Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Summary

Aqui, mostramos o processo de criação de uma linha de zebrafish do repórter de tensão elétrica celular para visualizar o desenvolvimento embrionário, movimento, e células de tumor de peixe em vivo.

Abstract

Bioeletricidade, sinalização eléctrica endógeno mediada por canais iônicos e bombas localizadas na membrana celular, desempenha papéis importantes na sinalização de processos das células neuronais e musculares excitáveis e muitos outros processos biológicos, tais como embrionárias padronização do desenvolvimento. No entanto, há uma necessidade na vivo monitoramento da atividade elétrica em vertebrados embriogênese. Os avanços dos indicadores de voltagem fluorescente geneticamente codificado (GEVIs) tornaram possível fornecer uma solução para este desafio. Aqui, descrevemos como criar um indicador de tensão transgénicos zebrafish usando o indicador de tensão estabelecida, ASAP1 (acelerado Sensor de potenciais de ação 1), por exemplo. O kit de Tol2 e um promotor de zebrafish onipresente, ubi, foram escolhidos neste estudo. Nós também explicar os processos de clonagem de site-specific Gateway Tol2 baseados em transposon zebrafish transgênese e o processo de imagem para tumores de embriões e peixes peixes fase inicial usando regular epifluorescente microscópios. Usando esta linha de peixe, achamos que há mudanças de tensão elétrica celular durante a embriogênese de zebrafish e movimento de larvas de peixes. Além disso, observou-se que em alguns zebrafish tumores de bainha de nervo periférico maligno, o tumor de células foram geralmente polarizadas em comparação com os tecidos normais circundantes.

Introduction

Bioeletricidade refere-se a sinalização eléctrica endógeno mediada por canais iônicos e bombas localizadas na membrana celular¹. Intercâmbio iônico através da membrana celular e as acoplado mudanças atuais e potenciais elétricas, é essencial para a sinalização de processos das células neuronais e musculares excitáveis. Além disso, bioeletricidade e gradientes de íons têm uma variedade de outras funções biológicas importantes, incluindo o armazenamento de energia, biossíntese e transporte do metabólito. Sinalização bioelétrica também foi descoberto como um regulador de formação embrionária padrão, tais como machados do corpo, o ciclo celular e de diferenciação celular¹. Assim, é fundamental para a compreensão de muitas doenças congênitas humanas que resultam do Regulamento mis deste tipo de sinalização. Embora a braçadeira do remendo tem sido amplamente utilizada para gravação de células únicas, é ainda longe do ideal para o monitoramento simultâneo de várias células durante o desenvolvimento embrionário em vivo. Além disso, pequenas moléculas sensíveis de tensão também não são ideais para aplicações em vivo devido às suas especificidades, sensibilidades e toxicidades.

A criação de uma variedade de geneticamente codificado fluorescente tensão indicadores (GEVIs) oferece um novo mecanismo para superar este problema e permite a fácil aplicação estudar o desenvolvimento embrionário, mesmo que eles foram originalmente destinados para monitoramento neural células de^2,3. Dentre os GEVIs atualmente disponíveis é o acelerado Sensor de potenciais de ação 1 (ASAP1)⁴. É composto por um loop extracelular de um domínio sensor de tensão de tensão sensível fosfatase e uma circular permutada proteína verde fluorescente. Portanto, ASAP1 permite a visualização de alterações de potenciais elétricas celulares (polarização: verde brilhante; despolarização: verde-escuro). ASAP1 tem 2 ms sobre-e-off cinética e pode seguir abaixo do limite potencial mudança⁴. Assim, esta ferramenta genética permite um novo nível de eficácia no monitoramento em tempo real bioelétrica em células vivas. Mais compreensão dos papéis de bioeletricidade no desenvolvimento embrionário e muitas doenças humanas, tais como câncer, derramará nova luz sobre os mecanismos subjacentes, que é fundamental para a prevenção e tratamento da doença.

