Seguindo os movimentos de tecido endocárdico através de célula Photoconversion no embrião Zebrafish

Resumo

Este protocolo descreve um método para o photoconversion de Kaede proteína fluorescente em células endocárdico dos vivos zebrafish embrião que permite o rastreamento de células endocárdico durante canal atrioventricular e desenvolvimento de válvula atrioventricular coração .

Resumo

Durante a embriogênese, as células passam por mudanças dinâmicas no comportamento da célula, e decifrar a celular lógica por trás destas mudanças é um objetivo fundamental no campo da biologia do desenvolvimento. A descoberta e o desenvolvimento de proteínas photoconvertible grandemente ajudado nossa compreensão dessas mudanças dinâmicas, fornecendo um método para opticamente destacar células e tecidos. No entanto, enquanto photoconversion, microscopia de lapso de tempo e análise de imagens subsequentes provaram para ser muito bem sucedido na descoberta dinâmica celular em órgãos como o cérebro ou os olhos, essa abordagem geralmente não é usada no coração em desenvolvimento devido à desafios colocados pelo movimento rápido do coração durante o ciclo cardíaco. Esse protocolo consiste de duas partes. A primeira parte descreve um método para photoconverting e posteriormente de rastreamento células endocárdico (CDE) durante zebrafish canal atrioventricular (AVC) e desenvolvimento de válvula atrioventricular coração. O método envolve temporariamente parando o coração com uma droga em ordem para photoconversion preciso tomar o lugar. Corações são permitidas para continuar batendo em cima da remoção da droga e desenvolvimento embrionário normalmente continua até que o coração está parado novamente para geração de imagens de alta resolução de photoconverted CDE em um ponto mais tarde o tempo do desenvolvimento. A segunda parte do protocolo descreve um método de análise de imagem para quantificar o comprimento de uma região photoconverted ou não-photoconverted no AVC em embriões jovens mapeando o sinal fluorescente da estrutura tridimensional em um mapa bidimensional . Juntas, as duas partes do protocolo permite examinar a origem e o comportamento das células que compõem o zebrafish AVC e válvula cardíaca atrioventricular e potencialmente pode ser aplicado para estudar os mutantes, morphants ou embriões que tenham sido tratados com reagentes que perturbam o desenvolvimento de AVC e/ou válvula.

Introdução

O peixe-zebra é atualmente um dos mais importantes modelos para estudar processos celulares e do desenvolvimento na vivovertebrados. Isto é principalmente devido a transparência óptica do zebrafish e acessibilidade à genética, o que o torna um poderoso modelo para a aplicação de técnicas ópticas envolvendo geneticamente codificado photoresponsive proteína tecnologias¹. Específico para o estudo do desenvolvimento do coração, zebrafish receber oxigênio suficiente através de difusão tal que até mesmo mutantes sem batimento cardíaco podem sobreviver a primeira semana de desenvolvimento, permitindo análises sobre os efeitos de genes de dese....

Protocolo

1. preparar moldes e montagem do agarose

1. Crie um molde com as dimensões indicadas na Figura 1 , usando uma impressora 3D ou ferramentas de oficina mecânica tradicional.
2. Pipete cerca de 1,5 mL de agarose a 1% derretido em um prato de plástico montagem 35mm. Coloque o molde de plástico o agarose líquido, tendo o cuidado de evitar armadilhas de ar entre o molde e o agarose. Coloque o prato em 4 ° C, espere até a agarose endurece (leva cerca de 5 min) e, em seguida, remover o molde plástico.
3. Para armazenar o prato de montagem para uso posterior, cubra o prato com a sua tampa, em seguida, enrole tanto o prato e a ....

Resultados

Um exemplo de um photoconverted de embrião em 48 hpf e fotografada novamente em 80 hpf é mostrado na Figura 2, filmes 1 e 2. Expondo a Kaede a luz de nm 405 irreversivelmente conversos da proteína de sua forma verde fluorescente para formar vermelho fluorescente, permitindo que o comportamento de células rotulado com o verde ou sua forma vermelha para ser seguido com respeitam aos seus diferencialmente coloridas vizinhos dura.......

Discussão

Calendário de photoconversion: apesar de Kaede permanece brilhantemente expressa em CDE mesmo em 96 hpf, deve-se notar que o embrião cresce, luz laser difunde-se mais antes de atingir o AVC, tornando mais difícil a photoconversion confinado de Kaede. At embrionária dos estágios, o mais tardar 55 hpf, o Balonismo do ventrículo e o átrio também significa que o feixe de laser violeta, usado para photoconversion não pode atingir células de AVC sem primeiro passando o átrio ou ventrículo. Isso significa que, além de .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais
Equipamento necessário para a criação de peixes e coleta de ovos (consulte o Livro do Peixe-Zebra22 para obter detalhes).
Estereomicroscópio
Microscópio confocal vertical (Equipado com lasers operando a 488 nm, 561 nm e 405 nm, um laser multifotônico sintonizável e um Leica HCX IRAPO L, 25 &vezes;, objetiva N.A. 0,95)	Leica	Leica SP8
Bloco de calor	ThermoScientific	88870001
placa de cultura de tecidos de 35 mm x 10 mm	Falcon	353001
Placa de 6 poços	Falcon	353046
placa
Fórceps
Pipeta
Molde
Reagentes
8 mg/mL Solução estoque de tricaína
1 solução
UltraPure agarose de baixo ponto de fusão	Invitrogen	16520-050
Agarose	Lonza	50004
PTU (1-fenil-2-tioureia)	Sigma Aldrich	P7629
Meio embrionário: 30x solução
Software
Matlab equipado com as caixas de ferramentas de análise de imagem, ajuste de curvas, bioformatos	MathWorks
8 mg/mL Solução estoque de tricaína
200 mg de pó de tricaína (ácido metanossulfônico de etil 3-aminobenzoato)	Sigma-Aldrich	E10521
25 mL Danieau
Ajustar a pH 7, alíquota e conservar a -20 graus; C
1 M BDM solução de estoque
1 g BDM	Sigma-Aldrich	112135
10 mL ddH2O
Alíquota e armazene a -20 ° C
Meio embrionário: 30x solução estoque
50,7 g NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
0,78 g KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7
1,47 g Sulfato de magnésio	Sigma-Aldrich	7487-88-9
2,1 g Nitrito de cálcio tetrahidratado	Sigma-Aldrich	13477-34-4
19,52 g HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico)	Sigma-Aldrich	7365-45-9
Ajuste para pH 7,2 e armazene em temperatura
Molde
Resina	PlasCLEARAsiga
Plus 39  Impressora 3D Pico de forma livre	Asiga

de Petride vidroestoque M BDM estoque ambiente