petri contendo meio de embrião com PTU (para lavar o BDM contendo meio).
    2. Transferi o embrião para um poço em uma placa de 6 contendo meio de embrião com PTU. Durante esta etapa, certifique-se de manter a nota da qual embrião entra que bem, como isso é essencial para correlacionar a posição de photoconverted células em estádios de desenvolvimento mais tarde.
  2. Agora que os embriões são removidos do meio contendo BDM, seus corações devem começar a bater novamente em cerca de 5 min. embriões retorno à escuridão a 28,5 ° C, para permitir que os embriões continuar a desenvolver normalmente.

6. imaging photoconverted células em estádios de desenvolvimento embrionário mais tarde

  1. Na fase desejada, parar o coração e re-inserir os embriões como no passo 3 do presente protocolo, com a importante diferença de que os embriões devem ser tratados com BDM em pratos separados, marcados para rastrear os embriões.
  2. Para embriões até 62 hpf, adquirir z-pilhas de endocárdio usando 561 nm e 488 nm para o vermelho e verde fluorescente sinaliza, respectivamente. Para os embriões em estágios mais de 62 hpf, use um multiphoton laser conjunto para 940 nm a imagem Kaede verde em vez do 488 nm do laser.

7. análise de imagem embriões abaixo dos 48 hpf

Nota: Os movimentos de tecido do AVC podem ser difícil analisar devido à sua complexa estrutura tridimensional. Para quantificar o comprimento de uma região de photoconverted no AVC entre duas regiões não-photoconverted ou o comprimento de uma região não-photoconverted no AVC entre duas regiões de photoconverted, pode ser desejável para mapear a estrutura tridimensional em um mapa bidimensional. Imagens de photoconverted embriões obtidos antes 48 hpf pode ser analisado usando o método a seguir.

  1. Importe as imagens adquiridas em Matlab ou qualquer outro software similar.
  2. Delimitar manualmente o ROI, ou seja, o endocárdio e aplicar uma máscara para remover o sinal fora desta região.
  3. Aplica um limiar de intensidade na imagem para identificar os pontos no endocárdio e parcela-las em três dimensões. Isole os pontos correspondentes à parte mais estreita e mais reto o AVC, apagando manualmente os pontos de nenhum interesse na aurícula e o ventrículo usando o comando apagar no software.
  4. Use um cilindro para caber os pontos que representam o AVC então obtido.
  5. Defina um sistema de referência para comparar várias amostras. Por exemplo, adote o centro de massa dos pontos de AVC como a origem do sistema de referência e o eixo do cilindro equipado como o eixo z.
    1. Certifique-se de que a positivas z-posições correspondem sempre para o mesmo lado do coração (ventricular ou atrial).
    2. Os pontos de AVC de projeto no plano x-y e use uma elipse para encaixá-los.
    3. Rode os endocárdico pontos ao redor do eixo z para o eixo maior da elipse e o eixo y do sistema de referência são paralelas e y-valores positivos correspondem ao lado interno do AVC em relação ao embrião.
  6. Para segmentar o AVC, corte o conjunto de dados tridimensional com alguns aviões obtidas através da rotação do metade-plano {y = 0, x > 0} na direção z.
    1. A intensidade dos pixels vizinhos de projeto nesses planos e definir o endotélio de forma consistente. Por exemplo, retirar manualmente uma linha o atrial ao lado ventricular do AVC em metade da espessura do endotélio.
    2. Interpole os pontos das linhas que representam o endotélio com uma spline tridimensional usando a caixa de ferramentas spline para representar o AVC com uma superfície.
      Nota: O número de aviões a corte determina tanto a precisão da segmentação e o consumo de tempo desta etapa. Geralmente, 8 aviões são suficientes para alcançar bons resultados.
  7. Defina a posição azimutal de cada ponto na superfície de AVC usando coordenadas cilíndricas.
    1. Em cada posição azimutal define uma curva parametrizada ao longo da superfície do AVC, calculando o comprimento do arco na superfície entre pontos consecutivos.
    2. Para cada curva parametrizada, defina o ponto sobre a curva mais próxima ao centro do AVC para zero. Os pontos do AVC, portanto, são totalmente descritos por sua posição azimutal e sua posição na curva paramétrica.
  8. Desdobre o AVC em uma imagem bidimensional usando a posição paramétrica dos pontos.
  9. Encontre as bordas da região para quantificar como as bordas de limiarização a imagem binária a relação entre as intensidades do photoconverted e os canais não-photoconverted. Se necessário, corrigi manualmente o resultado.
  10. Calcule o comprimento do arco entre as bordas para calcular o comprimento do tecido em função da posição azimutal.