Zebrafish provaram um poderoso modelo animal para estudar a biologia do desenvolvimento e doenças humanas, incluindo o câncer^5,6. Eles compartilham genes ortólogos de 70% com os humanos, e eles têm biologia vertebrada semelhante⁷. Zebrafish fornecer cuidados relativamente fácil, um tamanho de embreagem grande de ovos, genética tractable, transgênese fácil e desenvolvimento embrionário externo transparente, que faz com que um sistema superior na vivo de imagem^5,6. Com uma grande fonte de linhas de peixes mutantes já presentes e um genoma completamente sequenciado, zebrafish fornecerá uma variedade relativamente ilimitada de descoberta científica.

Para investigar na vivo em tempo real atividade elétrica das células, aproveitamos o sistema modelo de zebrafish e ASAP1. Neste artigo, descrevemos como incorporar o biosensor fluorescente tensão ASAP1 no genoma da zebrafish usando Tol2 transposon transgênese e visualizar a atividade elétrica celular durante o desenvolvimento embrionário, movimento larvas de peixe e no tumor ao vivo .

Protocol

O zebrafish estão alojados em instalações animais AAALAC-aprovado, e todos os experimentos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo cuidado do Animal de Purdue e Comissão de utilização (PACUC).

1. Tol2 Transposon plasmídeo construção preparação

Nota: Tol2, um transposon que foi descoberto no peixe medaka, tem sido amplamente utilizado na Comunidade de investigação o zebrafish^8,9. Foi com sucesso adoptado para o Gateway site-specific recombinação sistema baseado em clonagem e conhecido como o Tol2 do kit¹⁰. O kit Tol2 permite uma maneira mais conveniente de criar construções personalizadas de expressão, enquanto também aumenta a eficiência da transgênese. Assim, foi uma decisão fácil para tirar vantagem deste sistema e criar uma linha onipresente de zebrafish expressão ASAP1 usando um promotor validado ubiquitin para conduzir ASAP1¹¹.

