Method Article

Geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW

DOI:

10.3791/57295

⸱

March 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando um vetor binário pBIBAC-GW faz gerar plantas transgénicas com inserções de cópia única intactas, um processo fácil. Aqui, uma série de protocolos é apresentada que guia o leitor através do processo de geração de plantas transgênicas de Arabidopsis e teste as plantas para integridade e copiar o número de inserções.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ao gerar plantas transgênicas, em geral, o objetivo é ter expressão estável de um transgene. Isto requer única intacta de uma integração do transgene, como cópia multi integrações são frequentemente sujeitas a silenciamento de genes. O vetor binário compatível com o Gateway com base em cromossomos artificiais bacterianos (pBIBAC-GW), como outros derivados de pBIBAC, permite a inserção dos transgenes cópia única com alta eficiência. Como uma melhoria para o pBIBAC original, uma gaveta de Gateway foi clonada em pBIBAC-GW, para que as sequências de interesse podem agora ser facilmente incorporadas a transferência de vector DNA (T-DNA) clonando Gateway. Comumente, a transformação com pBIBAC-GW resulta em uma eficiência de 0,2-0,5%, segundo o qual metade dos transgênicos a transportar uma integração de cópia única intacta do T-DNA. Os vetores de pBIBAC-GW estão disponíveis com resistência ao glufosinato-amônio ou DsRed fluorescência em revestimentos de semente para seleção em plantas e com resistência à canamicina como uma seleção em bactérias. Aqui, uma série de protocolos é apresentada que guia o leitor através do processo de geração de plantas transgênicas usando pBIBAC-GW: a partir de recombinar as sequências de interesse em vetor de escolha, para plantar a transformação com pBIBAC-GW Agrobacterium, seleção dos transgênicos e teste as plantas para integridade e cópia número de inserções usando a DNA mancha. Atenção é dada a concepção de uma estratégia de mancha de DNA para reconhecer integrações de single e multi cópias em único e múltiplos loci.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ao gerar plantas transgênicas, geralmente, o objetivo é ter o transgene integrado estàvel expressa. Isto pode ser conseguido por integrações intacta cópia única de um transgene. Múltiplas integrações podem levar ao aumento da expressão de um transgene, mas também para o silenciamento de genes. Silenciamento de transgenes é mais provável se sequências inseridas são dispostas em tandem ou repetições invertidas1,2,3,4. Vetores binários são usadas como naves em Agrobacterium-mediada experimentos de transformação para entregar as sequências de interesse em genomas de planta. O número de integrações no genoma planta é dependente do número de cópia do vetor binário em Agrobacterium tumefaciens5,6. Muitos vetores binários comumente usados são vetores de alta cópia e, portanto, produzir um número de cópia do transgene média alta: cópias de 3.3 para 4,9 em Arabidopsis5.

O número de integrações de T-DNA pode ser diminuído usando vetores binários que têm um número baixo-cópia em a. tumefaciens, tais como BIBAC7, ou através do lançamento de um T-DNA da . tumefaciens cromossoma5. O número médio de integrações do transgene em tais casos é inferior a 25,8,9,10. Devido a ser cópia única na . tumefaciens e também em Escherichia coli, BIBAC-derivados podem manter e entregar as construções tão grandes quanto 150 kb,11.

Compatível com o GW BIBAC vetores10,12 permitir fácil introdução de genes de interesse para o vetor usando Gateway clonagem. O uso da tecnologia de Gateway simplifica o procedimento de clonagem, mas também supera os problemas comuns associados com13,grandes vetores de baixo-cópia-número14, como um baixo rendimento de DNA e uma seleção limitada de restrição exclusiva sites disponíveis para clonagem de7,11. Os derivados de pBIBAC-GW estão disponíveis com qualquer resistência ao glufosinato-amônio (pBIBAC-BAR-GW) ou DsRed fluorescência em revestimentos de semente (pBIBAC-RFP-GW) para seleção em plantas (Figura 1)10,12. Para os dois vetores, um gene de resistência canamicina é usado como marcador de seleção em bactérias.

Combinam os vetores de pBIBAC-GW: design (1) fácil e manipulação genética em e. colie integrações de cópia única (2) intacto em planta com alta eficiência. O rendimento de vetores de pBIBAC-GW em integrações de média 1,7 em Arabidopsis com aproximadamente metade das plantas transgênicas carregando um único integrado T-DNA10.

