Artigo de método

Preparação, purificação e utilização de lipossomas contendo ácido graxo

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DOI:

10.3791/57324

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9 de fevereiro de 2018

 ,  ,  , 
1Howard Hughes Medical Institute and Department of Molecular Biology and Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University, 3Department of Genetics, Cell Biology, and Development, University of Minnesota

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Lipossomas contendo amphiphiles de cadeia única, particularmente os ácidos gordos, apresentam propriedades distintas, em comparação com aqueles que contém diacylphospholipids devido às propriedades químicas únicas de cadeia única amphiphiles. Aqui descrevemos técnicas para a preparação, purificação e utilização de lipossomas composto em parte ou toda a estes amphiphiles.

Resumo

Lipossomas contendo amphiphiles de cadeia única, particularmente ácidos graxos, apresentam propriedades distintas, em comparação com aqueles que contêm diacylphospholipids devido às propriedades químicas únicas estas amphiphiles. Em particular, lipossomas de ácido graxo realçam o carácter dinâmico, devido a solubilidade relativamente elevada de cadeia única amphiphiles. Da mesma forma, os lipossomas contendo ácidos graxos livres são mais sensíveis aos cátions divalentes e sal, devido as interações fortes entre a cabeça grupos carboxila e íons metálicos. Aqui ilustramos as técnicas de preparação, purificação e utilização de lipossomas composto em parte ou a totalidade de amphiphiles de cadeia única (por exemplo, ácidos oleico).

Introdução

Lipossomas, ou vesículas – compartimentos delimitadas por membranas de BICAMADA compostas de lipídios anfifílica - tem encontrado uso em inúmeras aplicações biomédicas como veículos de entrega para uso farmacêutico, modelos das membranas celulares e para o desenvolvimento de sintético células. Nós e os outros também empregada lipossomas como modelos de primitivo das membranas celulares, no início da vida. 1 , 2 , 3 , 4 normalmente, em tais sistemas, nós empregamos amphiphiles de cadeia única contendo cauda de hidrocarbonetos único lipídico (por exemplo, ácido oleico), como estas moléculas são mais simples de sintetizar sem o benefício das células modernas empregam enzimas proteína codificada.

Composto de lipídios de cadeia única de lipossomas são semelhantes aos formados a partir de diacylphospholipids (por exemplo, 1-palmitoil-2-oleoilo -sn- glicero-3-fosfocolina, ou POPC) em que o limite é composto por membranas de BICAMADA. Lipossomas, formados a partir de qualquer classe de lipídios pode reter uma carga dissolvida e podem ser reduzidos e purificados por diferentes técnicas. Várias diferenças importantes resultam as características químicas únicas de lipídios de cadeia única. Vesículas, formadas por fosfolipídios são estáveis sobre uma escala larga de pH, enquanto vesículas de ácidos graxos só são estáveis em pH neutro a ligeiramente básico (ca. 7-9), que requer certas tampão de pH para preparação de vesículas. Na maioria das vezes, esse buffer também pode conter moléculas solúveis específicas para encapsulamento de vesícula, que pode ser de qualquer materiais funcionais (por exemplo, RNA) para reações bioquímicas compartimentadas ou corantes fluorescentes simples (por exemplo, calceína ) para a caracterização de vesículas.

A presença de apenas uma cadeia de hidrocarboneto simples produz uma membrana que é tanto mais permeáveis a solutos, bem como mais dinâmica. Além disso, o grupo ácido carboxílico cabeça presente em resultados de ácidos graxos em vesículas que são mais sensíveis à presença de cátions divalentes e sal (por exemplo, Mg2 +). O magnésio é um dos mais importantes cátions divalentes para catalisar reações bioquímicas em protocélulas para estudos da origem da vida. No início da vida, antes a evolução de enzimas de proteína sofisticado, o RNA pode ter sido o polímero dominante, devido à sua capacidade dual auto replicar e realizar a catálise. Um exemplo representativo de um RNA de magnésio-requerendo relacionados a reação é não enzimáticos RNA cópia, primeiramente demonstrado na década de 1960. 5 quando nucleotídeos de RNA quimicamente ativados (ou seja, 2-methylimidazolide nucleotídeos) vincula-se a um complexo de primeira demão-modelo preexistente, grupo 3'-hidroxila do primer ataca o 5'-fosfato de um monómero registrado adjacente para deslocar o grupo (ou seja, 2-methylimidazole) deixando e formulários um fosfodiéster novo bond. Esta química cópia de RNA requer uma alta concentração de Mg2 +, que precisa ser quelado para serem compatíveis com ácido graxo protocélulas. 6 outro Mg2 +-dependente reação é catalisada pela ribozima, que é talvez o mais bem caracterizado RNA catalítico. Este ribozima, que pode ser reconstituída a partir de dois oligonucleotides curtos, realiza uma reação de autoclivagem que é conveniente para monitorar por uma mudança de gel. Como tal, é frequentemente empregado como uma ribozima modelo nos estudos da origem da vida. 7 devido a uma exigência por este ribozima para magnésio unliganded, lipossomas são normalmente construídos por uma mistura de ácidos gordos e ésteres de glicerol de ácidos graxos, que são mais estáveis de magnésio. 8 , 9 neste protocolo, apresentamos técnicas temos desenvolvido para a preparação, manipulação, caracterização dessas vesículas e demonstrar a aplicação dessas vesículas como protocélulas ao anfitrião não enzimáticos RNA copiando e martelo ribozima catálise.

