Um rastreio de baseada em célula de murino ilhotas pancreáticas para produtos químicos ambientais Diabetogenic

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar células de ilhotas pancreáticas do mouse para as induções ROS de triagem pelos xenobióticos para identificar os potenciais químicos xenobióticos de diabetogenic.

Resumo

Exposição a certas substâncias químicas ambientais em humanos e animais foi encontrada para causar dano celular das células β do pâncreas que conduzirá ao desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Embora os mecanismos para o danos nas células β induzida em química foram clara e susceptível de ser complexo, uma constatação recorrente é que estes produtos químicos induzem o estresse oxidativo levando a geração de espécies de excessiva reativas de oxigênio (ROS) que induzem danos a célula β. Para identificar potenciais produtos químicos ambientais diabetogenic, isolamos as células de ilhotas pancreáticas de camundongos C57BL/6 e de células da ilhota cultivadas em placas de cultura de células 96 poços; em seguida, as células das ilhotas foram tratadas com produtos químicos e a geração de ROS foi detectada por 2', tintura fluorescente 7'-diclorofluoresceína (Diniz Melo-DA). Usando esse método, nós encontrou que o bisfenol A (BPA), Benzo [a] pireno (BaP) e os bifenilos policlorados (PCBs), poderia induzir altos níveis de ROS, sugerindo que eles podem potencialmente induzir danos nas células das ilhotas. Este método deve ser útil para a seleção diabetogenic xenobióticos. Além disso, as células das ilhotas culta também podem ser adaptadas para análise em vitro de toxicidade induzida por substância química nas células do pâncreas.

Introdução

Aumento na prevalência de T2DM tornaram-se uma crise de saúde global nos últimos anos posando uma séria ameaça à saúde pública¹. Muitos fatores foram encontrados para ser causalmente ligada ao desenvolvimento do T2DM, entre os quais, recorrentes achados sugerem que um ponto convergente comuns a esses fatores é a indução de estresse oxidativo, que leva à geração de excessiva ROS^{2 , 3}.

Um amplo espectro de produtos químicos ambientais incluindo PCBs, dioxinas e BaP foi encontrado para induzir o estresse oxidativo, que pode prejudicar a função das células β do pâncreas e levar à resistência à insulina e T2DM⁴. Embora o nível fisiológico de ROS desempenha um papel importante nas funções celulares, exposição a ROS que excede a capacidade do sistema antioxidante resulta em danos de tecidos/células e leva a doenças⁵. Células β do pâncreas expressam um baixo nível de enzima antioxidante e assim são um alvo sensível para o dano mediada por estresse oxidativo^6,7. A exposição crônica a níveis elevados de ROS foi mostrada para causar disfunção de células pancreáticas induzida por estresse⁵ bem como resistência à insulina no fígado e tecido adiposo⁸.

O objetivo geral deste projeto é desenvolver um ensaio baseada em célula de substâncias químicas de tela para seus potenciais de diabetogenic com base na sua indução de ROS em células pancreáticas. O pâncreas carece de desintoxicação metabólica e é um alvo sensível para dano induzido por xenobiótico^6,7. Portanto, medindo diretamente o ROS gerado nas células do pâncreas, este ensaio deve fornecer uma aproximação direta da lesão induzida por produto químico no pâncreas. Para desenvolver este método, nós isolado de ilhotas pancreáticas do mouse, culta o ilhéu isolado sob condição de cultura celular com produtos químicos e utilizou a geração de ROS induzida por substância química como a leitura. Este procedimento é simples e eficaz na identificação de produtos químicos ROS-induzindo o ilhéu isolado; Isso pode ser desenvolvido para a investigação dos mecanismos de toxicidade que são específicos para o pâncreas em vitro.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as orientações pertinentes, regulamentos e agências reguladoras. O protocolo que está sendo demonstrado foi realizado sob a orientação e aprovação do cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) do Texas A & M Instituto de Medicina Genômica.

