Method Article

Geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW

DOI:

10.3791/57295

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March 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando um vetor binário pBIBAC-GW faz gerar plantas transgénicas com inserções de cópia única intactas, um processo fácil. Aqui, uma série de protocolos é apresentada que guia o leitor através do processo de geração de plantas transgênicas de Arabidopsis e teste as plantas para integridade e copiar o número de inserções.

Abstract

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Ao gerar plantas transgênicas, em geral, o objetivo é ter expressão estável de um transgene. Isto requer única intacta de uma integração do transgene, como cópia multi integrações são frequentemente sujeitas a silenciamento de genes. O vetor binário compatível com o Gateway com base em cromossomos artificiais bacterianos (pBIBAC-GW), como outros derivados de pBIBAC, permite a inserção dos transgenes cópia única com alta eficiência. Como uma melhoria para o pBIBAC original, uma gaveta de Gateway foi clonada em pBIBAC-GW, para que as sequências de interesse podem agora ser facilmente incorporadas a transferência de vector DNA (T-DNA) clonando Gateway. Comumente, a transformação com pBIBAC-GW resulta em uma eficiência de 0,2-0,5%, segundo o qual metade dos transgênicos a transportar uma integração de cópia única intacta do T-DNA. Os vetores de pBIBAC-GW estão disponíveis com resistência ao glufosinato-amônio ou DsRed fluorescência em revestimentos de semente para seleção em plantas e com resistência à canamicina como uma seleção em bactérias. Aqui, uma série de protocolos é apresentada que guia o leitor através do processo de geração de plantas transgênicas usando pBIBAC-GW: a partir de recombinar as sequências de interesse em vetor de escolha, para plantar a transformação com pBIBAC-GW Agrobacterium, seleção dos transgênicos e teste as plantas para integridade e cópia número de inserções usando a DNA mancha. Atenção é dada a concepção de uma estratégia de mancha de DNA para reconhecer integrações de single e multi cópias em único e múltiplos loci.

Introduction

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Ao gerar plantas transgênicas, geralmente, o objetivo é ter o transgene integrado estàvel expressa. Isto pode ser conseguido por integrações intacta cópia única de um transgene. Múltiplas integrações podem levar ao aumento da expressão de um transgene, mas também para o silenciamento de genes. Silenciamento de transgenes é mais provável se sequências inseridas são dispostas em tandem ou repetições invertidas1,2,3,4. Vetores binários são usadas como naves em Agrobacterium-mediada experimentos de transformação para entregar as sequênc....

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Protocol

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1. Inserir sequências de interesse em vetor binário

  1. Prepare a entrada de Gateway e vetores binários.
    1. Isole o vetor de Gateway de entrada que contém um fragmento de DNA ou o gene de interesse usando um kit de mini-preparação de acordo com as sugestões do fornecedor.
      Nota: BIBAC-GW vetores requerem o uso de canamicina (Km) para a seleção de bactérias, portanto, usa um vetor de entrada com outro marcador de resistência ao invés de canamicina. Por exemplo, o vetor pENTR-gm, carregando um gene de resistência de gentamicina, é uma boa escolha de12.
    2. Propagar e isolar o vetor BIBAC-GW de interesse. Us....

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Results

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Usando o sistema de BIBAC-GW, construções de repórter para estudar ODM em plantas foram gerados10. Construções foram projetadas no Gateway de entrada vetor pENTR-gm12 e inseridas no pBIBAC-BAR-GW (Figura 1), usando a reação de recombinação Gateway LR.

Arabidopsis foram transformados com pDM19, um BIBAC-BAR-GW plasmídeo com um repórter de mTurquoise-eYF.......

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Discussion

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Crítico para a geração de transgênicos com integrações único, intactos de um transgene é a escolha do vetor binário usado. Vetores de família BIBAC têm sido utilizados para entregar muitos planta espécie23,24,25,26,,27,28-sequências de interesses. Vetores BIBAC, incluindo BIBAC-GW, rendem cópia única integrações com eficiênci.......