Protocolo

1. preparação de vesículas

  1. Preparação de filmes finos
    1. Use seringas apertado de gás para transferir certa quantidade de lipídios, conforme descrito na tabela 1.1 de clorofórmio em um frasco de vidro.
    2. Evapore a solução resultante sob um fluxo de nitrogênio ou argônio na coifa.
    3. Submeta a película fina resultante a vácuo de casa pelo menos 2 h remover qualquer resíduo de clorofórmio. Os lipídios podem ser deixados sob vácuo durante a noite neste ponto.
  2. Reidratação das vesículas
    1. Prepare-se 10 mL de 5mm calceína 250 mM tris-HCl pH 8.0 hidratação buffer dissolvendo 31 mg de pó de calceína em 2,5 mL de tampão de pH 8.0 de tris-HCl 1m e adicionando outra 7,5 mL de água desionizada (DI).
    2. Pipetar 250 µ l de buffer de hidratação acima de um tubo vazio e adicionar 1.875 µ l de 10 M NaOH para um final base de 75 mM (equivalente a ½ do total de ácidos graxos). Transferi a solução para a película fina de lipídio seco para vesículas de formulário com uma concentração de lipídios totais de 0,15 M.
    3. Uso de alta velocidade (> 3000 rpm) reaccional de vórtice a mistura resultante para 4-5 s.
    4. Deixe a mistura lipídica-tampão num agitador rotativo de baixa velocidade (ca. 30 rpm) para Re-hidratar, pelo menos durante a noite.
  3. Dimensionamento das vesículas (opcionais)
    1. Usando uma pinça, aplica um filtro de suporte para cada superfície interna das portas seringa da extrusora.
    2. Molhe cada suporte de filtro com 250 mM tris-HCl, pH 8.
    3. Usando uma pinça, aplicar uma faixa gravada 100 nm policarbonato membrana a um da extrusora anéis e suportes de filtro. Tendo o cuidado de não rasgar ou furar a membrana, empurre suavemente a membrana para o-Ring, a fim de fazer bom contato entre duas superfícies.
    4. Montar a extrusora, tomando cuidado para não deslocar a membrana e o filtro suporta.
    5. Encher uma seringa de extrusora com ca. 0,5 mL de 250 mM tris-HCl, pH 8. Inserir esta seringa em um lado da extrusora.
    6. Introduza uma seringa vazia do outro lado da extrusora.
    7. Pela mão, empurrar o êmbolo da seringa contendo tampão lentamente (≤ 50 µ l/s) e verificar que a resistência é sentida, indicando a membrana faixa-gravadas no lugar e intacto. É útil praticar esta etapa sem uma membrana no local a fim de avaliar o nível esperado de resistência.
    8. Retire e esvazie as duas seringas. Não é necessário limpar as duas seringas nesta fase, pois eles contêm reserva de composição idêntica à preparação de lipossomas.
    9. Carrega a preparação de lipossomas em dentre as duas seringas.
    10. Remonte a extrusora com seringa contendo a amostra de vesículas na seringa vazia no lado direito e lado esquerdo.
    11. Pela mão, empurre o êmbolo da seringa que contém a amostra de vesículas muito lentamente (10-25 µ l/s).
    12. Observar cuidadosamente a seringa no lado direito da extrusora; clara reserva inicialmente entrará no lado direito da extrusora (ca. 50 µ l, isto é devido ao volume morto interno da extrusora), seguida de uma pequena nuvem de lipossomas extrudados. Imediatamente parar de empurrar neste ponto, retire a seringa do lado direito da extrusora e descartar esta solução.
    13. Substituir a seringa no lado direito da extrusora e extrusão até a seringa esquerda está vazia.
    14. Inverter a orientação da extrusora e repita a etapa 13. Continuar para o número desejado de ciclos (tipicamente 7, 9 ou 11); um número ímpar é sempre usado para garantir un-extrudados lipossomas não são coletados da seringa contendo inicialmente a preparação de lipossomas pre-redução de pessoal.
    15. Delicadamente, dispense o conteúdo da seringa certo em um tubo de Eppendorf e coloque o tubo num agitador rotativo de baixa velocidade (ca. 30 rpm) para cerca de 0,5 h.
    16. Prosseguir com a purificação de vesículas, conforme descrito na secção 2. Extrusão de vesículas devem ser usadas dentro de 24h ou re-extrudadas antes da próxima utilização.