1. preparação da solução

1. Diluir a solução de sal equilibrada do Hank x 10 x 1 com água destilada dobro H₂O e armazenar a 4 ° C.
2. Prepare a solução de isolamento adicionando HEPES (10 mM), MgCl₂ (1 mM) e glicose (5 mM). Ajustar o pH para 7,4 e manter no gelo.
3. Prepare a solução de colagenase da colagenase tipo 4.
   Nota: Especificamente, colagenase tipo 4 contém 160 U por mg de peso seco. 1 g de colagenase tipo 4 é diluído em 5 mL duplo destilada H₂O com uma concentração de 200 mg/mL. 2 mL da colagenase diluído é adicionado para 30 mL de solução de isolamento frio gelo e 6 mL de solução de colagenase é transferido para um tubo de 50 mL para cada rato.
4. Prepare a solução de lavagem, adicionando 1 mM CaCl₂ para a solução de isolamento.
5. Prepare a solução de purificação com solução de diatrizoate de sódio polysucrose frio (1,1119 g/mL, 5 mL).
6. Prepare 500 mL de meio de cultura de ilhota pela adição de L-glutamina (20 mM), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e soro fetal bovino (FBS) (10%) em meio RPMI.
7. Preparar a solução Diniz Melo-DA-mãe, dissolvendo o pó em água destilada a 200 µM e loja a-20 ° C.
   Nota: O ROS coloração solução recém feito diluindo a solução para a concentração final de 5 µM em RPMI Diniz Melo-DA. Este reagente deve ser protegido da luz.

2. cirúrgica preparação

1. Intraperitonealmente injete (I.P.) um rato com avertin (2,5% avertin, 0,4 mL/20 g). Depois que o mouse é completamente anestesiado e não responde mais os pés hind pitadas, eutanásia o mouse e mover para o capô biológico.
2. Coloque o mouse euthanized com a abdominal virados para cima e pulverizar a pele com álcool 70% para a esterilização.
3. Abrir a cavidade abdominal com um U-incisão de 1 cm em cima do abdômen superior e retrair a pele no sentido rostral sobre o peito para expor na cavidade abdominal.

3. remoção e perfusão pâncreas

1. Conforme ilustrado na Figura 1, encontre a localização na ampola. Use um par de pinças curvas para fixar o duodeno perto a posição do esfíncter de Oddi. Use outro par de pinças curvas para fixar a parede do duodeno para bloquear o caminho de bile no duodeno.
   Nota: A ampola não foi inserida nesta etapa. Esta etapa destina-se a bloquear o caminho de bile no duodeno.
2. Reposicione o mouse com a cabeça proximal e distal em relação ao pesquisador os pés.
3. Encontrar o ducto biliar comum e lentamente injete 3 mL de solução de colagenase com uma seringa de 5 mL e agulha de 30g. Certifique-se que o ducto biliar e o pâncreas estão inflacionados após a injeção.
4. Remova o pâncreas distendido, usando a pinça curvada e tesouras bem para separá-lo do descendente do cólon, intestinos, estômago e baço. Coloque o pâncreas em um tubo de 50 mL contendo 3 mL de solução de colagenase e mantê-lo no gelo.

4. pâncreas digestão

1. Coloque cada tubo de 50 mL em um banho-37 ° C. Incubar durante 15-20 minutos (tempo varia com a tensão e a idade dos ratos).
2. Vibre o tubo usando um vórtice.
3. 4-5 pâncreas digerido em um coador grande coletor estéril da piscina e use uma colher para fazer com que o pâncreas desmoronar completamente. Use uma seringa de 10 mL e agulha 23G contendo solução de lavagem para pipetar com força as células digeridas fora da tela. Recolha a solução de lavagem em um tubo de 50 mL.
4. Centrifugar os tubos a 97 x g a 4 ° C por 1 min e decante o sobrenadante.
5. Adicionar 25 mL de solução de lavagem para tubos e ressuspender o tecido vortexing suave. Spin para baixo os tecidos a 97 x g a 4 ° C por 1 min e decante o sobrenadante. Repita por 3 vezes. Tenha cuidado para não deslocar o tecido granulado.

5. purificação de Ilhéus

1. Adicionar 10 mL de solução de purificação para a pelota de tecido lavado e ressuspender delicadamente o conteúdo.
2. Delicadamente sobreposição de 5 mL de solução de isolamento sobre a solução de purificação. Tenha cuidado para manter uma interface líquida acentuada entre as duas soluções.
3. Centrifugar o tubo a 560 x g a 4 ° C por 15 min com aceleração lenta e sem freio. Introduza a pipeta a interface e recolher a camada de ilhotas para novos tubos de 50 mL.
4. Lave os ilhéus, conforme descrito na etapa 3.5.