Expressao de transgenes é um requisito para a maioria dos transgênicos gerados. Expressão do transgene estável pode ser conseguida integrações intactas, cópia única. Trabalhar com plantas transgênicas carregando integrações intactas, cópia única é, no entanto, ainda mais importante, se por exemplo, o objetivo é estudar a eficiência de processos baseados em cromatina, tais como recombinação, mutagênese ou reparação e a dependência destes processos no genoma e a estrutura da cromatina no local da inserção. Para nosso interesse, para estudar a dependência de mutagênese do oligonucleotide dirigido (ODM) no contexto genômico do local, um conjunto de linhas de repórter com integrações intactos, cópia única de um gene repórter de mutagénese foi gerado (Figura 2)10. Usando este conjunto de linhas, foi demonstrado que a eficiência ODM varia entre loci transgénicos integrado em diferentes localizações genômicas, apesar dos níveis de expressão do transgene ser bastante semelhante.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Inserir sequências de interesse em vetor binário

  1. Prepare a entrada de Gateway e vetores binários.
    1. Isole o vetor de Gateway de entrada que contém um fragmento de DNA ou o gene de interesse usando um kit de mini-preparação de acordo com as sugestões do fornecedor.
      Nota: BIBAC-GW vetores requerem o uso de canamicina (Km) para a seleção de bactérias, portanto, usa um vetor de entrada com outro marcador de resistência ao invés de canamicina. Por exemplo, o vetor pENTR-gm, carregando um gene de resistência de gentamicina, é uma boa escolha de12.
    2. Propagar e isolar o vetor BIBAC-GW de interesse. Use uma cepa de Escherichia coli que é resistente à toxicidade do gene ccdB presente dentro da gaveta de Gateway. BIBAC-vetores isolados usando protocolos ou kits projetados especificamente para grandes plasmídeos de acordo com as sugestões do fornecedor.
  2. Realize uma reação de Gateway.
    1. Prepare a reação de recombinação LR de acordo com as sugestões do fornecedor. Misturar os componentes a seguir em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL à temperatura ambiente (RT): 100 – 300 ng clone de entrada (supercoiled), 300 ng do vetor BIBAC-GW, amortecedor da reação Clonase LR (concentração final: 1 x). Ajuste o volume da mistura para 16 µ l com TE (10 mM Tris, 1 mM de EDTA, pH 8.0). Finalmente, adicione 4 µ l do mix de enzima Clonase LR e mistura num Vortex. Incube a mistura a 25 ° C, durante 1 h.
    2. Finalizar a reação de LR adicionando 2 µ l de solução de Proteinase K (2 µ g / µ l) para a mistura preparada na etapa 1.2.1. Misturar e incubar a 37 ° C por 10 min.
  3. Transforme e. coli com a mistura de reação de Gateway por eletroporação.
    1. Do desalt mistura reacional LR antes da eletroporação.
      Nota: Este passo é essencial para sucesso eletroporação. Abaixo uma diálise método é descritos, mas outros métodos tais como precipitação com acetato de sódio e etanol também pode ser usado.
      1. Prepare a instalação para diálise de filtro da reação de LR. 20 mL de água desionizada ultrapura despeje uma placa de Petri estéril. Coloque um disco de filtro de membrana (tamanho de poros = 0,025 µm) na superfície da água.
      2. Pipetar a reação inteira de LR cuidadosamente na parte superior da membrana e permita que a mistura Dialize em RT por 1h.
    2. Adicione 5 µ l do mix LR demolhado para electro-competente DH10B células em uma cubeta de eletroporação (0,1 cm). Electroporate as células (1.5 V/cm, resistência 200 Ω, capacitância 25 µF) e imediatamente, adicionar 1 mL de meio de repressão (SOC) previamente aquecido Super Catabolite ideal para as células, seguidas de incubação a 37 ° C por 45 min, 180 rpm. (Meio SOC, extrato de 1 l: 20 g de Bacto triptona, 5 g de fermento, 0,5 g de NaCl, 2,5 mL de 1M de KCl, 20 mL de 1 M filtro esterilizado glicose).
      Nota: DH10B células podem ser substituídas por outras células de Escherichia coli que estàvel mantêm grandes plasmídeos.
      Nota: As condições de eletroporação ideal são dependentes do dispositivo electroporation usado.
    3. Pelota de bactérias em velocidade maxima por 30 s usando microcentrifuga, remover excesso SOC e resuspenda o pellet em aproximadamente 50-100 µ l de meio Luria-Bertani (LB). Espalhar as bactérias em placas de canamicina-LB (Km-LB) (concentração Km, 40 µ g/mL) e incubar as placas a 37 ° C durante a noite. (Meio LB, 1 l: 10 g de Bacto triptona, 5 g de fermento extrato, 10 g de NaCl. Para o meio sólido adicione o agar, 15 g/L).
  4. Identificar os derivados de BIBAC-GW recombinados e isolar o Plasmídeo.
    1. Para ser capaz de crescer em placas de Km-LB, as células de Escherichia coli devem conter o plasmídeo BIBAC-GW recombinado, no qual a sequência de ccdB é substituída com a inserção desejada. Use colônia reação em cadeia da polimerase (PCR)15 para verificar se as colônias de bactérias na placa de contenham os plasmideos corretos, tendo a espinha dorsal BIBAC-GW e a inserção de interesse.
      1. Para identificar a espinha dorsal pBIBAC-BAR-GW, realizar uma reação de15 PCR com os iniciadores DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 'e DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. Este conjunto de cartilha amplifica um fragmento de bp 563 do gene bar .
      2. Para verificar a presença da espinha dorsal BIBAC-RFP-GW, realizar uma reação de15 PCR, utilizando primers M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 'e M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. Esta combinação de cartilha amplifica um fragmento de bp 791 sobrepostas a sequência de promotor e rfp de cruciferin.
      3. Realize reações de15 PCR utilizando primers específicos do gene para verificar a presença do inserto de interesse.
    2. Inocule uma única colônia positiva em 2 – 5 mL de meio LB contendo canamicina (40 µ g/mL) para isolamento de DNA16. Incube a 37 ° C em um agitador orbital a 180 rpm, durante a noite.
    3. Isolar o plasmídeo (consulte a etapa 1.1.2).