2. purificação de vesículas

  1. Preparação de fase móvel de purificação de vesículas
    1. Prepare-se 5 mL de tampão de 8 hidratação 250 mM tris-HCl pH pela adição de 1,25 mL de tampão de pH 8 de tris-HCl 1 M, 3,75 mL de água Desionizada para um tubo Falcon de 15ml. Em seguida, adicione 37,5 µ l de 10 M de NaOH (equivalente a ½ da base em relação unesterified de ácidos gordos) para o buffer de hidratação. Pipete 235 µ l de ácido oleico puro diretamente para o tubo Falcon, resultando uma solução de vesículas com lipídios totais de 0,15 M.
    2. Uso de alta velocidade (> 3000 rpm) reaccional de vórtice a mistura para 4-5 s, depois da queda em baixa velocidade girando o agitador pelo menos 2 h. A preparação de lipídios pode ser deixada durante a noite no agitador rotativo neste ponto. Filtre a fase móvel através de 0,22 μm unidade de filtro de seringa antes do uso para remover qualquer potenciais agregados.
  2. Purificação de vesículas em Sepharose
    1. Remova ca. 5 mL de etanol Sepharose 4B chorume da garrafa usando uma pipeta. Aplica isso a uma coluna de cromatografia de 10ml descartável.
    2. Permitir que o chorume para resolver e etanol de passagem até o topo da cama resina se aproxima de etanol.
    3. Aplicar 5 mL de água desionizada ao topo da resina e deixe de passagem para lavar o resíduo de etanol.
    4. Aplicar 250 mM tris-HCl, pH 8 em porções de 1-2 mL para o topo da resina, aplicando uma nova parte de cada vez que o nível do líquido se aproxima do topo da cama da resina. Repita para 3 - 5 vezes.
    5. Fixe a coluna no stand da retorta e, em seguida, conecte a ponta de coluna com conector de torneira e tubulação para o coletor de fração. Adicione a outra porção de buffer para liberar o tubo, fechar a torneira quando o nível do líquido na coluna se aproxima do topo da resina.
    6. Aplicam-se as vesículas extrudadas da secção 1 para o topo da resina usando uma pipeta de 200 µ l, tendo o cuidado de aplicar a preparação de vesículas mais uniformemente possível à resina sem tocar a parede de cama ou coluna de resina.
    7. Abra a torneira para começar o fluxo e iniciar a coleta de frações em uma placa de 96 poços. Aplicar a fase móvel de purificação de vesículas para o topo da cama da resina em 0,5-1 mL porções como o buffer esgota, tomando cuidado para não permitir que a cama de resina secar. Colete em soltar cinco fracções, recolha de pelo menos 36 poços (três linhas de uma placa de 96 poços).
  3. Caracterização de fluorescência de frações de purificação
    1. Pegue a placa de 96 poços da seção anterior e lê-lo em um leitor de placas (λex= 485 nm, λem= 515 nm).
    2. Plotar os dados resultantes de fluorescência como fluorescência vs. número de fração. Vesículas eluir primeiro, seguido pela fração desencapsulada (Figura 1).
  4. Repurification de vesículas para monitorar o vazamento de vesículas
    1. Repita as etapas de purificação e caracterização em seções 2.2 e 2.3. Vesículas que retiveram seu conteúdo não irão expor nenhum pico de soluto desencapsulado (ou muito pequeno de ca. 5-10% da intensidade do pico do vesicle).