1. Criando uma construção de entrada meio ASAP1: pDONR221-ASAP1
   1. Adquira a construção de sensor ASAP1 tensão geneticamente codificado, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plasmídeo #52519), de Addgene. Para amplificar a região codificante ASAP1, configure uma PCR utilizando primers personalizados (attB1-ASAP1F e attB2-ASAP1R) ladeados com sequências attB na extremidade 5' dos primers (Figura 1). Phusion DNA polimerase foi escolhido por sua alta eficiência, e condições PCR foram otimizadas com base no protocolo previamente publicado¹².
   2. Carregar os produtos PCR 50 µ l em um 1% TAE gel usando uma pipeta regular com dicas de 200 µ l e executar eletroforese em 160 V em um tanque de gel de horizontal por cerca de 30 min.
   3. Verifique o gel sob um transiluminador UV (353 nm), excisar a banda desejada usando um lâmina/bisturi sob um transiluminador UV como anteriormente publicado^13,14e coloque a amostra do DNA contendo gel em microcentrifuga limpa 1,5 mL tubo.
   4. Execute o gel de purificação para os produtos de PCR ASAP1. Recuperar o DNA no gel extirpado usando um kit comercial de purificação gel ADN seguindo as instruções do fabricante e eluir o DNA em 20 µ l de água. Tomar 1 µ l de como uma amostra e medir a concentração de DNA utilizando um espectrofotômetro. Fluxo as instruções de software utilizando a água como um controle em branco¹⁵.
   5. Pegue 100 ng de purificado o produto do PCR e misturá-lo com 150 ng do plasmídeo pDONR221 em 10 µ l de TE buffer (10 mM Tris, pH de 1 mM EDTA 8.0)¹⁶. Adicionar 2 µ l de BP Clonase II para a reação e incubar a reação à temperatura ambiente durante a noite.
   6. No segundo dia, adicionar 1 µ l de proteinase K para a reação e incubar a reação a 37 ° C por 30 min.
   7. Execute a transformação. A reação de transferência e misturá-lo com 50 µ l de Top10 competentes de Escherichia coli células e incubar as células no gelo por 30 min. Em seguida, transferência imediatamente, o tubo de reação em um banho de água de 42 ° C por 1 min. Retire o tubo e incubar no gelo por 2 min. Em seguida, colocar o tubo em um shaker de 37 ° C e incube por 1h.
   8. Retire o tubo e as células em um prato de canamicina LB da placa. Em seguida, incubar a placa durante a noite (16-18 h) a 37 ° C.
   9. Escolha única e bem separadas colônias e inoculá-los em tubos de cultura de células de 14 mL com 3 mL de meio LB. Cultura-los durante a noite a 37 ° C em uma coqueteleira com uma velocidade de rotação de 250 rpm (rotação por minuto).
   10. Execute miniprep usando um kit miniprep comercial seguindo seu manual de instrução¹⁷.
   11. Sequência 3-4 plasmídeos com Sanger sequenciamento identificar positivo pDONR221-ASAP1 clones usando M13F e M13R iniciadores de sequenciamento.
2. Criando a construção Tol2 para microinjection: pDestTol2 -ubi-ASAP1
   1. Escolha que o sequenciamento e verificados pela medida pDONR221-ASAP1 clone sua concentração de DNA usando uma sequência de espectrofotômetro a instruções de software utilizando a água como um espaço em branco controlar¹⁵.
   2. Pegue 100 µ g de pDONR221-ASAP1 e misture com 100 µ g de plasmídeo de 5-final do Tol2 kit (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µ g de p3E-polyA (kit de Tol2 #302) e 150 µ g de pDestTol2pA2 (kit de Tol2 #394). Ajustar o volume total de 8 µ l usando TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) numa microcentrifuga 1,5 mL do tubo e misture bem por um vórtice de breve s 2-5. Em seguida, adicionar 2 µ l de LR Clonase II plus e incubar a reação à temperatura ambiente durante a noite.
   3. No segundo dia, adicionar 1 µ l de proteinase K para a reação usando uma pipeta de 10 µ l e incubar a reação a 37 ° C por 30 min.
   4. Realizar a transformação e identificar clones positivos, como descrito acima (passos 1.1.7-11).
   5. Medida a concentração de DNA de sequenciamento verificado clone pDestTol2-ubi-ASAP1 (figura 1B) usando um espectrofotômetro¹⁵. Normalmente, a concentração é em torno de 200ng / µ l.

2. prepare Tol2 Transposase mRNA e injeção de solução

1. Raia Escherichia coli glicerol estoque de pCS2FA-transposase plasmídeo (kit de Tol2 #396) em uma placa LB (com 100 ampicilina µ g/mL) com uma ansa de inoculação esterilizado. Incube a placa a 37 ° C numa incubadora durante a noite. No dia seguinte, escolher uma única colônia e inoculá-lo em 3 mL de LB (Ampicilina 100 µ g/mL) com uma ponta de pipeta de 10 µ l esterilizado. Cultura-lo durante a noite a 37 ° C em uma coqueteleira com uma velocidade de rotação de 250 rpm.
2. Execute miniprep na cultura de Escherichia coli usando um kit miniprep comercial seguindo seu manual de instruções. Eluir Plasmídeo em 30-50 µ l de tampão TE por 1 minuto centrifugação a 14.000 rpm e medir sua concentração de DNA com um espectrofotômetro.
3. Linearizar 1-2 µ g do plasmídeo com eu não endonuclease e purificar o DNA com um DNA kit eu não seguindo o seu manual de instruções de limpeza digestão. Eluir o DNA em 5 µ l de água por centrifugação a 14.000 rpm por 1 minuto. A concentração esperada é de 200-300 ng / µ l.
4. Executar em vitro transcrição com não eu linearizada transposase-pCS2FA como um modelo de DNA usando um kit de transcrição comercial SP6.
5. Quando a reação estiver terminada, purifica Tol2 transposase mRNA usando um RNA de limpeza comercial kit seguindo as instruções do fabricante. Finalmente, eluir mRNA na água de RNAase livre 20 µ l e medir a concentração de RNA em um espectrofotômetro. A concentração esperada é sobre 1-3 µ g / µ l. as amostras podem ser armazenadas em um freezer-80 ° C, se necessário.
6. Preparar a solução de microinjeção misturando 20 ng / µ l pDestTol2 -ubi-ASAP1 e Tol2 transposase mRNA (100 ng / µ l) em um tubo de microcentrifugadora por pipetagem. Para prevenir a degradação do ácido nucleico causada por repetidos descongelar e recongelar, alíquota 6 µ l pelo tubo e armazená-lo em um freezer-80 ° C para uso futuro.