2. preparação da . tumefaciens para mergulhar Floral de Arabidopsis

  1. Transforme BIBAC-GW derivados da . tumefaciens.
    1. Prepare células electro-competente de auxiliar de estirpe C58C1 carregando o pCH32 da . tumefaciens plasmídeo7. Cresce bactérias na presença de tetraciclina (5 µ g/mL) e rifampicina (100 µ g/mL) para selecionar para pCH32 e garantir o crescimento de células de Agrobacterium apenas.
    2. Adicionar 0,25 – 0,5 µ g de DNA de um derivado pBIBAC-GW, previamente dissolvido em 10 – 20 µ l estéril ultrapura água desionizada, para 20 µ l Agrobacterium pilhas competentes em cubetas de eletroporação (0,1 cm). Manter as células no gelo.
    3. Electroporate as células (1.5 V/cm, resistência 400 Ω, capacitância 25 µF). Imediatamente após a eletroporação, adicionar 1 mL de meio de SOC pré-aquecido (28 ° C) para as bactérias e incube as celulas a 28 ° C, durante 60 a 90 min.
    4. Espalhou-se 100 µ l e o resto das bactérias em chapas separadas de LB contendo rifampicina (100 µ g/mL), tetraciclina (5 µ g/mL) e canamicina (40 µ g/mL) e incubar no escuro a 28 ° C durante 1-2 dias.
  2. Prepare a suspensão de Agrobacterium .
    1. PCR para verificar algumas das colônias a. tumefaciens do prato preparado no passo 2.1.4, para a presença do vetor correto (consulte a etapa 1.4.1).
    2. Raia uma única colônia confirmada para conter o vetor binário com o apropriado inserir uma placa LB contendo antibióticos (consulte a etapa 2.1.4). Cresce a 28 ° C durante a noite.
    3. Repita as estrias com uma única colônia obtida na etapa 2.2.2.
    4. Inocule uma colônia única em 2,5 mL de meio de LC suplementado com antibióticos (consulte a etapa 2.1.4) para preculture. Incube a 28 ° C, durante pelo menos 8 h ou durante a noite, a 180 rpm. (Média de LC, 10 l: 1G de Bacto triptona, 5 g de fermento extrato, 0,5 g de NaCl, 2,5 g de MgSO4 · 7 H2O, 2 g de Maltose).
    5. Adicione o preculture da etapa 2.2.4. até 250 mL LC suplementadas com antibióticos (consulte a etapa 2.1.4) e crescer a 28 ° C, a 180 rpm, durante a noite.
    6. Pelota a cultura por fiação a 5.500 x g, durante 12 min. Ressuspender o pellet em 100 mL de solução contendo 5% de sacarose, 0,05% Silwet L-77, 0.5 x MS. Pour a suspensão em um recipiente estéril para mergulhar floral das plantas.