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Disclosures

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Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

Acknowledgements

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Esta pesquisa é suportada pelo holandês tecnologia Foundation STW (12385), que faz parte da organização de países baixos para a pesquisa científica (NWO), e que é parcialmente financiado pelo Ministério dos assuntos económicos (OTP Grant 12385-MS).  Agradecemos a Carol M. Hamilton (Universidade de Cornell, Estados Unidos) para a prestação de pCH20, a espinha dorsal dos vetores BIBAC-GW.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sulfato de canamicina monohidratadoDuchefaK0126
Sulfato de gentamicinaDuchefaG0124
RifampicinaDuchefaR0146
Cloridrato de tetraciclinaSigmaT-3383
DB3.1 células competentesThermo Scientific - Invitrogen11782-018One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) da Invitrogen ou qualquer outra cepa resistente a ccdB E. coli pode ser usada em seu lugar   
Células competentes DH10BThermo Scientific - Invitrogen18290-015
Mix de enzimas clonase LR Gateway Thermo Scientific - Invitrogen11791-019
citrato de tri-sódio dihidratadoBase Merck106432
TrizmaSigma-AldrichT1503
EDTA dissódico dihidratadoDuchefaE0511
Proteinase KThermo Scientific EO0491
BactotriptonaBD211705
Extrato de leveduraBD212750
Cloreto de sódioHoneywell Fluka13423
Cloreto de potássioMerck104936
D(+)-Glicose monohidratadaMerck108346
Cuvetes de eletroporação, 0,1 cm de folgaBiorad
Electroporator Gene PulserBioRad
Sulfato de magnésio heptahidratadoCalbiochem442613
D(+)-Maltose monohidratado 90%Acros Organics32991
SacaroseSigma-Aldrich84100
Silwet L-77Fisher ScientificNC0138454
Murashige Meio SkoogDuchefaM0221
AgarBD214010
Glufosinato-amônio (Basta)Bayer79391781
Enzimas de restriçãoNEB
Brometo de EtídioBio-Rad1610433
Sistema de eletroforeseBio-Rad
Hidróxido desódioÁcido
Membranade
de borrão Hybond N+Sigma Aldrich15358ou GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Papel mata-borrãoGE Healthcare Life Sciences3030-931
dNTPThermo FisherR0181
Acetilado BSASigma-AldrichB2518
HEPESSigma-AldrichH4034
2-MercaptoetanolMerck805740
Sephadex G-50 GrossoGE Healthcare Life Sciences17004401ou Sephadex G-50 Médio (17004301)
Dextran sulfato de sódio sal de sódioSigma-AldrichD8906
Dodecil Sulfato de Sódio US BiologicalS5010
Salmon Sperm DNASigma-AldrichD7656
Monohidrato de di-hidrogenofosfato de sódio Telade fósforo Merck106346
StorageGE Healthcare Life Sciences28-9564-74
Imager de fósforoGE Healthcare Life SciencesTyphoon FLA 7000
UV CrosslinkerStratageneStratalinker 1800
filme plástico (envoltório de Saran)Omnilabo1090681
AgaroseThermo Scientific - Invitrogen16500
Ácido bóricoMerck100165
marcador de DNA ' Blauw'; Escada de DNA.MRC HollandMCT8070
marcador de DNA ' Rood'; Escada de DNAMRC HollandMCT8080
Mistura de HexanucleotídeosRoche11277081001
Kit de Construção GrandeQiagen12462
Tubo de polietileno selável a quente, transparentevários fornecedoresa largura do tubo deve ser maior do que a da membrana de borrão
Selador
Filtro de membrana discoMerckVSWP02500
Cloreto de magnésioMerck105833
Malha de hibridizaçãoGE Healthcare Life SciencesRPN2519
1652089 clorídrico Merck 106498 de nylon 100316 e térmico

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al.

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BIBAC GW VectorGateway RecombinationTransgenic PlantsSingle copy InsertionsDNA BlottingAgrobacterium TransformationGlufosinate SelectionDsRed FluorescenceRestriction EnzymesT DNA Integrity

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