3. utilização das vesículas na presença de magnésio

  1. Uso do magnésio unliganded
    1. Preparar e purificar vesículas conforme descrito nas seções 1, 2.1 e 2.2.
    2. Prepare-se 1 mL de 50 mM MgCl2 solução tampão de pH 8.0 250 mM tris-HCl adicionando 250 µ l de tampão de pH 8.0 de tris-HCl 1 M e 50 µ l de 1m MgCl2 a 700 µ l de DI água. Vórtice para misturar bem.
    3. Para dar a concentração desejada de magnésio de 5mm, misture 0,9 mL de vesículas purificadas e 100 µ l de solução de magnésio e mexa rapidamente para minimizar a interrupção de vesículas pela exposição transitória das vesículas de alta concentração local de magnésio.
      Nota: Mistura rápida de solução de magnésio é essencial para a estabilidade de vesículas. Se o magnésio e vesículas não estão misturadas rapidamente pela utilização imediata do vortex, algumas vesículas serão expostas a altas concentrações de magnésio, resultando em resultados inconsistentes de amostra para amostra.
    4. Embora a amostra de vesículas sobre um tumbler pelo menos 30 min antes de repurification conforme descrito em 2.4 para verificar se há vazamento de conteúdo. Adicione a mesma concentração de magnésio, como no exemplo de vesículas para a fase móvel repurification.
  2. Uso do magnésio liganded
    1. Preparar e purificar vesículas conforme descrito nas seções 1, 2.1 e 2.2.
      Nota: Use ½ equivalentes KOH em vez de NaOH para deprotonar os ácidos graxos; Verificou-se que isso produz mais estáveis lipossomas em quelatos MgCl2 sistemas.
    2. Preparar a solução de citrato de potássio 2M e ajustar o pH para 8,0 com KOH.
    3. Premix MgCl2 e potássio Citrato na proporção especificada (ca. 1:4 para vesículas estáveis de ácido oleico) em tampão de pH 8.0 250 mM tris-HCl.
    4. Adicione solução de citrato de magnésio pré-misturados à amostra de vesículas, brevemente o vórtice.
      Nota: Sempre premix solução magnésio e ligante. Nunca exponha as vesículas para solução de magnésio unchelated sozinha.
    5. Deixe a amostra de vesículas em um tumbler pelo menos 30 min antes de repurification conforme descrito no ponto 2.4. Adicione a mesma concentração de magnésio e citrato, como no exemplo a vesícula para a fase móvel repurification.