3. microinjection

1. Conjunto 4-6 tanques de criação pelo menos 2 machos e 2 fêmeas a tarde antes da injeção. Estes peixes não devem ser alimentados à tarde. Esta etapa irá reduzir a quantidade de resíduos de peixe e economizar tempo para limpá-los na manhã seguinte, enquanto também ajuda a induzir uma resposta de reprodução.
2. Na manhã seguinte, retire a solução preparada de injeção (pDestTol2 -ubi-ASAP1 construção e Tol2 mRNA) do congelador a-80 ° C e coloque-o no gelo.
3. Puxe os divisores nas tanques de piscicultura e permitir que os peixes acasalar. Em geral, peixes depositam ovos dentro de 20-30 minutos depois de puxar para fora o divisor. Se não, espere 1-2 horas a mais. Alguns peixes não podem colocar ovos em tudo. Neste caso, repita este experimento para colheita de embriões de peixe.
4. Enquanto espera, certifique-se que existem agulhas preparadas com a ponta quebrada em um ângulo, criando uma borda chanfrada com fórceps, ou quebrando em um limpador de tarefa delicada.
   1. Puxe as agulhas de vidro capilar um puxador de micropipeta usando os seguintes parâmetros: aqueça 545; Puxe a 60; velocidade 80; tempo 250; pressão de 500. Quebre a agulha com pinça debaixo de um escopo de dissecação (com a parte do olho régua para estimativa de diâmetro), mantendo-se a pinça a um ângulo de aproximadamente 45 °. Diâmetros de agulha desejada podem ser variável dependendo das configurações de microinjector, mas menor diâmetro é preferível para diminuir a mortalidade do embrião.
5. Uma vez que os peixes têm ovos, recolhê-los em um diâmetro de 10 cm de Petri e trazê-los para o escopo de dissecação. Remover todos os embriões anormais e resíduos de peixe.
6. Pipetar os embriões fertilizados para a injeção de agarose preparado a 3% do molde. Remova o excesso de água para ajudar a manter os embriões no lugar.
7. Uma vez que todas as linhas estão cheios de embriões viáveis, organizá-los para que as células únicas todas enfrentam o mesmo sentido em direção a agulha, que é aproximadamente um ângulo de 45° na horizontal. Isto facilitará injeção muito mais tarde.
8. Usando luvas, usar uma pipeta de carregamento de 20 µ l ponta e retire o tubo no gelo 5 µ l de construção de preparado.
9. Introduza cuidadosamente a ponta na extremidade traseira do tubo capilar quebrado até onde começa a seringueiro, para obter o reagente mais perto da ponta. Se ainda existem bolhas de ar, agite a seringa, certificando-se de não quebrar a ponta.
10. Introduza a agulha direto para o suporte da agulha de microinjeção e aperte cuidadosamente até que a agulha permanece no lugar. Ajuste o ângulo de aproximadamente 45°.
11. Uma vez que a agulha é preparada e ligada, ligue o microscópio e gás tanque de pressão. Comercial CO₂ tanques são geralmente bons para essa finalidade. O volume de injeção é ajustado pela pressão de exploração e ejeção: aproximado de 0,5 psi para exploração e 30 psi para ejeção. Certifique-se de verificar que a solução vem quando pressionando o pedal.
12. Usando um micrômetro de palco com uma gota de óleo mineral, ajustar o volume e o fluxo da solução a ~ 150 µm de diâmetro (cerca de 2 nL). Certifique-se de que a pressão de retorno vai deixar uma pequena quantidade a escorrer para fora da agulha. Se não houver pressão suficiente, ação capilar causará líquido inserir a agulha e destruir o mRNA.
13. Uma vez que a agulha é calibrada, começam a injetar a construção para a única célula dos embriões fertilizados.