3. transformação de Arabidopsis

  1. Prepare as plantas de Arabidopsis para transformação.
    1. Cultivar plantas de Arabidopsis em uma estufa ou clima câmara de crescimento controlado até que eles são de floração (12 potes com 9 plantas por imersão).
    2. Prenda os parafusos primeiros para permitir mais parafusos secundários a emergir. As plantas estão prontas para mergulhar 4-6 dias após o recorte, quando as plantas têm muitas cabeças de flor imaturas e muitos não fertilizado siliques.
  2. Mergulhando floral
    1. Mergulhe inflorescências para 5 a 10 s em Agrobacterium suspensão preparada na etapa 2.2.6. Use agitação suave.
    2. Embrulhar as partes acima do solo, das plantas em película aderente para manter a umidade alta e cobrir os potenciômetros da planta com uma caixa para manter as plantas no escuro. Incube as plantas 2 dias em uma câmara de estufa/crescimento.
    3. Remova a caixa e a película aderente e crescer as plantas para a maturidade em uma câmara de estufa/crescimento.
      Nota: Para aumentar a eficiência de transformação, as mesmas plantas podem ser re-mergulhados 7 dias após o primeiro mergulho.
    4. Colha as sementes. Piscina e analisar as sementes (T1) de plantas, transformadas com a construção da mesma, como um único conjunto.
  3. Tela para plantas transgênicas.
    1. Para tela de plantas transgénicas transformadas com um derivado de pBIBAC-RFP-GW, analise as sementes usando microscopia de fluorescência. A fim de detectar DsRed expressão em revestimentos de semente, imagem as sementes em uma excitação de 560 nm e emissão de 600-650 nm. Separe as sementes fluorescentes fluorescente não homólogos usando fórceps.
    2. Para tela de plantas transgénicas transformadas com um derivado de pBIBAC-BAR-GW, semear as sementes em bandejas, enchidas com o solo (~ 2.500 sementes/0.1 m2). Para garantir um mesmo espalhando sementes bandejas, suspender as sementes em ágar de 0,1% em 0.5 x médio Murashige Skoog (MS) e espalhar as sementes usando uma pipeta de 1 mL.
      Nota: Para estimular as sementes que germinam de forma síncrona, incubar as sementes pelo menos 2 dias a 4 ° C. Isso pode ser feito antes ou após a semeadura as sementes.
      1. Pulverize as mudas com 0,5% solução de glufosinato-amônio 2 semanas e 3 semanas após a semeadura em bandejas. Use 500 mL da solução de glufosinato-amônio por 1 m2.
      2. Transferência de mudas para potes individuais de sobreviver. Uma imagem típica de uma bandeja com mudas antes e após o tratamento de glufosinato-amônio (segundo) são mostrados na Figura 3.
      3. Analisar as plantas resistentes ao glufosinato-amônio por PCR para a presença da construção de interesse (consulte a etapa 1.4.1. para primeiras demão).
        1. Isolar o DNA genômico de planta para o PCR usando o método descrito por Edwards et al . 17

4. caracterizando transgênicos para o número e a integridade das integrações de T-DNA

