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Introduction
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Immunology and Infection

Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação

Published: May 06, 2018
doi:
10.3791/57322
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,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition,Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics,Harvard Medical School

Summary

Este protocolo permite que o leitor a analisar a formação de biofilme induzida por sais biliares em patógenos entéricos, usando uma abordagem multifacetada para capturar a natureza dinâmica dos biofilmes bacterianos avaliando aderência, formação de matriz extracelular de substâncias poliméricas, e dispersão.

Abstract

Formação de biofilme é um processo dinâmico, vários estágios que ocorre em bactérias sob condições ambientais adversas ou momentos de estresse. Para patógenos entéricos, uma resposta de estresse significativo é induzida durante o trânsito gastrointestinal e após a exposição de bile, um componente normal da digestão humana. Para ultrapassar os efeitos bactericidos da bile, muitos patógenos entéricos formam um biofilme hipótese para permitir a sobrevivência, quando em trânsito através do intestino. Aqui nós apresentamos metodologias para definir a formação de biofilme por meio de ensaios de fase sólida aderência bem como deteção de matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e visualização. Além disso, a avaliação da dispersão de biofilme é apresentada para imitar a análise de eventos, desencadeando a liberação de bactérias durante o processo de infecção. Coloração violeta cristal é usado para detectar bactérias aderentes em um ensaio de aderência de placa de 96 poços de alta produtividade. Avaliação de produção de EPS é determinada por dois ensaios, nomeadamente microscopia coloração da matriz EPS e análise semi-quantitativa com uma lectina de ligação de polissacarídeo conjugado fluorescente. Finalmente, dispersão de biofilme é medido através de contagens de colônia e chapeamento. Dados positivos de vários ensaios apoiar a caracterização de biofilmes e podem ser utilizados para identificar a formação de biofilme induzida por sais biliares em outras cepas bacterianas.

Introduction

Formação de biofilme é uma estratégia de sobrevivência bacteriana importante induzida durante condições ambientais adversas. Exposição aos compostos bactericidas como antibióticos ou alterações nos nutrientes ou disponibilidade de oxigênio induz um estado estressado em bactérias que podem ser aliviados através da formação de biofilme. Um biofilme é caracterizado pela fixação bacteriana de uma superfície ou outras bactérias e é acompanhado pela secreção de uma matriz EPS, composto principalmente de polissacarídeos1,2,3. Formação de biofilme é um processo dinâmico, no qual uma cascata de eventos culmina na formação de uma comunidade bacteriana aderente maduro1,2,3. As bactérias produzem adesinas para facilitar a fixação cedo enquanto deslocamento adesina perfis de expressão de gene para fortalecer o acessório durante a maturação do biofilme. Simultaneamente, a produção de EPS ocorre ao brasão da comunidade bacteriana em uma matriz para proteger as células contra o estressor inicial. Contido dentro do biofilme de bactérias são de crescimento lento; e como tal, a maioria dos antibióticos processa ineficaz. Além disso, o crescimento lento economiza energia até que as condições mudam para favorecer o crescimento bacteriano1,2,3. Depois de tem passado as duras condições, bactérias dispersarem o biofilme e retomar um lifestyle planctônicos1,2,3. Tradicionalmente, os biofilmes são observados em superfícies e representam um desafio clínico persistente devido a reservatórios de infecção presentes em cateteres e dispositivos de em-moradia a1,2,3.

Formação de biofilme foi recentemente descrita por vários patógenos entéricos; bactérias que infectam o intestino delgado ou cólon4. Para espécies de Shigella , , a infecção ocorre no cólon humano após um trânsito através da maioria do tracto gastrointestinal. Durante a passagem através do intestino, Shigella é exposto a bílis; um detergente degradante de lipídios secretado no intestino para facilitar a digestão de lipídios enquanto simultaneamente mata a maioria das bactérias5. Patógenos entéricos têm uma capacidade única de resistir os efeitos bactericidos da bile6. Nossa análise recente utilizado na vivo-como combinações de glicose e de sais biliares para demonstrar a formação de biofilme robusto em S. flexneri , bem como outras espécies de Shigella, patogênica Escherichia colie Salmonela4. Anteriormente, a Salmonella enterica sorovar Typhi mostrou-se para formar um biofilme induzida por bile devido à colonização exclusivo da vesícula biliar durante a infecção crônica7,8,9, 10. Além disso, pesquisas anteriores com Vibrio11e Campylobacter12 demonstraram a formação de biofilme em resposta a bile. Portanto, as análises estendido as observações de formação de biofilme induzida por bile para outros patógenos e ajudam a estabelecer a demonstração de uma resposta de patógeno entérico conservada a bile. Ao contrário de biofilmes crônicas em que transcrição do gene bacteriano é limitada e senescência celular pode ocorrer1,2,3, propomos que o biofilme induzida por bile entérico é mais transitório na natureza. Este transiente, virulenta biofilme é caracteriza por uma rápida desmontagem (como visto no ensaio de dispersão) e reforçada a expressao de genes de virulência observado no biofilme população4,6. 