    Nota: Isto leva a uma grande quantidade de prática, paciência e sutileza, devido à membrana celular, sendo difícil de furar. É importante injectar a solução dentro da célula, não a gema, para a geração de zebrafish transgênico. Isso é diferente de Morpholinos injeção. Não importa de que lado a agulha entra na célula, enquanto a construção vai na célula. A transgênese terá uma taxa muito baixa de sucesso se injetado a gema ao invés da célula. Injeção de célula única fase também é importante, ou peixe Quimera somática será criado. Isso reduzirá a possibilidade do transgene entrando para as células germinativas.
14. Use a borda do gel de entalhe para fornecer um revestimento protetor que mantém o embrião no lugar e permite que a agulha aplicar pressão sem mover o embrião. Uma vez que a ponta da agulha na única célula, pressione o pedal para liberar a quantidade desejada de solução. Repita este processo para todos os embriões.
15. Quando concluído, transferi os embriões injetados num prato rotulado enxaguando-os fora do entalhe de agarose com sistema de água de peixes e uma pipeta de transferência descartável 3,4 mL. Armazene os embriões em uma incubadora de 28,5 ° C para deixá-los a desenvolver. Verifique volta ao longo do dia removendo embriões de peixe morto e substitua a água com azul de metileno 0,1% em água de peixe.
16. Cerca de 6-8 horas após a injeção, tome 10 indivíduo injetado embriões de peixe e preparar o DNA genômico de-los usando o método de Hotshot¹⁸.
17. Na manhã seguinte, use um microscópio de dissecação com uma fonte de luz de fluorescência para classificar para fora os embriões mostrando GFP nos tecidos não-gema. Estes embriões de peixe devem conter a construção injetada.
18. Realize o ensaio de impostos especiais de consumo Tol2 para verificar a atividade do transposon conforme descrito anteriormente,¹⁹. Se o plasmídeo excisado pode ser detectado, manter o injetado embriões de peixe e criá-los. Se nenhum plasmídeo excisado pode ser detectado, repita o processo de síntese e microinjeção de mRNA Tol2 até alcançar os resultados positivos do ensaio de impostos especiais de consumo do Tol2.

4. a criação de peixes transgênicos ASAP1, Tg (ubi: ASAP1)

1. Levante o peixe injetado (geração de₀ F) até a idade adulta, conforme descrito anteriormente no zebrafish livro²⁰. Isto geralmente leva cerca de 4 meses.
2. Tirar um único adulto F₀ peixe e cruzá-lo com um único oposto sexo sua peixe. Colete embriões de peixes após a criação no final do dia. Manter os embriões de peixes coletados na incubadora de 28,5 ° C em peixes de água com azul de metileno 0,1%.
3. No terceiro dia, verifique os embriões de peixes debaixo de um microscópio fluorescente dissecação com um filtro GFP. Resolver os embriões de peixe verde, se houver algum e criá-los até a idade adulta como F₁ geração transgénica peixe, Tg (ubi: ASAP1).
   Nota: Proporção mendeliana não é esperada uma vez que a maioria dos peixes₀ F parentais é quimeras genética germinal.
4. Cruze o único F₁ peixes adultos com peixes de sua e coletar embriões de peixes. Resolver os embriões de peixe verde e criá-los para a vida adulta como F₂ geração de peixe.
   Nota: Verde e embriões de peixe não-verde devem ser próximo de 1:1 se há um único transgene.
5. Para exibir as alterações de potenciais elétricas no tumor como tumores de bainha de nervo periférico maligno (MPNST), atravessar a geração de₂ F Tg (ubi: ASAP1) peixe com peixe rpl35^hi258/wt . Sabe-se que tumores visíveis começam a ser encontrados em 6-8 meses de idade adultos^21,22.