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Resultados

Um exemplo de um photoconverted de embrião em 48 hpf e fotografada novamente em 80 hpf é mostrado na Figura 2, filmes 1 e 2. Expondo a Kaede a luz de nm 405 irreversivelmente conversos da proteína de sua forma verde fluorescente para formar vermelho fluorescente, permitindo que o comportamento de células rotulado com o verde ou sua forma vermelha para ser seguido com respeitam aos seus diferencialmente coloridas vizinhos dura...

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Discussão

Calendário de photoconversion: apesar de Kaede permanece brilhantemente expressa em CDE mesmo em 96 hpf, deve-se notar que o embrião cresce, luz laser difunde-se mais antes de atingir o AVC, tornando mais difícil a photoconversion confinado de Kaede. At embrionária dos estágios, o mais tardar 55 hpf, o Balonismo do ventrículo e o átrio também significa que o feixe de laser violeta, usado para photoconversion não pode atingir células de AVC sem primeiro passando o átrio ou ventrículo. Isso significa que, além de ...

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Divulgações

Não há conflito de interesse declarado.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli e Basile Gurchenkov ajuda a projetar e fazer o molde descrito neste protocolo. Este trabalho foi apoiado pela FRM (DEQ20140329553), o ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), a EMBO Young Investigator programa da Comunidade Europeia, a ERC CoG N ° 682938 Evalve e pela subvenção ANR-10-LABX-0030-INRT, um fundo de Estado francês gerenciado pelo a Agence Nationale de la Recherche sob o quadro programa Investissements d'Avenir rotulado ANR-10-IDEX-0002-02.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais
Equipamento necessário para a criação de peixes e coleta de ovos (consulte o Livro do Peixe-Zebra22 para obter detalhes).
Estereomicroscópio
Microscópio confocal vertical (Equipado com lasers operando a 488 nm, 561 nm e 405 nm, um laser multifotônico sintonizável e um Leica HCX IRAPO L, 25 &vezes;, objetiva N.A. 0,95)LeicaLeica SP8
Bloco de calorThermoScientific88870001
placa de cultura de tecidos de 35 mm x 10 mmFalcon353001
Placa de 6 poçosFalcon353046
placa
Fórceps
Pipeta
Molde
Reagentes
8 mg/mL Solução estoque de tricaína 
1 solução
UltraPure agarose de baixo ponto de fusãoInvitrogen16520-050
AgaroseLonza50004
PTU (1-fenil-2-tioureia)Sigma AldrichP7629
Meio embrionário: 30x solução
Software
Matlab equipado com as caixas de ferramentas de análise de imagem, ajuste de curvas, bioformatosMathWorks
8 mg/mL Solução estoque de tricaína
200 mg de pó de tricaína (ácido metanossulfônico de etil 3-aminobenzoato)Sigma-AldrichE10521
25 mL Danieau
Ajustar a pH 7, alíquota e conservar a -20 graus; C 
1 M BDM solução de estoque
1 g BDMSigma-Aldrich112135
10 mL ddH2O
Alíquota e armazene a -20 ° C
Meio embrionário: 30x solução estoque
50,7 g NaClSigma-Aldrich7647-14-5
0,78 g KClSigma-Aldrich7447-40-7
1,47 g Sulfato de magnésioSigma-Aldrich  7487-88-9
2,1 g Nitrito de cálcio tetrahidratadoSigma-Aldrich13477-34-4
19,52 g HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico)Sigma-Aldrich7365-45-9
Ajuste para pH 7,2 e armazene em temperatura
Molde
ResinaPlasCLEARAsiga
Plus 39  Impressora 3D Pico de forma livreAsiga
de Petride vidroestoque M BDM estoque ambiente

Referências

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