4. não enzimáticos RNA cópia em vesículas

  1. Preparação de monodisperso RNA encapsulado vesículas
    1. Prepare um filme ácido oleico seco conforme descrito na seção 1.1.
    2. Prepare o tampão de reidratação vesículas com 50 µM fluorescente etiquetados RNA primer, modelo de RNA 150 µM e pH de 250 mM tris-HCl 8.0 contendo ½ KOH equivalente em relação ao ácido oleico.
    3. Adicionar 250 µ l de tampão de hidratação do filme lipídico e siga o passo 1.2.2 e 1.2.3 tornar vesículas com concentração total de lipídios de 0,15 M.
    4. A fim de fazer unilamellar pequena vesículas monodisperso, siga seção 1.3 para extrusão de vesículas.
  2. Purificação de adição e vesículas de citrato de magnésio
    1. Premix estoques de magnésio e citrato e misture isto com a amostra de vesículas com uma concentração final de lipídios de 0,1 M.
    2. Purifica a vesículas na coluna do Sepharose 4B tamanho exclusão, com pH de 250 mM tris-HCl 8.0, lipídios 0,1 M e dada magnésio e citrato como fase móvel.
    3. Colete frações de vesículas pela seguinte secção 2.3.
  3. Reação de extensão do primer
    1. Prepare solução estoque de 200 mM 2-MeImpG (5'-monofosfato de guanosina 2-methylimidazolide) com pH de 250 mM tris-HCl 8.0. (Nota: Siga anterior publicado protocolo10 para a síntese de 2-MeImpG.)
    2. Para iniciar a reação de extensão da primeira demão, a transferência de 150 µ l de solução-mãe de 2-MeImpG para 450 µ l da amostra vesículas para atingir uma concentração final de lipídios de 75 mM e 50 mM ativado monômero. Iniciar o cronômetro e manter a reação da amostra caindo o tempo todo.
    3. (Opcional) Para a alimentação de monômero fresco contínuo, transferência 300 µ l da solução de reação de uma câmara de um laboratório construído em lipossomas de pequeno volume dialyzer11 e colocar 300 µ l solução na outra câmara de alimentação. A solução de alimentação deve conter todos os ingredientes na mesma concentração como a solução de reação, excepto para substituir o RNA que contém vesículas com vesículas vazias. Cada rodada de diálise leva 1-24 h, dependendo do analito e membrana usado.
    4. Para estudos cinéticos, levar um 100 µ l alíquota em cada ponto de tempo e repurify a alíquota através de uma coluna de exclusão Sepharose 4B tamanho com pH de 250 mM tris-HCl 8.0 como fase móvel.
    5. Recolha as frações de vesículas em um tubo de eppendorf 1,5 mL.
    6. Pipetar Triton para as frações de vesículas para um final de cerca de 0,1% v/v.
    7. Adicionar 0,5 mL de álcool etílico frio ao tubo e incubar a-20 ° C durante pelo menos 2 h.
    8. Centrifugue todos as amostras em 16,1 × 1000 rcf (16,1 × g) por 10 min e, gentilmente, pipeta para fora dos líquidos. Lavar o RNA pelotas com 70% de etanol frio e centrifugar novamente por 5 min. descarte o líquido e coloque o tubo com pelotas de RNA em um bloco de calor de 80 ° C por 2 min evaporar o etanol residual. Dissolva as bolinhas em 50 µ l de 8 M ureia com amortecedor do carregamento do 1xTBE.
  4. Análise de página
    1. Prepare-se 20% gel PAGE pela mistura de 200 mL de UreaGel sistema concentrado, 25 mL de diluente, sistema de UreaGel 25 mL de tampão de 10xTBE, 80 µ l de TEMED e 250 mg de persulfato de amónio. Rapidamente, despeje a mistura de gel entre placas de gel preso (35 cm x 45 cm) e inserir o pente. Aguarde pelo menos 30 min até a completa polimerização.
    2. Montar a placa de gel sobre o carrinho de gel e preencher as caixas de gel com gel 1xTBE executando o tampão. Tire o pente e lavar os poços com seringa. Pre-funcione o gel com 60 W por 30 min.
    3. Aqueça as amostras no bloco de calor de 80 ° C por 2 min e carregar 5 µ l de cada amostra por bem.
    4. Ative a caixa de força de gel e defina gel executando com constantes watts a 60 W para 2,5 h.
    5. Desmontar a placa de gel do gel de carrinho, limpe o vidro e coloque a placa inteira em gel de scanner para iniciar a varredura de gel.
    6. Quantificar o gel com análise de 1D ImageQuant TL. Plotar o logaritmo natural da proporção da quantidade de primer, permanecendo em um ponto determinado momento ao montante inicial de primer vs tempo, apto para uma linha e calcular a taxa de reação pseudo-primeira ordem (Figura 2).

5. hammerhead RNA auto decote em vesículas

  1. Preparação e purificação de ribozima encapsulada em vesículas
    1. Preparar uma película fina de lipídios (OA: OGM = 9:1) como na secção 1.1 com componentes como no tabela 1.2. Nota: quente OGM pelo menos 60 ° C para derreter completo antes de usar.
    2. Prepare o buffer de reidratação vesículas com 5 µM de cada vertente de ribozima martelo e a 250 mM tris-HCl pH 8.0.
    3. Adicionar 250 µ l de tampão de hidratação do filme lipídico e siga a concentração de lipídios passos 1.2.2 e 1.2.3 tornar vesículas com 0,15 M total.
    4. A fim de fazer unilamellar pequena vesículas monodisperso, siga seção 1.3 para extrusão de vesículas.
    5. Purifica a vesículas em uma coluna de exclusão Sepharose 4B tamanho, com pH de 250 mM tris-HCl 8.0, 0,15 M misturado lipídios como fase móvel.
  2. Reação de autoclivagem do martelo ribozima
    1. Preparar a solução de magnésio e misturar com vesículas purificadas, conforme descrito na seção 3.1 para iniciar a reação autoclivagem.
    2. Para estudos cinéticos, levar 100 µ l da mistura em cada ponto de tempo e repurify diretamente essa alíquota através de uma coluna de exclusão Sepharose 4B tamanho com pH de 250 mM tris-HCl 8.0 como fase móvel. Colete a fração de vesículas.
  3. Análise de página
    1. Siga os passos 4.3.6 para 4.3.8 para preparar RNA carregando amostra.
    2. Coloque o gel de TBE-ureia comercialmente fundido 15% em gel de caixa e preencher a caixa de gel com gel 1xTBE executando o tampão.
    3. Aqueça as amostras no bloco de calor de 80 ° C por 1 min e carregar 5 µ l de cada amostra por bem.
    4. Funcione o gel com constante 200 V para cerca de 1 h.
    5. Digitalize o gel.
    6. Quantificar o gel com um software de análise, como TL ImageQuant 1D, para medir a extensão do decote, comparando a intensidade da restante banda de substrato RNA e RNA clivada fragmentam banda (Figura 3).