Como formação de biofilme é um processo dinâmico, multifacetado e o uso de sais biliares, como um fator primário só foi recentemente descrito por patógenos entéricos mais, as ferramentas e técnicas utilizadas são únicas e criativas aplicações dos métodos tradicionais. Assim, aqui apresentados são três estratégias complementares para quantificar várias características importantes da formação de biofilme induzida por sais biliares, incluindo a aderência bacteriana, produção da matriz EPS e a dispersão de bactérias viáveis desde o biofilme. Estas técnicas têm sido utilizadas principalmente para pesquisa com Shigella; e, por conseguinte, a avaliação de outros patógenos entéricos pode exigir otimização. No entanto, dados positivos de todos os três ensaios apoiar a identificação de biofilmes e estabelecer protocolos podem ser reproduzidos para a formação de biofilme induzida por sais biliares.

Protocol

1. preparação dos reagentes Médio de sais biliares: para preparar o caldo tryptic soja (TSB) contendo 0,4% (peso/volume) de sais biliares, resuspenda 200 mg de sais biliares em 50ml TSB autoclavado. Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Fazer meio fresco semanalmente.Notas: Os sais biliares rotineiramente utilizados é uma mistura 1:1 de colato de sódio e sódio Deoxycholate do isolado de vesículas de ovinos e bovinas. Como demonstrado anteriormente4, a presença de glicose foi necessária para a formação de biofilme induzida por sais biliares. TSB tem adicionado glicose em relação ao caldo de Luria-Bertani (LB); e, por conseguinte, foi suficiente para induzir a formação de biofilme em Shigella e outros patógenos entéricos analisados. Dependendo as bactérias a serem analisados, podem ser necessária a concentrações diferentes de glicose ou açúcar diferentes exigências. 0,5 violeta de cristal % p/v em água: dissolver 2,5 g de cristal violeta em 500 mL de água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Concanavalina A (ConA) conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC): reconstituir o estoque em 1X PBS. Diluir o estoque de 10 mg de concentrado com 400 μL de 1X PBS a uma concentração final de 25 µ g/mL e proteger da luz. PBS + glicose: Dissolver glicose 0,2 g em 10 mL 1X PBS (glicose 2% w/v final). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Certifique-se fresco no dia do uso. PBS + sais biliares: Dissolver 40 mg em 10 mL 1X PBS (0,4% w/v de sais biliares finais). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Certifique-se fresco no dia do uso. PBS + glicose e sais biliares: dissolver 40 mg de sais biliares e glicose 0,2 g em 10 mL 1X PBS (0,4% w/v de sais biliares e 2% p/v glucose final). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Certifique-se fresco no dia do uso. Prepare-se placas de ágar LB. Correção de formaldeído/glutaraldeído: 810 adicione formaldeído de µ l (solução-mãe de 37%, 3% de concentração final) e 125 µ l o glutaraldeído (solução estoque de 25%, 0,25% de concentração final) para 14 mL 1X PBS. Misture bem e armazenar a 4 ° C. A correção deve ser fria para o uso adequado.Atenção: A correção é tóxica e requer a eliminação de resíduos perigosos. Solução para montagem antidesgaste: usar antidesgaste para montagem solução contendo 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) mancha para inibir fotobranqueamento de amostras de microscopia de imunofluorescência, enquanto o ADN das bactérias de coloração fluorescente. 2. preparação de bactérias Cresce durante a noite culturas das cepas bacterianas para ser testado por inocular 3 mL de TSB com uma colônia única, bem isolada em um tubo estéril de cultura. Incube a 37 ° C com agitação a 225 rpm para incubação overnight (16-24 h).Nota: Cepas devem ser restreaked dos estoques de congelador cada 2 a 4 semanas e mantida em placas não mais de 2 semanas de idade. 3. fase sólida aderência ensaio Nota: Este teste quantifica bactérias aderentes, usando um método de placa de 96 poços. As bactérias são crescidas estaticamente em placas de fundo plano. Lavar roupa é realizada para remover as bactérias não-aderentes e aderentes bactérias são coradas com violeta de cristal. A mancha de violeta cristal vincula peptidoglicano na parede celular bacteriana e pode ser solubilizada usando etanol. O número de bactérias aderentes é determinado com base na retenção de violeta cristal. Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + sais biliares (BS). Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos. Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (em um 01:50 diluição). Em uma placa de 96 poços estéril, clara, fundo chato, cultura de tecidos tratados, adicione 130 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de mídia (TSB e TSB + BS) para ser testado. Adicionar 130 µ l/poço de cultura inoculado em três poços e repita até que todas as condições experimentais são banhadas em triplicado. Incube durante 4-24 h a 37 ° C estaticamente. Usando um leitor de placas, registo o OD600. Definir os poços de controle como ’em branco’. Confirme que o meio de controle é claro sem evidência de turbidez. Se for detectada qualquer turbidez, descarte o experimento. Os valores de600 OD podem ser usados para normalizar os dados se existem diferenças significativas na taxa de crescimento entre estirpes de bactérias. Remova o meio de cultura usando uma linha de vácuo, inclinar suavemente a placa e lentamente por aspiração do meio na borda inferior do poço. Não se esqueça de coletar todos os meio de cultura sem interromper a população bacteriana aderente localizada na superfície de plástico. Se a matriz EPS foi produzido durante o tempo de incubação, a matriz será ser visualizada como um precipitado branco. Não perturbe a matriz EPS. Delicadamente lave os poços uma vez com 200 µ l de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo. Inverta a placa para secar. Permita um mínimo de 20 min para secar.Nota: Uma vez que o biofilme deve ser secado completamente antes de coloração, o protocolo pode ser pausado neste passo por algumas horas ou até mesmo durante a noite. O tempo de secagem adicionado não irá alterar o procedimento de coloração enquanto Secagem incompleta afetarão a quantificação dos resultados e reprodutibilidade. Adicione 150 µ l de violeta de cristal de 0,5% para cada experimental e controle bem. Incube durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Lave os poços uma vez com 400 µ l de água destilada. O volume adicionado ajuda a remover a mancha violeta de cristal residual dos lados dos poços. Remova a lavagem com a linha de vácuo. Lave os poços cinco vezes com 200 µ l de água destilada. Remova a lavagem com a linha de vácuo.Nota: A lavagem completa é importante para a quantificação. Quando os poços em branco são clara da água destilada e não contêm qualquer mancha residual violeta de cristal, prossiga para a próxima etapa. Inverta a placa para seco, protegido da luz. Certifique-se de secagem completa da placa conforme mencionado acima. Destain os poços com 200 µ l de etanol a 95%. Incube a placa no agitador por 30 min. Para evitar a evaporação, particularmente em umas mais altas temperaturas, execute esta etapa a 4 ° C. Usando um leitor de placas, registo o OD540.Nota: O comprimento de onda de absorbância máxima de violeta cristal está perto de 590 nm. A literatura relata uma faixa de OD540 – OD5954,13,14,15,16 de absorvância de cristal violeta; assim, escolha um comprimento de onda disponível com base no leitor. 4. deteção de Matrix EPS Nota: Estes ensaios complementares quantificar e visualizar o EPS. Em ambos, EPS é detectada usando uma lectina vincular polissacarídeos. A proteína fluorescente conjugado permite a quantificação (passo 4.1) ou visualização (etapa 4.2). Detecção semi-quantitativa de EPS Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + BS. Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos. Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (um 01:50 diluição). Em uma placa de 96 poços estéril, preta, fundo chato, cultura de tecidos tratados, adicione 130 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de meio a ser testado. Adicionar 130 µ l/poço de cultura inoculado nos poços e repita até que todas as condições experimentais são banhadas em triplicado. Incube durante 4-24 h a 37 ° C estaticamente. Transfira o meio de cultura para uma placa de 96 poços claros com uma pipeta, idealmente uma pipeta multicanal. Seja cauteloso para coletar todo o meio de cultura sem interromper a população aderente e/ou o EPS localizado na superfície de plástico. Posta de lado. Fixe a placa preta para 15 min RT usando 200 µ l/poço do formaldeído/glutaraldeído em 1X PBS. Enquanto a população aderente é fixação, avalie a fração sobrenadante da etapa 4.1.6. Usando um leitor de placas, registo o OD600. Definir os poços de controle como ’em branco’. Confirme que o meio de controle é claro sem evidência de turbidez. Se for detectada qualquer turbidez, descarte o experimento. Alternativamente, o ensaio inteiro pode ser executado em um prato fundo preto transparente. Nessas circunstâncias, os valores de600 OD podem ser gravados e o meio de cultura pode ser posteriormente descartado antes de prosseguir para a etapa 4.1.7. Os valores de600 OD podem ser usados para normalizar os dados no caso, existem diferenças significativas na taxa de crescimento entre estirpes de bactérias. Remover a correção e eliminação de resíduos perigosos. Delicadamente lave os poços duas vezes com 200 µ l/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo por inclinar suavemente a placa e aspirando lentamente a lavagem na borda inferior do poço. Adicionar 150 µ l/poço de 25 µ g/mL ConA-FITC e incube por 15 min no RT Delicadamente, lave duas vezes com 200 µ l de PBS. Adicione 150 µ l de PBS a cada poço. Gravar a fluorescência em 488 nm. Visualização de microscopia confocal da produção de EPS e cálculo da espessura do biofilme Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + BS. Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos. Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (em um 01:50 diluição). Configure uma placa de 24 estéril com 12 mm estéril ronda as lamelas de vidro. Adicione 400 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de meio a ser testado. Adicionar 400 µ l de cultura inoculada poços em duplicado e repita até que todas as condições experimentais são banhadas. Incube durante 4-24 h a 37 ° C estaticamente. Confirme visualmente crescimento na condição TSB, crescimento e precipitado EPS (branco) no TSB + condição de BS e não há crescimento e/ou precipitado branco em poços de controle estéril. Remova os sobrenadantes. Correção para 15 min em RT usando 200 µ l/poço de solução de formaldeído/glutaraldeído em 1X PBS. Remova a correção e descarte de resíduos perigosos. Delicadamente lave os poços duas vezes com 200 µ l/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo. Adicionar 150 µ l/poço de 25 µ g/mL ConA-FITC e incube por 15 min no RT Delicadamente, lave duas vezes com 200 µ l/poço de PBS. Montar com solução de antidesgaste para montagem com DAPI.Nota: A solução é uma solução de montagem de ready-made, com base em glicerol contendo DAPI para preservar a etiqueta fluorescente enquanto simultaneamente a coloração do DNA em células bacterianas para visualização como um corante de contraste. Siga as direções e recomendações do kit para tempos de incubação antes da imagem latente de amostras. O DAPI mancham o procedimento pode ser realizado antes da aplicação de solução de antidesgaste para montagem que não contenha DAPI. Avalie pela microscopia confocal. Em um microscópio confocal, defina o laser para 495 nm/519 nm excitação/emissão para visualização FITC. Como um segundo laser 360 nm/460 nm excitação/emissão de Visualizar DAPI. Localize o biofilme, centrando-se no canal DAPI. Usar canais da DAPI e FITC para determinar a espessura total e definir a parte superior e inferior da imagem latente as fronteiras. Grave imagens de toda a sua espessura Z-pilha capturando imagens cada 0,25 µm após definir perímetros para a parte superior e inferior da pilha-z. Para obter mais informações sobre microscopia confocal, consulte publicações pelo Paddock et al 17 , 18 , 19 , 20 Reconstrua as imagens 3D no ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) para visualizar a formação de biofilme completo e calcular a espessura do biofilme. A espessura média obtida para S. flexneri sais biliares induzidos biofilmes foi 14 µm4. 5. ensaio de dispersão Nota: Neste ensaio, a desmontagem do biofilme através de dispersão bacteriana é detectada. Aqui, biofilmes maduros são estabelecidos e posteriormente (normalmente no dia seguinte), os meios de comunicação são substituídos com PBS ou completadas PBS. O componente sobrenadante é então avaliado para quantificar o número de bactérias que podem ter dissociada do biofilme. Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + BS. Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos. Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (em um 01:50 diluição). Em uma placa de 96 poços estéril, clara, fundo chato, cultura de tecidos tratados, adicione 130 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de mídia a ser testado. Adicionar 130 µ l/poço de cultura inoculado três poços e repita até que todas as condições experimentais são banhadas em triplicado. Incube a placa para 4-24 h a 37 ° C estaticamente. Antes de continuar, aquecer a PBS, PBS glicose, PBS + sais biliares e PBS + sais biliares + glicose a 37 ° C. Prepare estas diariamente frescos de reagentes. Usando um leitor de placas, registo o OD600. Definir os poços de controle como ’em branco’. Confirme que o meio é claro sem evidência de turbidez. Se for detectada qualquer turbidez, descarte o experimento. Os valores de600 OD podem ser usados para normalizar os dados se existem diferenças significativas na taxa de crescimento entre estirpes de bactérias. Remova o meio de cultura usando uma linha de vácuo. Não se esqueça de coletar todos os meio de cultura sem interromper a população aderente localizada na superfície de plástico. Delicadamente lave os poços duas vezes com 200 µ l/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo. Substituir a lavagem com 130 µ l/poço das seguintes três poços cada: PBS, PBS glicose, PBS + sais biliares e PBS + sais biliares + glicose. Estes reagentes devem ser pré-aquecido a 37 ° C. Incubar a placa por 30 min a 37 ° C. Retire cuidadosamente a placa de incubadora a 37 ° C. Transferi os sobrenadantes para uma placa de 96 poços fresca, estéril. Usando um bloco de 96 poços placa ou diluição, preparar o 10-fold (01:10) diluições em série do líquido sobrenadante em PBS estéril.Nota: A série de diluição deve variar de não diluída a 10-6 , dependendo da estirpe bacteriana a ser testado. Experiências piloto podem ser realizadas para determinar o intervalo ideal de diluição. Detectar a placa de 5 µ l de cada diluição em ágar LB usando uma pipeta multicanal. Incube a 37 ° C durante a noite. Contagem das colónias no próximo dia e conta para o factor de diluição, ao determinar a recuperação unidades formadoras (CFU). Para calcular a dispersão por cento em relação a 1 x controle de PBS (fixado em 100%), divida a recuperação CFU de cada condição de tratamento da recuperação CFU das amostras de controlo de PBS 1x.Nota: As placas de mídia de rotina para a estirpe bacteriana de interesse também podem ser usadas. Por exemplo, Shigella pode ser revestido em placas de vermelho Congo. Certifique-se que as placas estão secas por técnicas adequadas de ponto-chapeamento.