5. imaging

1. Que imagem zebrafish embriões tomar múltiplos fundador de geração F₂ peixes e cruzá-los com sua peixe pares individuais. Colete embriões de peixe em diferentes estádios de desenvolvimento desejados, de acordo com o zebrafish encenando guia²³.
2. Para os estágios iniciais dos embriões de peixes, descascar e retirar chorions dos embriões com cuidado, usando um par de pinças em um escopo de dissecação de um diâmetro de 10 cm Petri com sistema de água de peixes.
3. Transferi alguns embriões de peixe numa lâmina de vidro concaved com metilcelulose de 3%, utilizando uma pipeta de transferência descartável de 3,4 mL. Ajuste os embriões para as posições desejadas para visualizar a atividade celular de GFP usando uma agulha por baixo de um escopo de dissecação fluorescente.
4. Para as fases móveis de embriões de peixes (mais de 12 palco somite), use o mesilato de metanosulfonato de 0,05% para anestesiar os embriões de peixe antes de transferi-los para slides. Brevemente, embriões de peixes foram surgiu em 0.05% tricaina mesilato em água de peixe até que eles pararam de natação e equilíbrio do corpo de perda. Além disso, adicione uma gota de mesilato de tricaina 0,05% com a metilcelulose no slide.
5. Para menos de 12 embriões de peixe de estágio somite, use um microscópio composto de epi-fluorescência com uma câmera compatível e software para a imagem latente. Por mais de 12 embriões de peixe somite estágio, use um microscópio de fluorescência dissecação.
6. Tensão de célula de tumor de imagem, primeiro, identificar os peixes com tumores MPNST. Em seguida, anestesia o peixe com mesilato de metanosulfonato de 0,05%. Para toda montagem imagem, coloque o peixe em um prato de Petri de 10-cm de diâmetro. Para visualizar a atividade elétrica de células de tumor, tumores de peixe podem ser dissecados para fora após toda montagem imagem.

Results

Em uma injeção bem sucedida, mais do que embriões de peixe 50% injetado irão exibir algum grau de fluorescência verde nas células somáticas, e a maioria deles será positiva por meio de ensaio Tol2 transposon impostos especiais de consumo (Figura 2). Após 2-4 gerações de para fora-Cruz com sua peixes (até que o peixe fluorescente chegar a 50%, a proporção mendeliana esperada), os peixes transgênicos foram utilizados para o experimento de imagem para controlar ...