  1. Estratégia de digestões de restrição
    Nota: Determine o número de integrações de T-DNA e sua integridade pela DNA mancha usando enzimas de restrição. Este método permite identificar único, mas também repetiu integrações no mesmo ou diferentes loci no genoma.
    1. Use uma série de digestões de restrição para identificar os padrões de integração diferentes possíveis:
      1. Selecione uma enzima que corta uma vez no meio do T-DNA, para poderes independentemente sonda sequências de montante e a jusante do site restrição (Figura 4A e Figura 7A-C). Ver Figura 4Ae a lenda de figura de resultados esperados e interpretação.
      2. Selecione uma enzima ou combinação de enzimas, cortando toda a sequência de interesse de uma só vez (Figura 4B e Figura 7A-D). Qualquer desvio do comprimento conhecido indica truncamento da fita integrado.
        Nota: tenha cuidado para usar somente as enzimas de restrição que não são sensíveis a metilação de citosina.
  2. Prepare as amostras de DNA genômicas.
    1. Isole o DNA genômico de plantas carregando o construto de interesse. Um método de miniprep CTAB DNA pode ser usado para isolamento de DNA18. DNA análise de Arabidopsis DNA do borrão, 2 – 2,5 µ g de DNA genômico é necessária. Dissolva o DNA em 50 µ l de TE.
    2. Verificar a integridade do DNA por eletroforese de gel de16. DNA genômico intacto migra como uma banda discreta na parte superior do gel. Degradação do DNA pode ser reconhecida como a presença de uma mancha. Para evitar danos ao DNA devido ao congelamento-descongelamento repetido, amostras de DNA genômicas são mantidas a 4 ° C.
    3. Digeri o DNA genômico (2-2,5 µ g no caso de DNA genômico de Arabidopsis ) em um volume total de 50 µ l, durante a noite, usando condições de reserva, sugeridas pelo fornecedor da enzima.
      1. Em um tubo de ensaio, misture 2 – 2,5 µ g de DNA genômico de Arabidopsis , 5 µ l 10x buffer de restrição e 5 U da enzima de restrição num total de 50 µ l ultrapura deionizada.
    4. Adicione corante de carregamento (1 x concentração final) para as amostras de restrição antes de carregar em um gel. Para o bom acompanhamento visual, use um dos seguintes: comigrating com pequenos fragmentos (azul de bromofenol, 350 – 400 bp), ou comigrating com fragmentos maiores (Cylene cianol, 3 – 4 kbp).
  3. Funcione o gel de DNA.
    1. Prepare um longo (20 cm) 0.5 x TBE de gel de agarose19. A porcentagem de agarose no gel varia de acordo com os tamanhos de fragmento esperados. 0,8 – 1% separa otimamente fragmentos > 1 kb em tamanho. Use 1-1,5% de agarose para fragmentos < 1 kb. Não adicione o brometo de Ethidium ao gel. (5 x TBE, 54 l: 1G de Trizma base, 27,5 g de ácido bórico, 3,75 g de EDTA).
      Nota: Para evitar a contaminação de DNA, bandejas de gel de uso que não são usadas para fracionar o plasmídeo e PCR ampliaram DNA.
    2. Carrega as amostras no gel de19.
    3. Adicione marcadores de DNA para o gel que estão na faixa de tamanho dos fragmentos esperados. Carga de aproximadamente 1 µ g de marcador (50-250 ng do fragmento de tamanho diferente) sobre o gel para permitir a visualização pela luz UV.
    4. Tamanho-fractionate o DNA em uma tensão baixa (40 – 50 V/500 mA) durante a noite.
  4. Prepare-se para a transferência do DNA do gel do agarose para a membrana de nylon.
    1. Transferir o gel para uma bandeja separada e manchá-la por 20 – 25 min em 0,5 x TBE contendo brometo de etídio (5 µ g/mL), rodando a 40 rpm em um agitador orbital.
    2. Visualize o gel em um transiluminador UV. Verifique se a separação de tamanho do DNA genômico, incluindo visibilidade das bandas satélite discreta (Figura 5A). Um esfregaço para tamanhos de peso molecular inferiores indica degradação do DNA.
    3. O transiluminador de UV, colocar uma transparência sobre o gel e marque a posição dos slots e as bandas dos marcadores com uma caneta de marcador (Figura 5B). Isto irá facilitar a determinação do tamanho dos fragmentos hibridizados mais tarde caso as sequências de marcador não cruzar especificamente com a sonda de DNA. Indicando os fragmentos de marcador para esta etapa, é possível controlar o tamanho dos fragmentos hybridizing.
    4. Coloque o gel de volta na bandeja, enxagúe com água desionizada ultrapura e submirja em 0,25 M HCl por 15 min para fragmentar o DNA dentro do gel. Lavar com água desionizada ultrapura. Usar HCl e água suficiente para cobrir o gel na bandeja e gire a moldeira com o gel submerso a 40 rpm em um agitador orbital.
    5. Incube o gel no buffer de desnaturação por 30 min. lavagem com água deionizada ultrapura. Usar o tampão e água suficiente para cobrir o gel na bandeja e gire a moldeira com o gel submerso a 40 rpm em um agitador orbital. (Buffer de desnaturação: 0,5 M de NaOH, 1,5 M NaCl).
    6. Incube o gel no buffer de neutralização por 30 min. lavagem com água deionizada ultrapura. Use o tampão e água suficiente para cobrir o gel na bandeja, gire a bandeja com gel submerso a 40 rpm em um agitador orbital. (Buffer de neutralização: 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, HCl, de 220 mM pH 7,6).
  5. Transferência do DNA para uma membrana de nylon.
