Artigo de método

Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação

DOI:

10.3791/57322

⸱

6 de maio de 2018

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1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo permite que o leitor a analisar a formação de biofilme induzida por sais biliares em patógenos entéricos, usando uma abordagem multifacetada para capturar a natureza dinâmica dos biofilmes bacterianos avaliando aderência, formação de matriz extracelular de substâncias poliméricas, e dispersão.

Resumo

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Formação de biofilme é um processo dinâmico, vários estágios que ocorre em bactérias sob condições ambientais adversas ou momentos de estresse. Para patógenos entéricos, uma resposta de estresse significativo é induzida durante o trânsito gastrointestinal e após a exposição de bile, um componente normal da digestão humana. Para ultrapassar os efeitos bactericidos da bile, muitos patógenos entéricos formam um biofilme hipótese para permitir a sobrevivência, quando em trânsito através do intestino. Aqui nós apresentamos metodologias para definir a formação de biofilme por meio de ensaios de fase sólida aderência bem como deteção de matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e visualização. Além disso, a avaliação da dispersão de biofilme é apresentada para imitar a análise de eventos, desencadeando a liberação de bactérias durante o processo de infecção. Coloração violeta cristal é usado para detectar bactérias aderentes em um ensaio de aderência de placa de 96 poços de alta produtividade. Avaliação de produção de EPS é determinada por dois ensaios, nomeadamente microscopia coloração da matriz EPS e análise semi-quantitativa com uma lectina de ligação de polissacarídeo conjugado fluorescente. Finalmente, dispersão de biofilme é medido através de contagens de colônia e chapeamento. Dados positivos de vários ensaios apoiar a caracterização de biofilmes e podem ser utilizados para identificar a formação de biofilme induzida por sais biliares em outras cepas bacterianas.

Introdução

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Formação de biofilme é uma estratégia de sobrevivência bacteriana importante induzida durante condições ambientais adversas. Exposição aos compostos bactericidas como antibióticos ou alterações nos nutrientes ou disponibilidade de oxigênio induz um estado estressado em bactérias que podem ser aliviados através da formação de biofilme. Um biofilme é caracterizado pela fixação bacteriana de uma superfície ou outras bactérias e é acompanhado pela secreção de uma matriz EPS, composto principalmente de polissacarídeos1,2,3. Formação de biofilme é um processo dinâmico, no qual uma ....

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Protocolo

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1. preparação dos reagentes

  1. Médio de sais biliares: para preparar o caldo tryptic soja (TSB) contendo 0,4% (peso/volume) de sais biliares, resuspenda 200 mg de sais biliares em 50ml TSB autoclavado. Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Fazer meio fresco semanalmente.
    Notas: Os sais biliares rotineiramente utilizados é uma mistura 1:1 de colato de sódio e sódio Deoxycholate do isolado de vesículas de ovinos e bovinas. Como demonstrado anteriormente4, a presença de glicose foi necessária para a formação de biofilme induzida por sais biliares. TSB tem adicionado glicose em relação ao caldo de Luria-Bertani (LB); e, por c....

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Resultados

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Na Figura 1, a formação de biofilme é induzida na maior parte do crescimento de seguir testadas seis patógenos entéricos em meios contendo sais biliares. Um aumento significativo de bactérias aderentes após exposição de sais biliares é observada em quase todas as cepas testadas. A exceção é enteroaggregative e. coli (CEEA); no entanto, observe a observação induzida do Δaaf mutante4. Os resultados indicam que.......

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Discussão

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Análise da formação de biofilme é um desafio devido a natureza dinâmica dos biofilmes e a variabilidade entre as cepas, materiais, laboratórios e ensaios. Aqui, apresentam-se várias estratégias para determinar a formação de biofilme em patógenos entéricos, após exposição de sais biliares, com uma visão experimental fornecida para promover a reprodutibilidade. Existem considerações adicionais para garantir a reprodutibilidade. Primeiro e acima de tudo, recomendamos executar independente de pelo menos três experiências de .......

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Divulgações

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Os autores têm sem divulgações.

Agradecimentos

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Agradecemos a Rachael B. Chanin e Alejandro Llanos-cocho para assistência técnica. Agradecemos a Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski e Bobby Cherayil para as estirpes utilizadas neste estudo. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de alergia e K22AI104755 de Grant de doenças infecciosas (serologia). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Caldo de soja trípticoSigma-Aldrich22092-500G
Cristal VioletaSigmaC6158-50
Concanavalina-A FITCSigmaC7642-10mg
GlicoseSigmaG7021-1KG
Sais biliaresSigmaB8756-100G
LB AgarSigmaL7533-1KG
Tubos de cultura de 14 mL, 17 x 100 mm, plástico, estéreisFisher14-959-11B
Vectashield hard-set antifade com DAPIVector LaboratoriesH-1500
FormaldeídoSigma-AldrichF1635-500
GluteraldeídoSigma-AldrichG6257
Placas de fundo plano de 96 poços (transparentes)TPP92696
Placas de fundo plano de 96 poços (pretas)Greiner Bio-One655076
Placas de fundo plano de 24 poços (transparentes)TPP92424
Lamínulas de vidro 12mm, redondasFisher08-774-383
Leitor de placas de 96 poçosSpectramax
Leitor de placas fluorescentesBiotek Synergy 2
Confocal ou Fluorescente MicroscópioNikon A1 microscópio
37° C Shaking IncubatorNew Brunswick Scientific Excella E25
37° Incubadora de placas CThermolyne Series 5000
confocal

Referências

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  1. Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R....

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