Discussion

Embora as atividades elétricas nível celular e tecidos durante o desenvolvimento embrionário e doença humana foram descobertas há muito tempo atrás, na vivo elétrica mudanças dinâmicas e seus papéis biológicos ainda permanecem em grande parte desconhecidos. Um dos maiores desafios é Visualizar e quantificar as alterações elétricas. Tecnologia de braçadeira do remendo é um quebra-through para acompanhamento de células únicas, mas sua aplicação aos embriões vertebrados é limitada, porque eles são compostos de muit...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de cultura de células de 14mL	VWR	60818-725 Tanque de
eletroforese de agarose	Thermo Scientific	Owl B2	DNA eletroforese
Agarose RA	Amresco	N605-500G	Para fazer os géis de injeção
Attb1-ASAP1-F primer	IDT DNA	GGGGACAAGTTTGTACAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA	Amplificação da região codificante ASAP1 para subclonagem
Attb2-ASAP1-R primer	IDT DNA	GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA	Amplificação da região codificadora ASAP1 para subclonagem
Escopo de dissecção de campo claro	Nikon	SMZ 745	Descorionação, microinjeção, montagem
Câmera colorida	Zeiss	AxioCam MRc	Embrião de peixe
Lâmina côncava	VWR	48336-001	Para segurar embriões de peixe durante o processo de imagem
Pipeta de transferência descartável 3,4 ml	Thermo Scientific	13-711-9AM	Embriões de peixe e transferência de água
Enzima endonuclease, não I	NEB	R0189L	Para plasmídeo linearizante DNA
Escopo composto epifuorescent	Zeiss	Axio Imager.A2	Fish imagem embrionária
Escopo de dissecção estéreo epifuorescent	Zeiss	Stereo Discovery.V12	Imagem embrionária de peixe
Fonte de luz fluorescente Dinâmica	lúmen	X-cite seris 120	Fonte de luz para microscópios de fluorescência
Fórceps #5	WPI	500342	Decorionação e quebra de agulha
Gateway BP Clonase II Mistura enzimática	Thermo Scientific	11789020	Clonagem de recombinação Gateway BP
Gateway LR Clonase II Plus enzima	Thermo Scientific	12538120	Clonagem de recombinação Gateway LR
Kit de recuperação de DNA em gel	Zymo Research	D4002	Purificação de gel de DNA
Ponta de carregamento	Eppendorf	930001007	Para carregar solução de injeção em agulhas capilares
Metilcelulose (1600cPs)	Alfa Aesar	43146	Montagem de embriões de peixe
Azul de metileno	Sigma-Aldrich	M9140	Suprime surtos de fungos em placas de Petri
Molde de microinjeção	Ferramentas de ciência adaptativa	TU-1	Para preparar a bandeja de molde de agaorse para segurar embriões de peixe durante a injeção
Microinjetor	WPI	Pneumático Picopump PV820	Injetor de microinjeção
Micro-manipulador	WPI	Microinjetor MM3301R	Operação de
microinjeção Extrator de micropipeta	Instrumento	Sutter P-1000	Para preparar agulha capilar
Óleo mineral	Amresco	J217-500ml	Para calibrar o volume de injeção
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcrição	Thermo Scientific	AM1340	mRNA transcrição in vitro
Câmera monocolor	Zeiss	AxioCam MRm	Gravação de imagens de embriões de peixes
Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4020	Preparar pequena quantidade de DNA plasmidial
Placas de Petri de plástico	VWR	25384-088	Para segurar peixes ou embriões de peixes durante o processo de imagem
RNA Clean & Concentrador-5	Zymo Research	R1015	mRNA limpeza após transcrição in vitro
Espectrofotômetro	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Para medir as concentrações de DNA e RNA
Micrômetro de estágio	Am Scope	MR100	Calibração de volume de microinjeção
Termociclador	Bio-Rad	T100	Amplificação de DNA para clonagem de genes
Parede fina capilares de vidro	WPI	TW100F-4	Vidro cru para fazer agulha cappilar
Tol2-exL1 primer	IDT DNA	GCACAACACCAGAAATGCCCTC	Tol2 ensaio de consumo Tol2-exR
primer	IDT DNA	ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG	Tol2 ensaio de consumo
TOP10 E. coli quimicamente competente	Thermo Scientific	C404006	Usado para transformação durante a clonagem de genes
Mesilato de tricaína	Sigma-Aldrich	A5040	Para anestesiar peixes ou embriões de peixes
Trans-iluminador UV 302nm	UVP	M-20V	Visualização de DNA
	Thermo Scientific	2853	Para processo de transformação de clonagem de genes