    1. Prepare a instalação para transferência capilar do DNA genômico. Coloque uma placa de plástico (aproximadamente o tamanho do gel ou maior) sobre uma bandeja cheia de 20 x solução salina-citrato de sódio (SSC). Dobre um pedaço de papel de filtro grosso sobre a bandeja, para que ambas suas extremidades estão pendurados no SSC. Corte um pedaço de gel de tamanho de membrana de nylon positivamente carregado Hybond N + e 2 pedaços de papel de filtro grosso. (20x SSC: 3 M NaCl, citrato de sódio 0,3 M).
    2. Prepare a instalação mancha (Figura 6), colocando o gel, vagas para baixo na parte superior do papel de filtro sobre a placa de plástico. Coloque uma membrana Hybond N+ na parte superior, seguido por 2 camadas de papel de filtro. Pre-molhado cada camada em 20 x SSC antes de adicioná-los à assembleia. Certifique-se de remover quaisquer bolhas de ar entre as camadas, pois estas impedem a transferência de DNA.
    3. Cubra a montagem com uma camada espessa de papel de seda. Coloque uma placa de plástico com peso, tais como uma pequena garrafa, na parte superior. Certifique-se que a pressão está igualmente dividida sobre o gel. Isto irá assegurar a transferência adequada de DNA.
      Nota: O peso deve ser cerca de 200-300 g; pesos pesados dificultam a transferência de DNA.
    4. Cobrir a área que circunda o assembly, incluindo papel de filtro exposta, com película aderente (Figura 6) para evitar a evaporação do buffer de x SSC 20 e alvo que capilar forças em direção a membrana de nylon. Borre durante a noite.
    5. Marque a posição dos slots, nome, e/ou data na parte superior da membrana com lápis e remover a membrana do assembly. Observe que o lado inferior que tem estado em contacto com o gel, carrega o DNA.
    6. Corrigi imediatamente o DNA para a membrana por irradiação UV (2.400 µ j/m2) usando um agente reticulante UV.
      Nota: Condições de reticulação dependem do tipo de membrana utilizada.
      Nota: neste ponto a membrana pode ser armazenada a-20 ° C e usada para a hibridação com uma sonda mais tarde. Lavar a membrana de quitosana em 2x SSC e selo-pre-dobrado em tubos de polietileno Heat antes de colocá-lo a-20 ° C.
  6. Prepare a sonda para a hibridação.
    1. Amplifica a sequência a ser usada como a sonda para a mancha de DNA por PCR20. 50-100 ng de um fragmento PCR 250 kbp bp-2 é usado como uma sonda. Duas sondas separadas, um cruzamento para a região proximal da borda direita e outro para a região proximal da borda esquerda do T-DNA, podem ser usadas para avaliar a presença do T-DNA inteiro (Figura 4A e Figura 7).
    2. Dilua 50-100 ng do produto PCR em 24 µ l de água deionizada ultrapura num tubo de ensaio.
    3. Desnaturar o produto do PCR diluído fervendo por 5 min num copo de água ou calor do bloco e, em seguida, fixe diretamente no gelo.
    4. Degelo do premade GCT-mistura no gelo. (GCT-mistura: dGTP, dCTP, dTTP (todos 0,5 mM), aleatório hexâmeros 43,2 ng / µ l, Acetylated BSA 1,33 mg/mL, 33mm de β-Mercaptoetanol, 0,67 M Hepes, 0,17 mM pH do Tris 6,8, 17 mM MgCl).
    5. Adicione 21 µ l do GCT-mix e 2 U de Klenow fragmento para o produto do PCR.
    6. Adicionar 2 µ l de ATP [32P] à mistura e incubar a 37 ° C, durante 1 h.
      Atenção: Todas as etapas que envolvem a ATP [32P] precisam ser realizados em um ambiente designado pelo trabalho radioativo enquanto estiver usando a proteção apropriada.
      Nota: Certifique-se que o ATP [32P] é fresco (não mais de 1 meia-hora já passou).
    7. Prepare um G-50 de Sephadex coluna (grosso ou médio)21 para purificar as sondas marcadas de nucleotídeos (radioativos) sem personalidade jurídica. Pegue uma seringa de 2 mL e cobrir a saída com um pequeno círculo de papel de filtro grosso. Adicionar 2 mL de Sephadex G-50 dissolvido em TE para a seringa e retire todo o líquido da coluna pela fiação.
    8. Coloque a coluna em um tubo de plástico de 15 mL, carregar as sondas marcadas na coluna e girar à temperatura ambiente (definir o centrifugador a x 750 g, permitem que o rpm aumentar até 750 g x é atingido, então pare o centrifugador e permitir a rotação que recusar a 0 x g) para eluir a sonda. Adicionar 200 µ l de TE para a coluna e rotação para eluir a sonda restante; repeti uma vez. Nestas condições, rotulada de fragmentos de DNA são excluídos da matriz Sephadex em eluir, enquanto livre nucleotídeos permanecem na coluna.
    9. Use 300 µ l das sondas marcadas por tubo de hibridização. Manter a restante sondas marcadas a-20 ° C para uso posterior. No entanto, ter a metade do tempo de ATP [32P] em mente.
  7. Cruzar o borrão de DNA.
    1. Calor 2 x SSC e tampão de hibridização (15 mL por tubo de hibridização, máximo de 2 blots por tubo) para 65 ° C. (Tampão de hibridização: 10% de sulfato de dextrano, SDS 1%, 1 M NaCl, pH de Tris 50mm 7.5, dissolver a 65 ° C, manter alíquotas a-20 ° C).
    2. Pré-aqueça o forno de hibridização a 65 ° C.
    3. Coloque o engranzamento de nylon em uma bandeja com um pouco de aquecida (65 ° C) 2 x SSC para cobrir a bandeja. Coloque o borrão de DNA em cima da malha, com o lado de DNA. Rolar o blot juntamente com a malha e inserir o rolo em um tubo de hibridização. Deite fora o excesso 2 x SSC.
    4. Em um tubo de microcentrifugadora, ferver 150 µ l de DNA de esperma de salmão (concentração de 10 mg/mL) por tubo de hibridização por 5 min (Veja também passo 4.6.3). Arrefecer imediatamente no gelo e adicionar para o tampão de hibridização pré-aquecido.