6. gigante ácido graxo vesículas para microscopia

  1. Preparação das vesículas gigante de ácido graxo
    1. Siga seção 1.1 e 1.3 tabela para preparar uma película fina de ácido oleico com 0,2 mol % de lipídio fluorescente etiquetado para melhor observação de membrana.
    2. Re-hidratar o filme lipídico com pH de tris-HCl de 250 mM de µ l 500 8.0 tornar os lipídios de 10 mM de amostra de vesículas no total. O buffer pode conter corantes fluorescentes ou moléculas de RNA se desejado. Deixe-se de vesículas amostra caindo durante a noite.
    3. Prepare 150 mL de tampão de diálise puro ácido graxo com 10mm lipídios totais misturando 470 µ l de ácido oleico e 150 mL de pH de 250 mM tris-HCl 8.0 contendo NaOH equivalente ½.
    4. EXTRUDE a amostra de vesículas através de uma membrana de policarbonato 10 µm para remover grandes agregados.
    5. Transferi a amostra de vesículas dentro de grandes poros diálise 1 µm, conforme descrito anteriormente. 12
    6. Coloque a fita de diálise em um copo de 100 mL contendo 30 mL de tampão de diálise. Agite o copo suavemente em um agitador de mesa 80-100 RPM.
    7. Altere o buffer de diálise cada 30 min por 5 vezes remover corantes livre ou RNA e pequenas vesículas.
    8. Retire cuidadosamente a vesícula amostra o cassete de diálise com uma seringa e transfira para um tubo Eppendorf.
  2. Observação de microscopia
    1. Pipete 10 µ l de vesículas numa lâmina de microscópio limpa padrão e coloque uma lamela de vidro sobre a amostra. Sele a tampa de vidro com verniz transparente.
    2. Observe as vesículas com um 60 X dispersão de óleo ou objectivo semelhante pela microscopia confocal, usando a fonte de laser apropriado para a membrana fluorescente-etiquetadas, RNA ou corante encapsulado (Figura 4).

Resultados

Normalmente realizamos purificações lipossoma em colunas de tamanho-exclusão. Típico em lipossomas preparações contêm um fluoróforo de algum tipo. Quando os lipossomas são gerados e extrudados, a espécie a ser encapsulado está presente dentro e fora os lipossomas. Purificando os lipossomas em uma resina de tamanho-exclusão (Sepharose 4B), desencapsulados solutos são mantidos dentro dos poros da resina, enquanto os lipossomas maiores não são e eluir primeiro (figura 1A). Coletando frações e plotagem fluorescência vs. número de fração (figura 1B) normalmente produz um traço de dois-pico, com as frações eluidor de início correspondente para os lipossomas, que em seguida são coletados e usados em aplicações subsequentes.

Nós frequentemente examinar reações de extensão nonenzymatic da primeira demão, que eram um meio provável de replicação do RNA antes da emergência da ribozima e ARN-polimerase à base de proteínas. Estas reações geralmente empregam um primer fluorescente etiquetado (Figura 2A), que é estendido por monômeros ativados. Estas reacções podem ser monitoradas por eletroforese em gel (Figura 2B) e o resultante electropherograms integrado para obter as constantes de velocidade para uma condição determinada reação (Figura 2).

Para demonstrar que o RNA poderia funcionar dentro protocélulas, empregamos martelo ribozima autoclivagem (Figura 3A) como uma reação catalítica do RNA modelo. Esta reação requer livre Mg2 + para facilitar a catálise, e portanto nós usado vesículas OA/OGM, pois eles são estáveis na presença de 5 mM Mg2 +. Semelhantes às reações de extensão da primeira demão, a reação de autoclivagem de ribozima martelo também pode ser monitorado por eletroforese em gel (Figura 3B) e posteriormente analisados para adquirir a constante de velocidade sob condições específicas (Figura 3).

Nós da imagem lipossomas empregando ambos fluorescência e transmissão de luz. Os lipossomas podem ser rotulados usando lipídios fluorescentes, que dão um rótulo de membrana (Figura 4A), ou usando um soluto fluorescente dentro seu lúmen (Figura 4B). Transmissão da luz também pode ser usado para observar vesículas (também mostradas na Figura 4B).