Representative Results

Na Figura 1, a formação de biofilme é induzida na maior parte do crescimento de seguir testadas seis patógenos entéricos em meios contendo sais biliares. Um aumento significativo de bactérias aderentes após exposição de sais biliares é observada em quase todas as cepas testadas. A exceção é enteroaggregative e. coli (CEEA); no entanto, observe a observação induzida do Δaaf mutante4. Os result…

Discussion

Análise da formação de biofilme é um desafio devido a natureza dinâmica dos biofilmes e a variabilidade entre as cepas, materiais, laboratórios e ensaios. Aqui, apresentam-se várias estratégias para determinar a formação de biofilme em patógenos entéricos, após exposição de sais biliares, com uma visão experimental fornecida para promover a reprodutibilidade. Existem considerações adicionais para garantir a reprodutibilidade. Primeiro e acima de tudo, recomendamos executar independente de pelo menos tr?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Rachael B. Chanin e Alejandro Llanos-cocho para assistência técnica. Agradecemos a Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski e Bobby Cherayil para as estirpes utilizadas neste estudo. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de alergia e K22AI104755 de Grant de doenças infecciosas (serologia). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Materials

Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich  22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G 
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500 
Formaldehyde Sigma-Aldrich  F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One  655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000
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References

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Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

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Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).
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