    5. Adicione a solução de esperma de salmão-tampão hibridização para o tubo com o Borrão. Pre-cruzar a 65 ° C, durante pelo menos 1 h em uma roda giratória, em 12 rpm.
    6. Quando a pré-incubação na etapa 4.7.5. está quase terminado, ferva 300 µ l das sondas marcadas por 5 min (Veja também passo 4.6.3) e adicione imediatamente para o Borrão após a incubação.
    7. Cruzar a noite na roda rotativa a 63 ° C, 12 rpm. Não pipete a sonda diretamente sobre a mancha, mas para a solução de esperma de salmão-tampão hibridização.
  8. Lave o Borrão.
    1. Pré-aqueça as soluções de lavagem (1 x SEPI, 0,1% SDS e 0.1 x SSPE, 0,1% SDS) para 65 ° C. (20 x SSPE: 3 M NaCl, 230mm NaH2PO4, 20mm EDTA, pH 7,0).
    2. Descartar a solução de hibridização e adicionar cerca de 100-150 mL de 1 x SSPE, solução de SDS 0,1% para o tubo de hibridização, fechar o tubo e gire com a mão. Despeje a hibridação e lavagem com solução em resíduos radioactivos líquidos apropriados.
    3. Adicionar cerca de 100-150 mL de 1 x SSPE, solução de SDS 0,1% para o tubo, fechar e incubar o tubo por 15 min a 63 ° C, na roda giratória, 12 rpm. Descarte a solução de lavagem adequada.
    4. Adicionar cerca de 100-150 mL de 0.1 x SSPE, solução de SDS 0,1% para o tubo de hibridização, fechar e gire o tubo por 5 min a 63 ° C, 12 rpm. Descarte a solução de lavagem adequada.
    5. Pegue o borrão do tubo e colocá-lo em uma bandeja contendo suficientes pré-aquecido 0.1 x SEPI, 0,1% SDS e agitar durante 3 min em um tremendo banho de água a 65 ° C. Enquanto isso, lave a malha em uma bandeja cheia de água.
    6. Tirar a mancha, coloque-a entre as de plástico pre-dobrado (tubulação de polietileno), cuidadosamente Limpe o excesso de líquido e deixe a mancha secar brevemente. Note-se que o líquido vai estragar a tela phosphorimager.
    7. Sele o borrão em plástico nos três lados. Retire todo excesso de líquido em torno da mancha e feche o tubo plástico selando o quarto lado. Corte o excesso de plástico. Certifique-se de blot selado não está vazando, e que o plástico é seco do lado de fora.
  9. Expor a tela phosphorimager.
    1. Coloque o blot selado em uma gaveta de phosphorimager, com a tela de phosphorimager, voltada para o lado de DNA do blot. Feche a gaveta e deixar por ± 2-4 dias, dependendo a força do etiquetar radioativo e sensibilidade do phosphorimager.
    2. Varredura da tela de phosphorimager usando um phosphorimager. Cuide-se para expor a tela o menos possível à luz antes da digitalização. Salve a imagem. Apaga a tela do sinal por expô-lo à luz brilhante.
  10. Analise o Borrão.
    1. A análise depende da estratégia de restrição utilizada na etapa 4.1. Ao analisar o blot preparado de acordo com a estratégia mostrada na etapa 4.1.1.1 (Figura 4A), conte o número dos fragmentos detectados. Nesta estratégia, o número de fragmentos hibridizados refere-se ao número de integrações de T-DNA.
      1. Compare o número de fragmentos detectados com uma sonda para a esquerda (Figura 7B) e parte do T-DNA (Figura 7).
        Nota: Se um número diferente de fragmentos hybridizing é detectado, então qualquer i) várias cópias T-DNA (seja na orientação invertida ou direta) ou integrado ii) incompleta T-DNAs estão presentes.
      2. Estimar o tamanho dos fragmentos hibridizados em blot baseado no tamanho das bandas marcador e compara os tamanhos dos fragmentos hibridizados com o fragmento esperado os tamanhos calculados com base na estratégia de restrição do inserções em tandem (Figura 4A) Identifica o arranjo possível em tandem dos T-DNAs. Use a Figura 4A como um guia para calcular o tamanho dos fragmentos esperados.
        Nota: Se o tamanho dos fragmentos hibridizados não concorda com riscos calculados, então mais provável um dos presentes as integrações não está completo.
    2. Ao analisar o blot preparado de acordo com a estratégia mostrada na etapa 4.1.1.2 (Figura 4B), estimar o tamanho do fragmento hybridizing sobre o blot baseado no tamanho das bandas do marcador e compará-lo com o tamanho esperado. Uma inserção intacta produz um único fragmento com um comprimento definido. Qualquer desvio do comprimento esperado indica integração incompleta (Figura 7).
  11. Tira o Borrão para re-hibridização (opcional).
    Nota: O mesmo borrão pode ser hibridizado consecutivamente com diferentes sondas. Antes de continuar com uma nova sonda, tira uma sonda anterior hibridizada de blot.
    1. Para remover a sonda do blot, coloque o borrão em uma bandeja com seu DNA-lado virado para baixo. Despeje um excedente de 0,5% SDS a bandeja. Ferva a membrana por 2 – 5 min. A duração do tratamento depende do tamanho e GC-conteúdo da sonda usada. Sondas de GC-mais rico e mais precisam de um tratamento mais longo.
    2. Após o descascamento, cruzar o blot com outra sonda, ou selo e armazenar a-20 ° C.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando o sistema de BIBAC-GW, construções de repórter para estudar ODM em plantas foram gerados10. Construções foram projetadas no Gateway de entrada vetor pENTR-gm12 e inseridas no pBIBAC-BAR-GW (Figura 1), usando a reação de recombinação Gateway LR.