Ácido oleico puro de tabela 1.1 em clorofórmio
Componente deEstoqueQuantidade
Ácido oleico> 99%11,7 Μ l
Clorofórmio1 mL
Tabela 1.2 ácido oleico e monooleato de glicerol (9:1) em clorofórmio
Componente deEstoqueQuantidade
Ácido oleico> 99%10.5 Μ l
Monooleato de glicerol> 99%1.4 Μ l
Clorofórmio1 mL
Tabela 1.3 ácido oleico com 0.2mol% rodamina-PE em clorofórmio
Componente deEstoqueQuantidade
Ácido oleico> 99%Μ l 1.6
Rodamina-PE em clorofórmio10 mM20 Μ l
Clorofórmio1 mL

Tabela 1. Soluções de clorofórmio do ácido graxo.

Processo de cromatografia de vesícula de calceína; diagrama e gráfico de fluorescência mostrando os resultados da separação.
Figura 1. Caracterização de purificação e fluorescência vesículas de fração de purificação. R. separação de vesículas contendo calceína de calceína livre em uma Sepharose 4B coluna. B. vesículas e deteção de pico calceína livre plotando a fluorescência em cada poço vs número bem após a coleta da fração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama do processo de extensão do DNA, resultados da eletroforese em gel e gráfico de análise cinética.
Figura 2. Replicação de RNA não-enzimática dentro de vesículas OA. R. regime de extensão de primer de RNA não enzimáticos. B. imagem da página de uma reação de extensão da primeira demão dentro de vesículas de ácido oleico puro, com condições como na seção 4. C. Linear fit do logaritmo natural do rácio da quantidade de primer remanescente no dado ponto do tempo para a quantidade inicial de primer vs tempo mais 30 h. taxa de reação, calculado a partir da encosta do tempo (P/P0) vs, é 0,058 h-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

diagrama de clivagem de RNA, eletroforese em gel, gráfico de análise cinética; Processo de substrato marcado com Cy3.
Figura 3. Clivagem de ribozima martelo em vesículas OA/OGM. R. regime de clivagem de ribozima martelo de strand substrato fluorescente etiquetadas (topo). B. imagem da página de clivagem de ribozima martelo dentro de vesículas OA/OGM com 5mm Mg2 +. C. ribozima atividade dentro de vesículas. Ajuste linear de logaritmo natural do coeficiente da quantidade de substrato remanescente no dado ponto do tempo para a quantidade inicial de substrato versus tempo em h. 4 primeira reação taxa, calculada a partir da encosta do (s/s0) contra o tempo, é de 0,36 h-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imagens de microscopia dupla de vesículas lipídicas, imagens de fluorescência e contraste de fase.
Figura 4. Gigante de ácido graxo vesículas para microscopia. R. imagem de microscopia Confocal de um PE de rodamina rotulados ácido oleico vesículas, escala bar 10 μm. B. imagem de microscopia Confocal de ácido oleico vesículas contendo Alexa488 rotulado RNA com membrana mostrada no canal transmitido detector (TD), escala bar 5 μm.

Discussão

Lipossomas, formados a partir de ácidos graxos têm sido sugeridos por muitos como potenciais modelos para células primitivas, devido à sua alta permeabilidade e propriedades dinâmicas. O grupo carboxílico cabeça de ácidos graxos de cadeia única só permite auto-montagem em membranas na faixa de pH restrito, e as membranas resultantes são bastante sensíveis à presença de sais. Como resultado, ácido graxo vesículas exigem preparação diferente e métodos em comparação com vesículas fosfolipídicas de manipulação.

Neste protocolo, embora usamos ácido oleico como exemplo para a formação de lipossomas, outra longa cadeia de ácidos graxos insaturados (C14) e seus derivados (ca. ácido miristoleico, ácido palmitoleico e os correspondentes álcoois e ésteres de glicerol) também formam vesículas seguir o método de reidratação de película fina, enquanto a concentração de lipídios total está acima o cmc e o pH do tampão de hidratação está perto o pKa do ácido graxo dentro da membrana. Além de tampão tris-HCl usado neste protocolo, outros sistemas de reserva (ca. bicine, fosfato, borato) foram relatados para apoiar a formação de vesículas de ácido graxo, embora vesículas formadas em tampão fosfato ou borato são geralmente bastante gotejante13. As vesículas de ácido graxo resultante após reidratação são polydisperse e multilamellar, mas são facilmente convertidos em monodisperso pequenas vesículas de unilamellar por extrusão conforme descrito. Comparado com sonication como um método alternativo para a geração de pequenas vesículas, extrusão fornece mais opções para o controle do tamanho da vesícula através da aplicação de membranas de tamanho de poro diferente. Vesículas, após a extrusão são geralmente ligeiramente maiores que o tamanho dos poros da membrana, mas aumentando o número de ciclos de extrusão, vesículas com uma distribuição de tamanho mais estreita e um tamanho médio próximo do tamanho de poros de membrana podem ser obtidas.