6. chapeamento e tratamento de células das ilhotas

1. Resuspenda as ilhotas em 10 mL de solução de cultura de Ilhéus, delicadamente misture bem e coloque 100 µ l/poço com uma pipeta multicanal para uma placa de 96 poços. Coloque aproximadamente 5 ilhotas por 96 bem.
2. Coloque a placa na incubadora de cultura de tecido para 12h.
3. Centrifugar (112 x g) a placa de 96 poços e remover o meio de cultura.
4. Dilua os químicos ambientais em meio de cultura de Ilhéus. Adicione 100 µ l de cada um dos diluentes a química em cavidades separadas da placa. Resuspenda as ilhotas em cada poço e incubar durante 12 horas a 37 ° C (a concentração varia para os diferentes produtos químicos ambientais).

7. ROS manchando e medição

1. Após o tratamento de Ilhéus, lave com 1X PBS (200 µ l de cada poço-96).
   Nota: A concentração das substâncias químicas é como segue: AFB1: 3 µM, atrazina: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-estrogênio, PCB126: 10 µM, nonilfenol e BPA: 100 µM.
2. Use o N-acetil cisteína (NAC) como um antioxidante para saciar ROS. Adicionar 5 mM do NAC para o diluente químico induzida por ROS e incubar durante 12 horas a 37 ° C.
3. Centrifugue a placa de 96 a 112 x g e com solução de 5 µM de sonda fluorescente (H2-Diniz Melo-DA dissolvido na mídia RPMI), incubar a 37 ° C por 60 min.
4. Lavar as células da ilhota tratada 3 vezes com PBS e medir a fluorescência com um leitor de microplacas em 488 nm.
   Nota: O acúmulo de DCF nas células pode ser medido por um aumento na fluorescência 530 nm quando a amostra está animada em 488 nm.
5. Executar a secreção (GSIS) de insulina glicose-estimulada ensaio⁹ na indução ROS xenobiótico tratados ilhotas e Ilhéus não tratadas para medir os efeitos de xenobióticos sobre a função fisiológica das ilhotas pancreáticas.

Resultados

Uma micrografia de ilhéu isolado do saudável é mostrada na Figura 2, em que ilhéus tem uma forma redonda ou oval com relativamente uniforme tamanho (apesar de uniformidade de tamanho pode variar de cepa para cepa). Em seguida, investigamos as funções de ilhotas pancreáticas em um ensaio em vitro isolando o ilhéu e estimulando a secreção de insulina em ilhotas a cultura. A Figura 3 mostra a nossa análise típica do ensaio ...

Discussão

Acumular evidências sugere que a exposição a substâncias químicas ambientais desempenha um papel importante no desenvolvimento do T2DM. Induzida por xenobióticos ROS tem sido reconhecida como um fator etiológico potencial, contribuindo para o desenvolvimento do T2DM. Os seres humanos são expostos a uma ampla gama de produtos químicos xenobióticos e há uma grande necessidade de técnicas de pesquisa de romance para efetivamente identificar os tóxicos do pâncreas e para investigar o mecanismo de toxicidade específico para a...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10 vezes; Hank' s solução salina balanceada	GIBCO	14185-052
Colagenase Tipo 4	Worthington Biochemical Corporation	CLS-4
solução de polissacarose/diatrizoato de sódio	Sigma	10771
2',7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA)	Sigma	D6883-50MG
	Biotek
L-glutamina	Sigma	G8540-25G
estreptomicina	GIBCO	15140148
FBS	GIBCO	26140079
RPMI 1640	GIBCO	11875-085
avertin	Sigma	T48402-25G
Kit ELISA de insulina de rato / camundongo	Millipore	EZRMI-13K
Centrífuga	Sorval	Sorval RT7	para centrífuga de placas de 96 poços
Leitor de microplacas	Biotek	Epoch 2	para leitura de fluorescência

Leitor de microplacas de fluorescência