Arabidopsis foram transformados com pDM19, um BIBAC-BAR-GW plasmídeo com um repórter de mTurquoise-eYF...

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Discussion

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Crítico para a geração de transgênicos com integrações único, intactos de um transgene é a escolha do vetor binário usado. Vetores de família BIBAC têm sido utilizados para entregar muitos planta espécie23,24,25,26,,27,28-sequências de interesses. Vetores BIBAC, incluindo BIBAC-GW, rendem cópia única integrações com eficiênci...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa é suportada pelo holandês tecnologia Foundation STW (12385), que faz parte da organização de países baixos para a pesquisa científica (NWO), e que é parcialmente financiado pelo Ministério dos assuntos económicos (OTP Grant 12385-MS).  Agradecemos a Carol M. Hamilton (Universidade de Cornell, Estados Unidos) para a prestação de pCH20, a espinha dorsal dos vetores BIBAC-GW.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sulfato de canamicina monohidratadoDuchefaK0126
Sulfato de gentamicinaDuchefaG0124
RifampicinaDuchefaR0146
Cloridrato de tetraciclinaSigmaT-3383
DB3.1 células competentesThermo Scientific - Invitrogen11782-018One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) da Invitrogen ou qualquer outra cepa resistente a ccdB E. coli pode ser usada em seu lugar   
Células competentes DH10BThermo Scientific - Invitrogen18290-015
Mix de enzimas clonase LR Gateway Thermo Scientific - Invitrogen11791-019
citrato de tri-sódio dihidratadoBase Merck106432
TrizmaSigma-AldrichT1503
EDTA dissódico dihidratadoDuchefaE0511
Proteinase KThermo Scientific EO0491
BactotriptonaBD211705
Extrato de leveduraBD212750
Cloreto de sódioHoneywell Fluka13423
Cloreto de potássioMerck104936
D(+)-Glicose monohidratadaMerck108346
Cuvetes de eletroporação, 0,1 cm de folgaBiorad
Electroporator Gene PulserBioRad
Sulfato de magnésio heptahidratadoCalbiochem442613
D(+)-Maltose monohidratado 90%Acros Organics32991
SacaroseSigma-Aldrich84100
Silwet L-77Fisher ScientificNC0138454
Murashige Meio SkoogDuchefaM0221
AgarBD214010
Glufosinato-amônio (Basta)Bayer79391781
Enzimas de restriçãoNEB
Brometo de EtídioBio-Rad1610433
Sistema de eletroforeseBio-Rad
Hidróxido desódioÁcido
Membranade
de borrão Hybond N+Sigma Aldrich15358ou GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Papel mata-borrãoGE Healthcare Life Sciences3030-931
dNTPThermo FisherR0181
Acetilado BSASigma-AldrichB2518
HEPESSigma-AldrichH4034
2-MercaptoetanolMerck805740
Sephadex G-50 GrossoGE Healthcare Life Sciences17004401ou Sephadex G-50 Médio (17004301)
Dextran sulfato de sódio sal de sódioSigma-AldrichD8906
Dodecil Sulfato de Sódio US BiologicalS5010
Salmon Sperm DNASigma-AldrichD7656
Monohidrato de di-hidrogenofosfato de sódio Telade fósforo Merck106346
StorageGE Healthcare Life Sciences28-9564-74
Imager de fósforoGE Healthcare Life SciencesTyphoon FLA 7000
UV CrosslinkerStratageneStratalinker 1800
filme plástico (envoltório de Saran)Omnilabo1090681
AgaroseThermo Scientific - Invitrogen16500
Ácido bóricoMerck100165
marcador de DNA ' Blauw'; Escada de DNA.MRC HollandMCT8070
marcador de DNA ' Rood'; Escada de DNAMRC HollandMCT8080
Mistura de HexanucleotídeosRoche11277081001
Kit de Construção GrandeQiagen12462
Tubo de polietileno selável a quente, transparentevários fornecedoresa largura do tubo deve ser maior do que a da membrana de borrão
Selador
Filtro de membrana discoMerckVSWP02500
Cloreto de magnésioMerck105833
Malha de hibridizaçãoGE Healthcare Life SciencesRPN2519
1652089 clorídrico Merck 106498 de nylon 100316 e térmico

References

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