Para sintetizar protocélulas funcionais, vesículas de ácido graxo necessário acolhimento específico as reações bioquímicas resultantes do encapsulamento do RNA ou outros blocos de construção. O método de reidratação de película fina fornece uma maneira fácil de vesículas de formulário contendo materiais encapsulados desejados. No entanto, a eficiência de encapsulação é relativamente baixa e uma grande fração de materiais preciosos como o RNA são normalmente perdidas durante o processo de purificação. Em alguns casos a eficiência de encapsulação pode ser melhorada por ciclos repetidos de congelamento-descongelamento antes da extrusão modestamente. Microfluidic métodos para a preparação de alto rendimento de lipossomas de fosfolípidos permitem quase eficiência de encapsulação de 100%, porém análogos métodos ainda não foram desenvolvidos para vesículas de ácido graxo.

Quando manipulação protocélulas com quelatos ou livre Mg2 +, purificação após adição de solução de magnésio e repurification antes de cada ponto de tempo garante a remoção de vazou encapsulado material que pode afetar a precisão da taxa de reação medições dentro de vesículas. Uma vez cada purificação leva pelo menos 10 min para alcançar a boa separação e coleta frações de vesículas, a análise de reações rápidas é difícil, e a reação deve ser interrompida antes da repurification de coluna.

O protocolo que apresentamos aqui é bem adequado para a construção de ácidos graxos lipossomas que hospedam reações imitando aqueles que podem ocorrer nas células primitivas. Nossos protocolos também permitem aplicações potenciais no desenvolvimento de sistemas de entrega biomédicos e biorreatores para outras reações bioquímicas.

Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

J.W.S. é um investigador do Howard Hughes Medical Institute. Este trabalho foi financiado em parte por uma concessão (290363) da Fundação Simons para J.W.S. Tanto A.E.E. como K.P.A. reconheceram o apoio dos fundos de inicialização de Universidade de Minnesota.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
seforose 4BSIGMA-ALDRICH INC4B200
calceínaSIGMA-ALDRICH INCC0875-10G
tris-HCl pH8.0 1MLIFE TECHNOLOGIES CORPAM9851
ácido cítricoSIGMA-ALDRICH INC251275-500G
hidróxido de sódioSIGMA-ALDRICH INC71690-250G
hidróxido de potássioSigma30614
ácido oleicoNu-ChekU-46-A
monooleato de glicerolNu-ChekM-239
Liss Rodamina-PELIFE TECHNOLOGIES CORPL1392
cloreto de magnésioFisher/Thermo Fisher ScientificAM9530G
concentrado de sequagelNational DiagnosticsEC-830
sequagel DILUENTENational DiagnosticsEC-840
15% TBE-UREIAGEL Thermo Fisher ScientificEC68852BOX
ureiaSigma AldrichU6504-500G
titon-100xSIGMA-ALDRICH INCT9284-100ML
RNA primerIDT5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG RNA
MODELOIDT5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC
fio de substrato de cabeça de marteloIDT5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC
fio de ribozima de marteloIDT5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG
conjunto de extrusora de vesículasAVANTI POLAR LIPIDS610000
coletor de fraçõesGilson, Inc.
placas de 96 poços Leitor deFisherNC9995941/675
Molecular DevicesSpectraMax i3
NikonNikon A1R MP Scanner de gel confocal
GE Healthcare Life SciencesTyphoon
171041 placas Microscópio confocal 9410 scanner

Referências

  1. Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division. Science. 302, 618-622 (2003).
  2. Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco,, Szostak, J. W. Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell. Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).
  3. Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers. Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).
  4. Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).
  5. Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).
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  7. Uhlenbeck, O. C. A small catalytic oligoribonucleotide. Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).
  8. Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. RNA catalysis in model protocell vesicles. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).
  9. Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts. Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).
  10. Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers. J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).
  11. Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations. Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).
  12. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of large monodisperse vesicles. PloS one. 4 (4), e5009(2009).
  13. Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder. Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).

Reimpressões e permissões

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